CN109097350B

CN109097350B - 一种油楠倍半萜合成酶SgSTPS2及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN109097350B
Application number: CN201811015036.1A
Authority: CN
Inventors: 余纽; 杨锦昌; 李荣生; 尹光天; 邹文涛; 何畅
Original assignee: Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN109097350A

Abstract

本发明公开了一种油楠倍半萜合成酶SgSTPS2及其编码基因和应用。本发明提供了一种新的倍半萜合成酶——油楠倍半萜合成酶SgSTPS2及其编码基因，该蛋白在原核表达后可生成活性的倍半萜合成酶，催化法呢基焦磷酸(FPP)或牻牛儿基焦磷酸(GPP)生成多种倍半萜类或单萜类化合物，可用于其大量生产。

Description

一种油楠倍半萜合成酶SgSTPS2及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种油楠倍半萜合成酶SgSTPS2及其编码基因和应用。

背景技术

油楠(Sindora glabra Merr.ex de Wit)隶属于苏木科油楠属，原生分布于我国海南省，为热带和南亚热带高大乔木，是国家二级重点保护野生植物。油楠最重要的特征是其树干木质部受损后可分泌出树脂油，其可燃性与柴油相似，故又称“柴油树”，在油用、药用、观赏和材用等方面具有较广阔的开发利用前景。

油楠树脂油成分主要包括倍半萜类，约占70％以上，以及二萜类，约14％以上。油楠油亦含活性成分α-紫穗槐烯、荜澄茄油烯、α-蛇麻烯、环苜蓿烯等，进一步，油楠油亦含有挥发性成分大牻牛儿烯、α-香橙烯、δ-杜松醇、α-檀香醇和α-依兰油烯等代表香气的主要成分，在开发精油方面展现了巨大的开发潜力。倍半萜类化合物是天然药物化学中研究较为活跃的领域之一，具有抗肿瘤、抑菌等活性。然而，关于油楠中萜类合成酶的生物合成基因还未被分离和鉴定。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2及其编码基因和应用。

本发明的第一个目的是提供一种油楠倍半萜合成酶SgSTPS2，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供所述的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2的编码基因。

优选，所述的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选，所述的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

与所述的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2氨基酸具有50％以上相似性的序列，或与其具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物，例如，将氨基酸序列经过一个或多个取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列也属于本发明的保护范围。与所述的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2的编码基因的核苷酸序列具有50％以上相似性的序列也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种含有所述的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2的编码基因的重组表达载体。

所述的表达载体，优选为表达载体pET-30a。

本发明还提供一种含有所述的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2的编码基因的基因工程菌。

所述的基因工程菌，优选为大肠杆菌Top10或大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供所述的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2在制备榄香烯(Elemene isomer)、α-可巴烯(α-Copaene)、β-榄香烯(β-Elemene)、衣兰烯(Ylangene)、β-可巴烯(β-Copaene)、异大香叶烯D(Isogermacrene D)、γ-杜松烯(γ-Cadinene)、γ-衣兰油烯(γ-Muurolene)、大牛儿烯D(Germacrene D)、双环牛儿烯(Bicyclogermacrene)、紫穗槐烯(γ-Amorphene)和/或荜澄茄烯(Cadina-1(10),4-diene)中的应用。

优选，所述的应用，是以法呢基焦磷酸(FPP)为底物，经油楠倍半萜合成酶SgSTPS2催化产生榄香烯(Elemene isomer)、α-可巴烯(α-Copaene)、β-榄香烯(β-Elemene)、衣兰烯(Ylangene)、β-可巴烯(β-Copaene)、异大香叶烯D(Isogermacrene D)、γ-杜松烯(γ-Cadinene)、γ-衣兰油烯(γ-Muurolene)、大牛儿烯D(Germacrene D)、双环牛儿烯(Bicyclogermacrene)、紫穗槐烯(γ-Amorphene)和/或荜澄茄烯(Cadina-1(10),4-diene)。

本发明的第四个目的是提供所述的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2在制备芳樟醇(Linalool)、牻牛儿基甲醚(Geranyl methyl ether)和/或香叶醇(Geraniol)中的应用。

优选，所述的应用，是以牻牛儿基焦磷酸(GPP)为底物，经油楠倍半萜合成酶SgSTPS2催化产生芳樟醇(Linalool)、牻牛儿基甲醚(Geranyl methyl ether)和/或香叶醇(Geraniol)。

本发明提供了一种新的倍半萜合成酶——油楠倍半萜合成酶SgSTPS2及其编码基因，该蛋白在原核表达后可生成活性的倍半萜合成酶，催化法呢基焦磷酸(FPP)或牻牛儿基焦磷酸(GPP)生成多种倍半萜类或单萜类化合物，可用于其大量生产。

附图说明

图1是目的基因PCR片段。

图2是目的基因菌落PCR电泳图。

图3是目的蛋白SgSTPS2的SDS-PAGE检测。

图4是SDS-PAGE分析目的蛋白SgSTPS2上清纯化结果。

图5是目的蛋白SgSTPS2的SDS-PAGE和Western-blot检测。

图6是GC-MS检测图谱。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1

1、克隆油楠倍半萜合成酶基因SgSTPS2，构建克隆载体及转化原核细胞

提取油楠茎部组织的RNA，采用逆转录酶M-MLV，逆转录反应合成的cDNA。以该cDNA为模板，正向引物为：5'-ATGTCGGTTGCAGCTTTAGC-3'，反向引物为：5'-TCATGCGACAGGATTTATGA-3'，利用TakaRa公司Ex Taq DNA聚合酶，进行PCR扩增；PCR条件为：：94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃1min30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，图1的M为DNA marker DL2000，目的基因SgSTPS2片段大小约为1700bp，符合预期。

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目的基因片段，将目的片段进行TA克隆，连接到载体Pmd-18TA克隆载体中，然后将其转化到大肠杆菌Top10克隆菌株中，转化条件为：在200μL感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻混匀后冰浴30min；迅速放入42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2min；加入800μL LB培养基，37℃慢摇培养1h；将菌液6000rpm离心2min，弃600μL上清，悬浮菌体，涂布于含有抗生素(Amp)的LB平板上，37℃倒置暗培养12～16h。采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，筛选方法为：从转化平板上随机挑取单菌落，置于1.5mL离心管中的液体培养基中培养。将每管进行编号，各管取1μL用作模板进行PCR检测，剩余培养物保存于4℃，检测为阳性的菌落于平板或甘油管保存备用。PCR反应体系为：1μL菌液，正向引物5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'，反向引物5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'，1x Buffer，0.25mM dNTP mixture，0.5μL Ex Taq DNA聚合酶，混合后进行PCR扩增。PCR程序为：94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃1min30s，35个循环；72℃延伸10min。菌落PCR结果如图2所示，图2的M为DNA marker DL2000，4-8号为阳性菌。挑选阳性单克隆菌落，提取质粒后送交测序。经测序分析，克隆得到的倍半萜合成酶基因SgSTPS2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有1674个碱基，编码的蛋白命名为倍半萜合成酶SgSTPS2，共557个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。并由此得到将倍半萜合成酶基因SgSTPS2插入到Pmd-18克隆载体的重组质粒成功转化至原核细胞大肠杆菌Top10的阳性菌，命名为Top10-SgSTPS2。

2、倍半萜合成酶基因SgSTPS2密码子优化和全基因合成、构建表达载体及转化原核细胞

采用密码子优化软件对SgSTPS2蛋白氨基酸序列进行优化，优化后其编码基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。采用全基因合成方法合成密码子优化后的倍半萜合成酶基因SgSTPS2全长序列。通过限制性酶切位点Nde I和Hind III对优化的SgSTPS2基因和质粒pET30a分别进行双酶切，酶切体系为：Nde I和Hind III各1μL，基因浓度为0.3μg，质粒浓度为1μg，加入灭菌的双蒸水至30μL，酶切时间为1h。酶切后利用核酸纯化回收试剂盒纯化回收得到经过双酶切的优化的SgSTPS2基因片段和pET30a载体。将酶切后的优化的SgSTPS2基因片段连接至酶切后的表达载体pET30a中，连接反应条件为：优化的SgSTPS2基因和pET30a质粒(摩尔比为3:1)、1x连接Buffer，T4DNA连接酶，混合后，15℃放置16h完成连接反应，获得重组质粒(优化的SgSTPS2基因插入到表达载体pET30a后的重组质粒)。然后将其转化到大肠杆菌Top10和大肠杆菌BL21(DE3)克隆菌株中。挑取抗生素(kan)筛选得到的阳性菌落，提取质粒，通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，由此得到将优化的倍半萜合成酶基因SgSTPS2插入到pET30a表达载体的重组质粒成功转化至原核细胞的阳性菌，命名为Top10-SgSTPS2(2)和BL21-SgSTPS2。将构建好的BL21-SgSTPS2菌进行大量培养，首先挑取单克隆BL21-SgSTPS2，接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，37℃，200rpm，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.1mM IPTG，之后分别置于15℃和37℃诱导表达，得到大量表达倍半萜合成酶SgSTPS2的菌液。

3、油楠倍半萜合成酶SgSTPS2的原核表达、蛋白纯化和蛋白质检

取诱导后大量表达倍半萜合成酶SgSTPS2的培养液，12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。结果见图3，图3的M为蛋白marker，Lane 0为对照，Lane 1为15℃诱导16h，Lane 2为37℃诱导16h，箭头所指为目的蛋白SgSTPS2。

按上述方法，放大培养3L的表达菌，生长至OD600＝0.8时，加终浓度0.1mM IPTG，15℃诱导16h后收集菌体。全菌采用50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，50mM Imidazole含1％Triton X-100，1mM DTT，1mM PMSF超声裂解，同时以50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，50mMImidazole缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。分析结果见图4，图4的M为蛋白marker，Lane 1为全菌破菌离心后上清，Lane 2为上清同Ni-IDA孵育后流出液，Lane 3-4为100mMImidazole的洗脱组分，Lane 5-11为300mM Imidazole的洗脱组分，箭头所指为目的蛋白。

经Ni-IDA亲和层析纯化，收集纯度浓度较好的Lane 9-10，并将其透析到1×PBS，10％Glycerol，pH7.4透析结束后用0.22μm膜过滤，并分装冻于-80℃。蛋白溶度用BSA做标准品，采用Bradford法测定蛋白浓度。油楠倍半萜合成酶SgSTPS2的蛋白Western-blot检测实验操作流程参考《蛋白质电泳实验技术》郭尧君著，结果请见图5，左图中Lane M₁为SDS-PAGE蛋白Marker，Lane 1为BSA蛋白，Lane 2为SgSTPS2蛋白；右图中Lane M₂为Western-blot Marker，抗体为Anti-His。

4、SgSTPS2的生化功能

以法呢基焦磷酸(FPP)或牻牛儿基焦磷酸(GPP)为底物，酶促反应体系为：25mMTris-HCI(pH7.4)，5mM二硫苏糖醇(DTT)，100mM氯化钾，5mM氯化镁，10％甘油，底物浓度为50μM，加入50μg纯化后的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2蛋白，置于37℃反应1h。反应结束后，用固相微萃取SPME纤维PDMS 100μm顶空萃取挥发物质30min，250℃解吸3min进样。采用GC-MS联用仪(Agilent GC-MS 7890B-5977A)对催化产物进行检测。气相色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm)，载气高纯He流速为1.0mL/min，升温程序为：50℃保持1min，以5℃/min速度升温至80℃，保持1min，再以10℃/min速度升温至220℃，保持10min，进样口温度为250℃，离子源EI 70eV温度为230℃，接口温度为250℃，采集质量范围为30-200amu，数据经NIST 14质谱谱库检索，并与标准谱图对照，鉴定各组分峰。样品总离子流图见图6，以FPP为底物时，在保留时间为15.26、15.84、16.04、16.47、16.61、16.81、16.94、17.06、17.34、17.51、17.54和17.79处分别出现峰，经NIST 14数据检索谱库检索比对，结果显示分别对应的化合物为榄香烯(Elemene isomer)、α-可巴烯(α-Copaene)、β-榄香烯(β-Elemene)、衣兰烯(Ylangene)、β-可巴烯(β-Copaene)、异大香叶烯D(Isogermacrene D)、γ-杜松烯(γ-Cadinene)、γ-衣兰油烯(γ-Muurolene)、大牛儿烯D(Germacrene D)、双环牛儿烯(Bicyclogermacrene)、紫穗槐烯(γ-Amorphene)、荜澄茄烯(Cadina-1(10),4-diene)，如图6所示。以GPP为底物时，在保留时间为10.98、13.41和13.87处出现峰，经NIST 14数据检索谱库检索比对，结果显示分别对应的化合物为芳樟醇(Linalool)、牻牛儿基甲醚(Geranyl methyl ether)、香叶醇(Geraniol)，如图6所示。由此表明油楠倍半萜合成酶SgSTPS2为多功能酶，可催化FPP合成12种倍半萜类化合物，并可催化GPP合成3种单萜类化合物。

序列表

<110> 中国林业科学研究院热带林业研究所

<120> 一种油楠倍半萜合成酶SgSTPS2及其编码基因和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1674

<212> DNA

<213> 油楠(Sindora glabra Merr．ex de Wit)

<400> 1

atgtcggttg cagctttagc aattcctact tccacacctt catcagatgt ccctcgtcgc 60

tctgcaaatt atcatcctag cgtttgggga gatcatttcc tcaaatatgc ttctcagcct 120

ttggaagtag atgagagaat ggaggaccat attggaacat tgaaagaaac tgtgaagaaa 180

atgcttgttc cagccactga caagccttta acaaaagtta aattgattga ttcaatccaa 240

cgtttgggtg tgtactatca ttttgaaagt gagattgatg aagtgctctg tcacattcag 300

aagaactatg taaagaatgg tataataact ctcgatgagg atctccattc tatgtctctt 360

ctctttaggt tattgaggca gcaaggatac catgtttcac ccggtgtgtt caacaagttc 420

aaggatgagc aaggaaaaat cagtgaaaca attgccaacg acattgaggg aatgctaagc 480

ttatatgaag ctgcacatct caggattcag ggagaagaca tattagatga agcacttgat 540

tttacttcca ctcatcttaa gtctttaacc acccaattga gtggttccct tgcaggagaa 600

gtcattcgaa gcttaaagcg gcctctccac aggaggcttc ctagacttga ggcatggaac 660

tacttttcta cttaccagga agatccttcg cacgataaaa ctttactgac ctttgcaaag 720

ttagatttca ataggttgca aaagttacat cagaaggaag tcggaaaact ctcaaagtgg 780

tggaaggatt tagattttgc tacaaagcta ccttttgcgc gcaataggtt ggtggaggct 840

tatttttgga tattaggagt gtatttcgag ccttgctact cgcttgctag gcagatattg 900

accaaagtga tatcattgac atcagttgtt gatgatatat atgatgtgta tggtacactt 960

gaggagctac aacttctcac cgaagcaatc gacaggtggg acatctcttg catggacatt 1020

cttccagagt acatgaagct tatttatcaa gcactcttgg atgtttatga tgaaattgaa 1080

cgacaggcag ctaaagaagg aagagctttc tgtgtaaatt atggaaaaga agaaatgaga 1140

agactggttc gagcttactt ggctgaagcc aaatggttcc acaacaacta tacaccagca 1200

ttcgaggagt atatggaagt tgcacaagta tcttctgctt atcgtatgct tacaacagta 1260

tccttcattg gcatgggatc catagctact gaggaggcct tcaaatggat taccaaaaat 1320

ccgaaaattg ttaaagcttc cctagttatt tgcagactca tggacgacat tgtttccggc 1380

aagtttgagc aagagagagg gcatgttgtt tcagctctgg aatgctacat gaagcaaaat 1440

ggtgcaacag aagaagaaac cattgttgaa ttttgtaggc gagttgaaaa tgcttggaag 1500

gatataaacg aggattgcct tcaacctttc gaagtgccaa agcctctgtt gatgcgaagt 1560

ctgaacttgt cgcgcgtaat ttatcttctt tatatggatg atgatagcta cactcattct 1620

tctggaaaca caaagaagaa cattgaagcc ttgctcataa atcctgtcgc atga 1674

<210> 2

<211> 557

<212> PRT

<213> 油楠(Sindora glabra Merr．ex de Wit)

<400> 2

Met Ser Val Ala Ala Leu Ala Ile Pro Thr Ser Thr Pro Ser Ser Asp

1 5 10 15

Val Pro Arg Arg Ser Ala Asn Tyr His Pro Ser Val Trp Gly Asp His

20 25 30

Phe Leu Lys Tyr Ala Ser Gln Pro Leu Glu Val Asp Glu Arg Met Glu

35 40 45

Asp His Ile Gly Thr Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Met Leu Val Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Lys Pro Leu Thr Lys Val Lys Leu Ile Asp Ser Ile Gln

65 70 75 80

Arg Leu Gly Val Tyr Tyr His Phe Glu Ser Glu Ile Asp Glu Val Leu

85 90 95

Cys His Ile Gln Lys Asn Tyr Val Lys Asn Gly Ile Ile Thr Leu Asp

100 105 110

Glu Asp Leu His Ser Met Ser Leu Leu Phe Arg Leu Leu Arg Gln Gln

115 120 125

Gly Tyr His Val Ser Pro Gly Val Phe Asn Lys Phe Lys Asp Glu Gln

130 135 140

Gly Lys Ile Ser Glu Thr Ile Ala Asn Asp Ile Glu Gly Met Leu Ser

145 150 155 160

Leu Tyr Glu Ala Ala His Leu Arg Ile Gln Gly Glu Asp Ile Leu Asp

165 170 175

Glu Ala Leu Asp Phe Thr Ser Thr His Leu Lys Ser Leu Thr Thr Gln

180 185 190

Leu Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Val Ile Arg Ser Leu Lys Arg Pro

195 200 205

Leu His Arg Arg Leu Pro Arg Leu Glu Ala Trp Asn Tyr Phe Ser Thr

210 215 220

Tyr Gln Glu Asp Pro Ser His Asp Lys Thr Leu Leu Thr Phe Ala Lys

225 230 235 240

Leu Asp Phe Asn Arg Leu Gln Lys Leu His Gln Lys Glu Val Gly Lys

245 250 255

Leu Ser Lys Trp Trp Lys Asp Leu Asp Phe Ala Thr Lys Leu Pro Phe

260 265 270

Ala Arg Asn Arg Leu Val Glu Ala Tyr Phe Trp Ile Leu Gly Val Tyr

275 280 285

Phe Glu Pro Cys Tyr Ser Leu Ala Arg Gln Ile Leu Thr Lys Val Ile

290 295 300

Ser Leu Thr Ser Val Val Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu

305 310 315 320

Glu Glu Leu Gln Leu Leu Thr Glu Ala Ile Asp Arg Trp Asp Ile Ser

325 330 335

Cys Met Asp Ile Leu Pro Glu Tyr Met Lys Leu Ile Tyr Gln Ala Leu

340 345 350

Leu Asp Val Tyr Asp Glu Ile Glu Arg Gln Ala Ala Lys Glu Gly Arg

355 360 365

Ala Phe Cys Val Asn Tyr Gly Lys Glu Glu Met Arg Arg Leu Val Arg

370 375 380

Ala Tyr Leu Ala Glu Ala Lys Trp Phe His Asn Asn Tyr Thr Pro Ala

385 390 395 400

Phe Glu Glu Tyr Met Glu Val Ala Gln Val Ser Ser Ala Tyr Arg Met

405 410 415

Leu Thr Thr Val Ser Phe Ile Gly Met Gly Ser Ile Ala Thr Glu Glu

420 425 430

Ala Phe Lys Trp Ile Thr Lys Asn Pro Lys Ile Val Lys Ala Ser Leu

435 440 445

Val Ile Cys Arg Leu Met Asp Asp Ile Val Ser Gly Lys Phe Glu Gln

450 455 460

Glu Arg Gly His Val Val Ser Ala Leu Glu Cys Tyr Met Lys Gln Asn

465 470 475 480

Gly Ala Thr Glu Glu Glu Thr Ile Val Glu Phe Cys Arg Arg Val Glu

485 490 495

Asn Ala Trp Lys Asp Ile Asn Glu Asp Cys Leu Gln Pro Phe Glu Val

500 505 510

Pro Lys Pro Leu Leu Met Arg Ser Leu Asn Leu Ser Arg Val Ile Tyr

515 520 525

Leu Leu Tyr Met Asp Asp Asp Ser Tyr Thr His Ser Ser Gly Asn Thr

530 535 540

Lys Lys Asn Ile Glu Ala Leu Leu Ile Asn Pro Val Ala

545 550 555

<210> 3

<211> 1674

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagcgttg cggcactggc aattccgacc agtaccccgt cttctgatgt tccgcgtcgt 60

agcgcaaact atcatccgtc tgtctggggc gatcatttcc tgaaatacgc aagtcaaccg 120

ctggaagttg acgaacgtat ggaagatcac atcggcaccc tgaaagagac cgtcaaaaag 180

atgctggttc cggcaaccga caaaccgctg accaaagtca aactgatcga tagcatccag 240

cgtctgggcg tttattacca cttcgagagc gaaatcgacg aagtcctgtg ccacatccag 300

aaaaactacg tcaaaaacgg catcattacc ctggacgaag atctgcatag catgagtctg 360

ctgtttcgtc tgctgcgtca acaaggttat cacgttagtc cgggcgtctt caacaaattc 420

aaagacgagc agggcaaaat cagcgagacc attgcgaacg acatcgaagg tatgctgagc 480

ctgtacgaag cagcacatct gcgtatccaa ggcgaagata tcctggacga agcactggat 540

tttaccagca cccatctgaa aagcctgacc acccaactgt ctggtagtct ggcaggcgaa 600

gttattcgta gtctgaaacg tccgctgcat cgtcgtctgc cgcgtctgga agcgtggaac 660

tacttcagca cctaccagga agatccgagt cacgacaaaa ccctgctgac ctttgcgaaa 720

ctggatttca accgcctgca gaaactgcat cagaaagagg tcggcaaact gtccaaatgg 780

tggaaagacc tggactttgc gaccaaactg ccgtttgcac gtaaccgtct ggttgaagcg 840

tacttttgga tcctgggcgt ttacttcgaa ccgtgttata gcctggcccg tcagattctg 900

accaaagtta tcagcctgac cagcgttgtt gacgatatct acgacgttta cggtaccctg 960

gaagaactgc aactgctgac cgaagcaatc gatcgttggg atatcagctg catggacatc 1020

ctgccggaat acatgaaact gatctatcag gcgctgctgg acgtatacga cgaaattgaa 1080

cgtcaggcgg cgaaagaagg tcgcgcgttt tgcgttaatt acggcaaaga agaaatgcgt 1140

cgtctggttc gcgcatatct ggccgaagcg aaatggttcc acaacaacta taccccggcg 1200

tttgaagaat atatggaagt tgcgcaggtt agttccgcat atcgtatgct gaccaccgtt 1260

tccttcattg gcatgggtag cattgcgacc gaagaagcct tcaaatggat caccaaaaac 1320

ccgaaaatcg tcaaagcaag tctggttatt tgccgtctga tggacgacat cgtctccggc 1380

aaattcgaac aggaacgcgg tcacgttgtt tctgcactgg aatgttacat gaaacagaac 1440

ggcgcgaccg aagaagaaac catcgtcgaa ttttgccgtc gcgttgaaaa cgcctggaaa 1500

gacatcaacg aggactgtct gcagccgttt gaagttccga aaccgctgct gatgcgtagt 1560

ctgaatctga gtcgcgtcat ctacctgctg tacatggacg acgatagcta tacccatagc 1620

agcggcaaca ccaaaaagaa catcgaggcg ctgctgatca atccggttgc ataa 1674

Claims

1.一种油楠倍半萜合成酶SgSTPS2在以法呢基焦磷酸为底物制备β-榄香烯、衣兰烯、β-可巴烯、异大香叶烯D、γ-杜松烯、γ-衣兰油烯、大牛儿烯D、双环牛儿烯、紫穗槐烯和荜澄茄烯中的应用；其中，所述油楠倍半萜合成酶SgSTPS2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的油楠倍半萜合成酶SgSTPS2在以牻牛儿基焦磷酸为底物制备芳樟醇、牻牛儿基甲醚和香叶醇中的应用。