CN110574685B - 一种无忧花的无菌苗诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及无忧花培养技术领域，具体涉及一种无忧花的无菌苗诱导方法。本发明的无菌苗诱导方法采用临近成熟期自然授粉形成的胚进行胚培养从而获得无菌苗，为无忧花完整的组培快繁技术体系的建立提供了方法和依据。针对无忧花的自身特点，首先确定采种时间是关键环节。采集临近成熟期、未开裂的中国无忧花果荚，剥开果荚选取健康的种子作为消毒材料并在无菌条件下剥取幼胚进行培养，消毒成功率可达90％以上；根据无忧花组织材料容易褐化、不易诱导的特点，通过对果荚的低温处理，可以减少褐化、促进幼胚萌发；在培养基中添加抗氧化剂并对其种类选取、使用量、使用方法进行优化和改良，以获得褐化率更低、成苗率更高的组培苗。
Description
【技术领域】
本发明涉及无忧花培养技术领域，具体涉及一种无忧花的无菌苗诱导方法。
【背景技术】
无忧花，指中国无忧花(学名：Saraca dives Pierre)，又名火焰花。为常绿乔木，枝叶浓密，花大而色红，盛开时远望如团团火焰，是一种极有园林开发应用前景的植物；然而由于无忧花数量稀少，而且无忧花雄蕊无花粉，不容易结果不容易取到种子，目前，无忧花的繁殖可采用播种、扦插和高空压条等方法，其中播种是最常用的繁殖方法。但据报道，在广州及邻近地区种植的无忧花，虽然生长良好，能够开花结果，但由于在荚果成熟期受到荔枝异形小卷蛾Cryptophlebia ombrodelta Lower严重危害，几乎连年采收不到健康种子，严重影响了中国无忧花的推广应用。在实际育苗实践中，也遇到发芽率低、种子被害虫和菌类危害严重的现象。因此，通过植物组织培养的技术可能是破解中国无忧花种苗规模化繁育的有效途径，目前尚无相关研究的文献报道。在现有技术的中国专利CN 108323425A《一种四季无忧花的扦插繁殖方法》中也提到，目前无忧花的组培繁殖仍比较困难，而且处于难实现组培繁殖的情况。
在实际的组织培养技术研究中发现，与大多数木本植物类似，利用中国无忧花茎段作为外植体，存在比较严重的褐化问题，不容易诱导无菌芽。利用中国无忧花的种子进行无菌播种，同样存在褐化现象，发芽困难。同时，由于其种子较大，长宽约为4.1cm×2.5cm，不便组培操作。而其胚胚近锥状，长0.4-0.6cm，比较容易处理。因此，结合中国无忧花在种子发育过程中容易受到病虫害侵染等情况，利用组培快繁技术进行种苗的标准化繁育非常必要。而解决外植体的消毒、无菌苗的诱导和木本植物组培过程中易于出现的褐化等问题是其中的关键环节，这对整个组培体系的建立具有至关重要的作用。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种无忧花的无菌苗诱导方法。本发明诱导方法可对无忧花进行组培，有效降低无忧花组培过程中的褐变率，提高无忧花组培苗的成苗率。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种无忧花无菌苗的诱导培养基，所述培养基包含水解酪蛋白和抗氧化剂。
进一步的，所述抗氧化剂为聚乙烯吡咯烷酮和/或改性活性炭。
进一步的，所述改性活性炭的改性方法为：将核桃壳和龙眼壳按照质量比为1:2混合，进行粉碎后过100目筛，然后浸渍于1-2mol/L的盐酸溶液或1-2mol/L的磷酸溶液中1-2h，过滤后放在明火中烘烤，直至把粉末烤黑，冷却后用1-2mol/L的氢氧化钠溶液中和洗去酸液，再采用清水漂洗后干燥得到所述改性活性炭。
进一步的，所述诱导培养基包括用于幼胚的诱导培养基I和用于从胚上分离的幼嫩茎段的诱导培养基II。
进一步的，所述诱导培养基I的含量如下：1/2MS0+IAA 0.5-1.0mg/L+GA3 0.5-3.0mg/L+水解酪蛋白500mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0-7.0g/L，pH5.8-6.2。
进一步的，所述诱导培养基II的含量如下：MS+6-BA 0.5-3.0mg/L+NAA 0.2-1.0mg/L+水解酪蛋白500mg/L+改性活性炭1000mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉6.0-7.0g/L，pH5.8-6.2。
本发明还包括一种应用诱导培养基进行无忧花无菌诱导方法，所述方法包括如下步骤：
(1)果荚的采集和处理：在种子完全成熟前，约6月中下旬，采摘未开裂、饱满、无病虫害的中国无忧花果荚；
(2)低温处理：将步骤(1)中获得的果荚放置于5℃冰箱内冷藏4-7d，备用；
(3)种子的消毒：剥开果荚，选取颗粒光滑、相对饱满的种子，在超净工作台上，用消毒液对种子进行消毒处理；
(4)胚的剥离：在超净工作台上，用无菌手术刀片沿着种子表面的两片子叶的连接处轻轻插入，并将种子分为两部分，优选受损伤较小、外观较为完整的胚，将暴露的胚用消毒过的镊子轻轻转入诱导培养基I中；
(5)胚的萌发：将步骤(4)中完成接种的培养基置于培养室中进行培养，前两周用黑布覆盖进行暗培养，两周后去掉黑布，可观察到胚膨大，4周后可观察到胚芽端明显伸长；培养温度为25±2℃，光照强度800-1500lx，每天光照12-14h；
(6)无菌苗的获得：接种4周后，胚芽端伸长达到1-3cm，在超净工作台上将幼嫩的茎段从膨大的胚上分离，去除基部褐色组织，转入诱导培养基Ⅱ中，培养4-6周后可获得长势良好的无菌苗，可用于后期的种苗扩繁和生根等操作，培养室的培养程序、温度、光照强度和光照时间与步骤(5)相同。
进一步的，所述步骤(3)的消毒液消毒处理方法为：将种子浸泡在消毒液Ⅰ中15-20min；取出后放入消毒液Ⅱ中浸泡30s；取出后用无菌水冲洗3-5次。
进一步的，所述消毒液Ⅰ为质量百分数为0.1％的HgCl2和0.01％的吐温-80溶液混合液；消毒液Ⅱ为体积百分数为75％的乙醇溶液。
本申请所用的诱导培养基I中各成分如下：
MS0为MS0培养基；IAA为生长素；GA3为赤霉素。
本申请所用的诱导培养基Ⅱ中各成分如下：
MS为MS培养基；6-BA为6-苄氨基嘌呤；NAA为萘乙酸。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明采用临近成熟期自然授粉形成的胚进行胚培养，从而成功获得无菌芽，为中国无忧花完整的组培快繁技术体系的建立提供了方法和依据；本申请选用邻近成熟期的种子非常关键，因为成熟的果实会发生脱水、干燥、果荚开裂，内部的种子在果实发育后期更容易遭受病虫害的侵袭，这也可能是中国无忧花种子病虫害多发的原因之一。因此中国无忧花果实的自然成熟期为7月中旬至8月初，本技术中的果实采集时间为6月中下旬。
2、本发明的无忧花无菌苗获取方法主要是通过采集临近成熟期、未开裂的中国无忧花果荚，并在无菌条件下剥取幼胚进行培养，而非直接利用幼胚进行消毒；消毒程序和方式的改进，显著降低了污染率和消毒剂对幼胚的伤害，消毒成功率可以达到90％以上；
3、为了降低褐变率，根据无忧花胚鲜嫩不易诱导组培的特点，除了对种子进行低温处理，发明人通过改进抗氧化剂的使用量、使用方法和使用步骤，以获得褐化率更低的组培苗；对于幼胚，使用低剂量的PVP为抗氧化剂，即降低了对幼胚的伤害，还能有效起到抗氧化作用；针对发育较完善的幼嫩茎段可能PVP已经不能满足其抗氧化的需求，申请人在研究过程中发现使用改性后的活性炭吸附，能有效改善茎段的抗氧化问题，降低褐变率。
4、本发明中采用核桃粉和龙眼壳粉替代常规活性炭的原料，该成分经过改性后，含有更强的抗氧化性能，而且相对普通活性炭对幼胚的危害作用更小，至于为何能产生更强的抗氧化性，目前申请人还在进一步研究，初步估计可能是因为碳化后核桃粉和龙眼壳粉中产生某种有效活性成分，能提高培养基的抗氧化性能。
【具体实施方式】
下面将结合具体实施例来对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种无忧花无菌诱导方法，所述方法包括如下步骤：
(1)果荚的采集和处理：在种子完全成熟前，约6月中下旬，采摘未开裂、饱满、无病虫害的中国无忧花果荚；
(2)低温处理：将步骤(1)中获得的果荚放置于5℃冰箱内冷藏4d，备用；
(3)种子的消毒：剥开果荚，选取颗粒光滑、相对饱满的种子，在超净工作台上，用消毒液对种子进行消毒处理；其中，消毒液消毒处理方法为：将种子浸泡在消毒液Ⅰ中15min；取出后放入消毒液Ⅱ中浸泡30s；取出后用无菌水冲洗3次。其中，消毒液Ⅰ为质量百分数为0.1％的HgCl2和0.01％的吐温-80溶液混合液；消毒液Ⅱ为体积百分数为75％的乙醇溶液；
(4)胚的剥离：在超净工作台上，用无菌手术刀片沿着种子表面的两片子叶的连接处轻轻插入，并将种子分为两部分，优选受损伤较小、外观较为完整的胚，将暴露的胚用消毒过的镊子轻轻转入诱导培养基I中；其中，培养基I成分为：1/2MS0+IAA 0.5mg/L+GA30.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0g/L，pH5.8；
(5)胚的萌发：将步骤(4)中完成接种的培养基置于培养室中进行培养，前两周用黑布覆盖进行暗培养，两周后去掉黑布，可观察到胚膨大，4周后可观察到胚芽端明显伸长；培养温度为27℃，光照强度800lx，每天光照12h；
(6)无菌苗的获得：接种4周后，胚芽端伸长达到1cm，在超净工作台上将幼嫩的茎段从膨大的胚上分离，去除基部褐色组织，转入诱导培养基Ⅱ中，其中，培养基Ⅱ成分为：1MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+水解酪蛋白500mg/L+改性活性炭1000mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉6.0g/L，pH 5.8。培养4周后可获得长势良好的无菌苗，可用于后期的种苗扩繁和生根等操作，培养室的培养程序、温度、光照强度和光照时间与步骤(5)相同；
步骤(6)中改性活性炭的改性方法为：将核桃壳和龙眼壳按照质量比为1:2混合，进行粉碎后过100目筛，然后浸渍于1mol/L的盐酸溶液中1h，过滤后放在明火中烘烤，直至把粉末烤黑，冷却后用1mol/L的氢氧化钠溶液中和洗去酸液，再采用清水漂洗后干燥得到所述改性活性炭。
实施例2
一种无忧花无菌诱导方法，所述方法包括如下步骤：
(1)果荚的采集和处理：在种子完全成熟前，约6月中下旬，采摘未开裂、饱满、无病虫害的中国无忧花果荚；
(2)低温处理：将步骤(1)中获得的果荚放置于5℃冰箱内冷藏7d，备用；
(3)种子的消毒：剥开果荚，选取颗粒光滑、相对饱满的种子，在超净工作台上，用消毒液对种子进行消毒处理；其中，消毒液消毒处理方法为：将种子浸泡在消毒液Ⅰ中20min；取出后放入消毒液Ⅱ中浸泡30s；取出后用无菌水冲洗3-5次。其中，消毒液Ⅰ为质量百分数为0.1％的HgCl2和0.01％的吐温-80溶液混合液；消毒液Ⅱ为体积百分数为75％的乙醇溶液；
(4)胚的剥离：在超净工作台上，用无菌手术刀片沿着种子表面的两片子叶的连接处轻轻插入，并将种子分为两部分，优选受损伤较小、外观较为完整的胚，将暴露的胚用消毒过的镊子轻轻转入诱导培养基I中；其中，培养基I成分为：1/2MS0+IAA 1.0mg/L+GA33.0mg/L+水解酪蛋白500mg/L+聚乙烯吡咯烷酮1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.0g/L，pH6.2；
(5)胚的萌发：将步骤(4)中完成接种的培养基置于培养室中进行培养，前两周用黑布覆盖进行暗培养，两周后去掉黑布，可观察到胚膨大，4周后可观察到胚芽端明显伸长；培养温度为23℃，光照强度1500lx，每天光照14h；
(6)无菌苗的获得：接种4周后，胚芽端伸长达到3cm，在超净工作台上将幼嫩的茎段从膨大的胚上分离，去除基部褐色组织，转入诱导培养基Ⅱ中，其中，培养基Ⅱ成分为：1MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+水解酪蛋白500mg/L+改性活性炭1000mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉7.0g/L，pH 6.2。培养6周后可获得长势良好的无菌苗，可用于后期的种苗扩繁和生根等操作，培养室的培养程序、温度、光照强度和光照时间与步骤(5)相同；
步骤(6)中改性活性炭的改性方法为：将核桃壳和龙眼壳按照质量比为1:2混合，进行粉碎后过100目筛，然后浸渍于2mol/L的磷酸溶液中2h，过滤后放在明火中烘烤，直至把粉末烤黑，冷却后用2mol/L的氢氧化钠溶液中和洗去酸液，再采用清水漂洗后干燥得到所述改性活性炭。
实施例3
一种无忧花无菌诱导方法，所述方法包括如下步骤：
(1)果荚的采集和处理：在种子完全成熟前，约6月中下旬，采摘未开裂、饱满、无病虫害的中国无忧花果荚；
(2)低温处理：将步骤(1)中获得的果荚放置于5℃冰箱内冷藏5d，备用；
(3)种子的消毒：剥开果荚，选取颗粒光滑、相对饱满的种子，在超净工作台上，用消毒液对种子进行消毒处理；其中，消毒液消毒处理方法为：将种子浸泡在消毒液Ⅰ中17min；取出后放入消毒液Ⅱ中浸泡30s；取出后用无菌水冲洗4次。其中，消毒液Ⅰ为质量百分数为0.1％的HgCl2和0.01％的吐温-80溶液混合液；消毒液Ⅱ为体积百分数为75％的乙醇溶液；
(4)胚的剥离：在超净工作台上，用无菌手术刀片沿着种子表面的两片子叶的连接处轻轻插入，并将种子分为两部分，优选受损伤较小、外观较为完整的胚，将暴露的胚用消毒过的镊子轻轻转入诱导培养基I中；其中，培养基I成分为：1/2MS0+IAA 0.8mg/L+GA32.0mg/L+水解酪蛋白500mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L，pH6.0；
(5)胚的萌发：将步骤(4)中完成接种的培养基置于培养室中进行培养，前两周用黑布覆盖进行暗培养，两周后去掉黑布，可观察到胚膨大，4周后可观察到胚芽端明显伸长；培养温度为25℃，光照强度1000lx，每天光照13h；
(6)无菌苗的获得：接种4周后，胚芽端伸长达到2cm，在超净工作台上将幼嫩的茎段从膨大的胚上分离，去除基部褐色组织，转入诱导培养基Ⅱ中，其中，培养基Ⅱ成分为：1MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.8mg/L+水解酪蛋白500mg/L+改性活性炭1000mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉6.5g/L，pH 6.0。培养5周后可获得长势良好的无菌苗，可用于后期的种苗扩繁和生根等操作，培养室的培养程序、温度、光照强度和光照时间与步骤(5)相同；
步骤(6)中改性活性炭的改性方法为：将核桃壳和龙眼壳按照质量比为1:2混合，进行粉碎后过100目筛，然后浸渍于2mol/L的盐酸溶液中1.5h，过滤后放在明火中烘烤，直至把粉末烤黑，冷却后用1.5mol/L的氢氧化钠溶液中和洗去酸液，再采用清水漂洗后干燥得到所述改性活性炭。
申请人在探究实施例1-3的诱导方法的过程中，还进行了多次不同的相关实验，实验内容如下：
对照组1：
对照组1无忧花无菌诱导方法的步骤(1)-(3)和步骤(5)与与实施例1一致，唯一不同的是，步骤(4)与步骤(6)的诱导培养基都使用诱导培养基I。
对照组2：
对照组2无忧花无菌诱导方法的步骤(1)-(3)和步骤(5)与与实施例1一致，唯一不同的是，步骤(4)与步骤(6)的诱导培养基都使用诱导培养基Ⅱ。
对照组3：
对照组3无忧花无菌诱导方法的步骤(1)-(3)和步骤(5)与与实施例1一致，唯一不同的是，步骤(4)的诱导培养基I和步骤(6)的诱导培养基Ⅱ的抗氧化剂均使用聚乙烯吡咯烷酮0.5mg/L和改性活性炭1000mg/L混合而并非单一成分。即，培养基I成分为：1/2MS0+IAA0.5mg/L+GA3 0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.5mg/L+改性活性炭1000mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0g/L，pH5.8；培养基Ⅱ成分为：1MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+水解酪蛋白500mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.5mg/L+改性活性炭1000mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉6.0g/L，pH 5.8。
对照组4：
对照组4无忧花无菌诱导方法的步骤(1)-(5)与与实施例1一致，唯一不同的是，步骤(6)的诱导培养基Ⅱ的抗氧化剂使用常规活性炭替代改性活性炭；即培养基Ⅱ成分为：1MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+水解酪蛋白500mg/L+活性炭1000mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉6.0g/L，pH 5.8。
对照组5：
对照组5无忧花无菌诱导方法的步骤(1)-(3)和步骤(5)与与实施例1一致，唯一不同的是，步骤(4)的诱导培养基I和步骤(6)的诱导培养基II的不使用抗氧化剂聚乙烯吡咯烷酮和改性活性炭。即，诱导培养基I成分为：1/2MS0+IAA 0.5mg/L+GA3 0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0g/L，pH5.8；诱导培养基Ⅱ成分为：1MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉6.0g/L，pH 5.8。
对照组6：
对照组6无忧花无菌诱导方法的步骤(1)-(2)和步骤(4)-(6)与与实施例1一致，唯一不同的是，步骤(3)的消毒液只使用HgCl2而不添加吐温-80和使用75％的乙醇进行二次消毒。
实施例1-3和对照组1-6分别使用100个胚进行实验；统计并计算褐化率和成苗率：
(1)褐化率计算公式：
褐化率(％)＝(胚褐化数/实验用胚数)×100％；
(2)成苗率计算公式：
成苗率(％)＝(无菌苗数/实验用胚数)×100％。
测定结果如表1：
表1各组培育方法的褐化率和成苗率
由上表可知，实施例1-3的褐化率低于对照组1-6；实施例1-3的成苗率高于对照组1-6；由此说明，在本申请的组织培养中，抗氧剂的使用步骤、使用对象能很好的起到对无忧花的抗褐变作用，能提高无忧花的成活率。对照组3的褐化率较低，但是其成活率并不高，这说明，抗氧化剂使用步骤、剂量不同会影响无忧花组培苗的成苗率，在进一步研究中发现，这是因为抗氧化剂加入过多对幼胚产生了一定的毒性，抑制组培苗的生长，导致成苗率下降。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (3)
1.一种无忧花无菌苗的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基包括用于幼胚的诱导培养基I和用于从胚上分离的幼嫩茎段的诱导培养基Ⅱ；
所述诱导培养基I的组分含量如下：1/2MS0 + IAA 0.5-1.0mg/L + GA3 0.5-3.0mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0-7.0g/L，pH5.8-6.2；
所述诱导培养基Ⅱ 的组分含量如下：MS+6-BA 0.5-3.0mg/L+NAA 0.2-1.0mg/L+水解酪蛋白 500mg/L+改性活性炭 1000mg/L+蔗糖30 g/L，琼脂粉6.0-7.0g/L，pH 5.8-6.2。
2.根据权利要求1的诱导培养基，其特征在于，所述改性活性炭的改性方法为：将核桃壳和龙眼壳按照质量比为1:2混合，进行粉碎后过100目筛，然后浸渍于1-2mol/L的盐酸溶液或1-2mol/L的磷酸溶液中1-2h，过滤后放在明火中烘烤，直至把粉末烤黑，冷却后用1-2mol/L的氢氧化钠溶液中和洗去酸液，再采用清水漂洗后干燥得到所述改性活性炭。
3.一种应用权利要求1-2任意一项诱导培养基进行无忧花无菌诱导方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）果荚的采集和处理：在种子完全成熟前，6月中下旬，采摘未开裂、饱满、无病虫害的中国无忧花果荚；
（2）低温处理：将步骤（1）中获得的果荚放置于5℃冰箱内冷藏4-7d，备用；
（3）种子的消毒：剥开果荚，选取颗粒光滑、相对饱满的种子，在超净工作台上，用消毒液对种子进行消毒处理；
（4）胚的剥离：在超净工作台上，用无菌手术刀片沿着种子表面的两片子叶的连接处轻轻插入，并将种子分为两部分，选择受损伤较小、外观较为完整的胚，将暴露的胚用消毒过的镊子轻轻转入诱导培养基I中；
（5）胚的萌发：将步骤（4）中完成接种的培养基置于培养室中进行培养，前两周用黑布覆盖进行暗培养，两周后去掉黑布，可观察到胚膨大，4周后可观察到胚芽端明显伸长；培养温度为25±2 ℃，光照强度800-1500 lx，每天光照12-14 h；
（6）无菌苗的获得：接种4周后，胚芽端伸长达到1-3 cm，在超净工作台上将幼嫩的茎段从膨大的胚上分离，去除基部褐色组织，转入诱导培养基Ⅱ 中，培养4-6周后可获得长势良好的无菌苗，可用于后期的种苗扩繁和生根等操作，培养室的培养程序、温度、光照强度和光照时间与步骤（5）相同；
所述步骤（3）的消毒液对种子进行消毒处理方法为：将种子浸泡在质量百分数为0.1%的HgCl2和0.01%的吐温-80溶液混合液中15-20min；取出后放入体积百分数为75%的乙醇溶液中浸泡30s；取出后用无菌水冲洗3-5次。
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