CN103385167B - 一种宝莲灯子房培养及组培快繁方法 - Google Patents
一种宝莲灯子房培养及组培快繁方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种宝莲灯子房培养及组培快繁方法，包括如下步骤：1）培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分；2)子房外植体的选取及消毒；3）接种及子房培养；4）种子的成熟及萌发；5）增殖培养；6）生根培养；7）炼苗及移栽。本发明利用子房培养技术获得了宝莲灯的无菌植株，而且克服了褐化的不利影响，能够在短时间内获得大量的优质壮苗，对于宝莲灯的种质保存、杂交育种及规模化种苗生产都具有积极的指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及培养及组培领域，具体涉及一种宝莲灯子房培养及组培快繁方法。
背景技术
宝莲灯(Medinilla magnifica)为野牡丹科酸脚杆属常绿小灌木，又名美丁花、粉苞酸脚杆，原产于东南亚的热带雨林，观赏价值极高。它的叶面宽大典雅，宫灯花型新奇美丽且花期超长，果实圆润玲珑，是一种观花、叶、果俱佳的精品花卉，也是近年来最具发展潜质的时尚新葩之一。但由于宝莲灯为进口花卉品种，资源较为稀缺，使得其价格在国内市场上一直居高不下，普通消费者难以承受。目前宝莲灯的繁殖以扦插方式为主、播种繁殖为辅。扦插的后期管理技术要求偏高、而扦插成活率和繁殖系数较低；此外，在自然条件下较难获得成熟的宝莲灯种子，其播种繁殖成苗率很低。综上所述，现有的宝莲灯繁育方法均不能实现大规模的工厂化生产，难以满足快速增长的市场需求。因此，开展宝莲灯的人工繁殖工作具有现实必要性。
早在二十世纪七八十年代国外研究者就开始考虑通过组织培养方式对木本植物宝莲灯进行种苗快繁，并尝试以宝莲灯的表皮组织、根尖及茎尖等做为外植体来建立其培养体系(参见In frontiers of plant tissue culture.Than Than Van K,Trinh H,(Thorpe,T.A.,ed.),Calgary,Alta,Canada,第37页，1978年)，但是均未能得到无菌的宝莲灯活体茎尖。Vande Casteele等（参见The phenolics and a hydrolysable tannin polyphenol oxidase of Medinilla magnifica.VandeCasteele et al.,Phytochemistry,第20卷第5期,1105-1112页,1981年）研究发现宝莲灯组织内含有大量的酚类化合物和水解鞣酸多酚氧化酶，在组培过程中容易诱发严重的褐化，对培养物生长极为不利，从而导致宝莲灯组织培养的失败。在此之前还没有宝莲灯组织培养成功的报道，更没有成功的实例。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种宝莲灯子房培养及组培快繁方法，一种通过子房培养获得无菌材料并对宝莲灯进行快繁的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种宝莲灯子房培养及组培快繁方法，该方法包括以下几个步骤：
1）、培养基的配制：
（1）基本培养基：1/2MS培养基，蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH=4.8～5.8；
（2）发育培养基：1/2MS+200～800mg/L水解酪蛋白+0.3～2.0%活性炭；
（3）增殖培养基：1/2MS+2.5～1.0mMβ-巯基乙醇+0.5～2.0mg/L6-BA+0.1～1.0%活性炭；
（4）生根培养基：1/2MS+2.5～1.0mMβ-巯基乙醇+0.05～0.2mg/L NAA+0.1～1.0%活性炭；
2）、子房外植体的选取及消毒：选取宝莲灯子房进行消毒处理；
3）、接种及子房培养：将步骤2）消毒后的宝莲灯子房在无菌条件下剖开后接种于发育培养基上进行宝莲灯子房培养；
4）、种子的成熟及萌发：待步骤3）的宝莲灯子房培养成熟并萌发后小心转至基本培养基上生长成幼苗；
5）、增殖培养：将步骤4）的幼苗切掉根部后转接于增殖培养基上增殖；
6）、生根培养：将步骤5）获得的增殖苗转接于生根培养基上诱导生根；
7）、炼苗及移栽：将步骤6）的生根苗根部的培养基洗掉后移栽至装有基质的营养钵中，炼苗6～12天后将幼苗移至温室培养。
进一步地，在所述步骤2）中，所述的宝莲灯子房外植体直径为0.3cm。
进一步地，在所述步骤2）中，所述的消毒处理是将宝莲灯子房远轴端的突起部分用解剖刀削平后，先用浓洗衣粉溶液浸泡后再用自来水冲洗干净，然后依次在体积比为70%的酒精、有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液和质量分数为0.1%的升汞中分别浸泡0.5～1min、5～10min和4～8min，最后用无菌水冲洗3～5次。
进一步地，在所述步骤3）中，所述的宝莲灯子房培养是对剖开后的子房接种于发育培养基上行培养，并使部分子房内组织与培养基接触。
进一步地，本发明在所述步骤4）中，所述的萌发幼苗须小心无损地转接到基本培养基上。
进一步地，在所述步骤3）、4）、5）、6）中，所述的培养条件是，培养温度为23±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天。
进一步地，在步骤7）中，所述的炼苗是先在移栽的幼苗上覆盖薄膜并遮荫并在6～12天后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境。
本发明的有益效果为：宝莲灯的子房培养及组培快繁方法克服了褐化的不利影响，能够在短时间内获得大量的优质壮苗，对于宝莲灯的种质保存、杂交育种及规模化种苗生产都具有积极的指导意义。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
实施例1
本发明提供了一种宝莲灯子房培养及组培快繁方法，其步骤为：
1）、培养基的配制
（1）基本培养基：1/2MS培养基，蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH=4.8～5.8;
（2）发育培养基：1/2MS+200～800mg/L水解酪蛋白+0.1～1.0%活性炭;
（3）增殖培养基：1/2MS+2.5～1.0mMβ-巯基乙醇+0.5～2.0mg/L6-BA+0.1～1.0%活性炭;
（4）生根培养基：1/2MS+2.5～1.0mMβ-巯基乙醇+0.05～0.2mg/L NAA+0.1～1.0%活性炭;
2）、外植体的选取与消毒
以宝莲灯子房作为外植体，可避免切伤褐化反应导致的培养物死亡；直径为0.3cm左右的子房内多数胚珠发育状态良好，尚未出现败育现象。故选取直径为0.3cm左右的宝莲灯子房作为外植体材料。
将子房远轴端的突起部分用解剖刀削平以去除褶皱部分藏匿的污物，再用浓洗衣粉溶液浸泡后再用自来水冲洗干净，然后依次在体积比为70%的酒精、有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液和质量分数为0.1%的升汞中分别浸泡0.5～1min、5～10min和4～8min，最后用无菌水冲洗3～5次；
3）、接种及子房培养
将消毒后的子房在无菌条件下剖开后接种于发育培养基上进行培养，接种时使部分子房内组织与培养基接触，有利于培养物对营养物质的吸收；培养条件为：温度为23±2℃、光照强度为30～80μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天；
4）、种子的成熟及萌发
子房培养3个月左右，胚珠成熟为种子并萌发成苗。在无菌条件下，将小苗仔细地转至基本培养基上培养，避免损伤引起褐化反应；培养条件为：温度为23±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天；
5）、增殖培养
将获得的宝莲灯植株在无菌条件下切除根部后接种于增殖培养基上进行增殖培养；培养条件为：温度为23±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天；
6）、生根培养
获得的增殖苗转接于生根培养基上培养，10天左右可诱导生根；培养条件为：温度为23±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天；
7）、炼苗及移栽
将宝莲灯生根植株根部的培养基洗掉后移栽至装有基质的营养钵中并覆盖薄膜，之后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外境，炼苗6～12天后将幼苗移至温室培养，移栽成活率大于90%。
实施例2
本发明提供了一种宝莲灯子房培养及组培快繁方法，其步骤为：
1）、培养基的配制
（1）基本培养基：1/2MS培养基，蔗糖30g/L，琼脂9g/L，pH=4.8;
（2）发育培养基：1/2MS+400mg/L水解酪蛋白+0.5%活性炭;
（3）增殖培养基：1/2MS+2.5mMβ-巯基乙醇+2.0mg/L6-BA+0.2%活性炭;
（4）生根培养基：1/2MS+2.5mMβ-巯基乙醇+0.1mg/L NAA+0.5%活性炭;
2）、外植体的选取与消毒
选取直径为0.3cm左右的宝莲灯子房作为外植体，将子房远轴端的突起部分用解剖刀削平以去除褶皱部分藏匿的污物，再用浓洗衣粉溶液浸泡后再用自来水冲洗干净，然后依次在体积比为70%的酒精、有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液和质量分数为0.1%的升汞中分别浸泡0.5～1min、5～10min和4～8min，最后用无菌水冲洗3～5次；
3）、接种及子房培养
将消毒后的子房在无菌条件下剖开后接种于发育培养基上进行培养，接种时使部分子房内组织与培养基接触，有利于培养物对营养物质的吸收；培养条件为：温度为23±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天；
4）、种子的成熟及萌发
子房培养3个月左右，胚珠成熟为种子并萌发成苗。在无菌条件下，将小苗仔细地转至基本培养基上培养，避免损伤引起褐化反应；培养条件为：温度为23±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天；
5）、增殖培养
将获得的宝莲灯植株在无菌条件下切除根部后接种于增殖培养基上进行增殖培养；培养条件为：温度为23±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天；
6）、生根培养
获得的增殖苗转接于生根培养基上培养，10天左右可诱导生根；培养条件为：温度为23±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天；
7）、炼苗及移栽
将宝莲灯生根植株根部的培养基洗掉后移栽至装有基质的营养钵中并覆盖薄膜，之后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外境，炼苗6～12天后将幼苗移至温室培养，移栽成活率大于90%。
最后需要说明的是，除本实施例外，本发明还可以有其它实施方式和变形，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。凡本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种宝莲灯子房培养及组培快繁方法，其特征在于：该方法包括以下几个步骤：
1)、培养基的配制：
(1)基本培养基：1/2MS培养基，蔗糖20～30g/L，琼脂5～9g/L，pH＝4.8～5.8；
(2)发育培养基：1/2MS+200～800mg/L水解酪蛋白+0.3～2.0％活性炭；
(3)增殖培养基：1/2MS+1.0～2.5mMβ-巯基乙醇+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.1～1.0％活性炭；
(4)生根培养基：1/2MS+1.0～2.5mMβ-巯基乙醇+0.05～0.2mg/L NAA+0.1～1.0％活性炭；
2)、子房外植体的选取及消毒：选取宝莲灯子房进行消毒处理；
3)、接种及子房培养：将步骤2)消毒后的宝莲灯子房在无菌条件下剖开后接种于发育培养基上进行宝莲灯子房培养；
4)、种子的成熟及萌发：待步骤3)的宝莲灯子房培养成熟并萌发后小心转至基本培养基上生长成幼苗；
5)、增殖培养：将步骤4)的幼苗切掉根部后转接于增殖培养基上增殖；
6)、生根培养：将步骤5)获得的增殖苗转接于生根培养基上诱导生根；
7)、炼苗及移栽：将步骤6)的生根苗根部的培养基洗掉后移栽至装有基质的营养钵中，炼苗6～12天后将幼苗移至温室培养。
2.根据权利要求1所述的宝莲灯子房培养及组培快繁方法，其特征在于：在所述步骤2)中，所述的宝莲灯子房外植体直径为0.3cm。
3.根据权利要求1所述的宝莲灯子房培养及组培快繁方法，其特征在于：在所述步骤2)中，所述的消毒处理是将宝莲灯子房远轴端的突起部分用解剖刀削平后，先用浓洗衣粉溶液浸泡后再用自来水冲洗干净，然后依次在体积比为70％的酒精、有效氯浓度为1％的次氯酸钠溶液和质量分数为0.1％的升汞中分别浸泡0.5～1min、5～10min和4～8min，最后用无菌水冲洗3～5次。
4.根据权利要求1所述的宝莲灯子房培养及组培快繁方法，其特征在于：在所述步骤3)中，所述的宝莲灯子房培养是对剖开后的子房接种于发育培养基上行培养，并使部分子房内组织与培养基接触。
5.根据权利要求1所述的宝莲灯子房培养及组培快繁方法，其特征在于：在所述步骤3)、4)、5)、6)中，所述的培养条件是，培养温度为23±2℃、光照强度为30～60μmol·m-2·s-1、光照时间为8～16小时/天。
6.根据权利要求1所述的宝莲灯子房培养及组培快繁方法，其特征在于：在步骤7)中，所述的炼苗是先在移栽的幼苗上覆盖薄膜并遮荫，并在6～12天后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境。
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