CN105230481B - 火焰树愈伤组织的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种火焰树愈伤组织的诱导方法，以火焰树花瓣为外植体，经预处理和灭菌消毒后，接种于特定启动培养基中进行愈伤组织诱导培养，将获得的愈伤组织转至经增殖培养基中先暗培养7d后，转于光照下继续培养。本发明首次成功的以火焰树花瓣为外植体进行愈伤组织诱导，愈伤组织的诱导率可达83.3％，愈伤组织的增殖率高达100％，解决了火焰树离体培养中外植体污染率高、愈伤组织诱导率低这一技术难题，为火焰树组培快繁和品种改良奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物培养领域，具体地涉及一种火焰树愈伤组织的诱导方法。
背景技术
火焰树(Spathodea campanulata Beauv)为紫葳科火焰树属高大乔木，树冠伞形、圆锥形，树姿婆娑，羽叶茂盛，树形优美。开花时花多而密集、花大、花色猩红、花色艳丽，花开于树冠之上，有极高的观赏价值，是良好的风景园林观赏树种。原产于热带非洲地区。现在广泛栽培于印度、斯里兰卡等，我国广东、福建、台湾、云南等地区也均有栽培。火焰树常规的繁殖方法主要采用播种、扦插、嫁接等方法。但采用这些方法存在成苗生长周期长、成型慢、种子发芽率低、出苗率不稳定等问题，无法满足生产和市场的需求。因此，探索火焰树快速繁殖的有效途径已成为亟待解决的问题。
植物组织培养具有繁殖速度快、繁殖系数大、后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状、可获得无毒苗、可进行周年工厂化生产、经济效益高等优点，但植物的组织培养涉及多方面的因素、影响因子多，形成一套完整的工艺不易。
发明内容
本发明的目的在于提供一种火焰树愈伤组织的诱导方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明提供的技术方案如下：
一种火焰树愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：
1)取火焰树花瓣在洗衣粉溶液浸泡后流水冲洗，然后转置超净工作台依次用酒精、升汞、次氯酸钠灭菌处理，其中用70-80％酒精浸泡25-35s，转至0.1～0.2％HgCl2 5～12min后，无菌水漂洗3-5次，再用1％NaClO浸泡1～8min后，无菌水漂洗2-4次；每次无菌水漂洗时间为1-3min；无菌蒸馏水洗净后获得消毒的火焰树外植体。
2)愈伤组织诱导培养：取步骤1)已消毒的外植体切成0.4-0.6cm*0.4-0.6cm大小接种于愈伤诱导培养基中，培养条件为：光照强度1200-2000LuX，光照时间8-12h/d，温度25±2℃,pH＝5.8，所述诱导培养基，按每升计算，含有400mg NH4NO3、556mg Ca(NO3)2·4H2O、990mg K2SO4、96mg CaCl2·2H2O、170mg KH2PO4、0.25mg Na2MoO4·2H2O、370mgMgSO4·7H2O、22.4mg MnSO4·H2O、8.6mg ZnSO4·7H2O、0.25mg CuSO4·5H2O、27.8mgFeSO4·7H2O、37.3mg Na2MoEDTA、100mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5mg烟酸、0.5mg维生素B6、2.0mg甘氨酸20-30g蔗糖、7-9g琼脂、诱导培养基中添加0.1-2.0mg2,4-D、0.1-2.0mg NAA、0.2mg VC。
3)愈伤组织增殖培养条件为：取步骤2)所得的初代愈伤组织转接于继代培养基中，培养条件为温度25±2℃，pH＝5.8，先暗培养0-7d，然后正常光培养，光照强度1200-2000LuX，光照时间8-12h/d，温度25±2℃，所述增殖培养基，按每升计算，含有200mgNH4NO3、668mg Ca(NO3)2·4H2O、990mg K2SO4、170mg KH2PO4、0.25mg Na2MoO4·2H2O、370mgMgSO4·7H2O、22.4mg MnSO4·H2O、8.6mg ZnSO4·7H2O、0.25mg CuSO4·5H2O、27.8mgFeSO4·7H2O、37.3mg Na2MoEDTA、100mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5mg烟酸、0.5mg维生素B6、2.0mg甘氨酸、100mg水解酪蛋白、20-30g蔗糖、7-9g琼脂，增殖培养基中添加1.0mg2,4-D、0.5-1.0mg NAA、0-0.2mgVC。
其中，步骤1)外植体为火焰树长势饱满未开放花瓣；须经洗衣粉溶液浸泡预处理。
其中，步骤1)中，外植体预处理后优选的灭菌处理方法为洗衣粉溶液浸泡15min，再流水冲洗2h，之后用75％酒精浸泡30s，转至0.2％HgCl28min后，无菌水漂洗4次，再用1％NaClO浸泡8min后，无菌水漂洗3次。该优选处理条件下获得的外植体成活率最高、同时污染率和褐化率都很低。
其中，步骤2)花瓣愈伤组织诱导培养基优选为：按每升计算，含有400mg NH4NO3、556mg Ca(NO3)2·4H2O、990mg K2SO4、96mg CaCl2·2H2O、170mg KH2PO4、0.25mg Na2MoO4·2H2O、370mg MgSO4·7H2O、22.4mg MnSO4·H2O、8.6mg ZnSO4·7H2O、0.25mg CuSO4·5H2O、27.8mg FeSO4·7H2O、37.3mg Na2MoEDTA、100mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5mg烟酸、0.5mg维生素B6、2.0mg甘氨酸、20-30g蔗糖、7-9g琼脂。诱导培养基优选添加1.0mg2,4-D、1.0mgNAA、0.2mg VC。
其中，步骤3)花瓣愈伤组织增殖培养基优选为：按每升计算，含有200mg NH4NO3、668 mg Ca(NO3)2·4H2O、990mg K2SO4、170mg KH2PO4、0.25mg Na2MoO4·2H2O、370mgMgSO4·7H2O、22.4mg MnSO4·H2O、8.6mg ZnSO4·7H2O、0.25mg CuSO4·5H2O、27.8mg FeSO4·7H2O、37.3mg Na2MoEDTA、100mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5mg烟酸、0.5mg维生素B6、2.0mg甘氨酸、100mg水解酪蛋白、20-30g蔗糖、7-9g琼脂、增殖培养基中优选添加1.0mg2,4-D、1.0mg NAA、0.2mgVC、培养条件为先暗培养7d,然后正常光照培养。
本发明以火焰树的花瓣为外植体，首先采用步骤1)的外植体灭菌方法，获得成活率高(可达73.4％)、褐化率低(6.8％)、污染率较低(19.8％)的外植体，再综合筛选得到附加不同激素及其浓度配比的花瓣愈伤组织启动培养及增殖培养基配方，以及光照等多方面因素，最后可以获得愈伤组织诱导率可达83.3％，增殖率达100％，解决了火焰树离体培养中外植体污染率高、愈伤组织诱导率低这一技术难题，为火焰树组培快繁和品种改良奠定基础，本发明方法可以为火焰树的遗传转化及工厂化育苗提供技术支持。
附图说明
图1为花瓣愈伤组织启动培养实物图之一；
图2为花瓣愈伤组织启动培养实物图之二；
图3为花瓣愈伤组织增殖培养实物图之一；
图4为花瓣愈伤组织增殖培养实物图之二；
图5为继代培养的愈伤组织培养实物图之一；
图6为继代培养的愈伤组织培养实物图之二。
具体实施方式
以闽南师范大学校园里长势良好、无病虫害的火焰树植株的花瓣为试验材料。
实施例1外植体灭菌
选取长势饱满未开放的火焰树花瓣作为外植体。先用市售洗衣粉浓溶液5g/L浸泡15min后，于流水中冲洗2h，再转至超净工作台，将外植体进行灭菌操作。具体操作见表1(HgCl2处理后无菌水漂洗4次，每次2min；NaClO处理后，无菌水漂洗3次，每次2min)。灭菌操作完，将花冠切成0.5cm*0.5cm大小转接到相应的培养基上，每处理接种30瓶，每瓶1-3个材料，重复3次。15d后观察统计不同外植体的灭菌效果。根据材料的污染率、 褐化率、成活率判断灭菌方法的优劣。其中，污染率＝接种污染数/接种总数×100％；褐化率＝褐化数/接种总数×100％；成活率＝无污染、褐化数/接种总数×100％。
表1外植体灭菌处理
外植体经过灭菌处理后，接种在相应培养基上，观察统计其污染率、褐化率、成活率及生长情况。试验结果见表2。
表2不同消毒处理对外植体灭菌效果的影响
由表2可知，火焰树花瓣灭菌处理中效果最好的是处理7，其成活率最高，达73.4％，褐化率为6.8％，污染率较低，为19.8％，愈伤生长良好。其次是处理8，成活率达66.2％，但其褐化率为16.6％，污染率为18.3％与处理7相差0.5％；灭菌效果最差的为处理1及处理4，其成活率均为10.1％。从表1和表2，可看出外植体灭菌处理中，随着HgCl2浓度的提高、处理时间的延长，污染率随之下降，但褐化率升高。HgCl2与NaClO组合处理，灭菌效果比单独使用好。因此根据结果及外植体生长情况认为火焰树外植体花瓣的最佳灭 菌方法为：洗衣粉溶液浸泡15min→流水冲洗2h→75％酒精30s→0.1％HgCl28min→无菌水漂洗4次→1％NaClO 8min→无菌水漂洗3次。
实施例2启动培养
本方法以火焰树花瓣为外植体，进行花瓣愈伤组织诱导培养；
以含有以下成分的培养基为诱导培养基：400mg/L NH4NO3、556mg/L Ca(NO3)2·4H2O、990mg/L K2SO4、96mg/L CaCl2·2H2O、170mg/L KH2PO4、0.25mg/L Na2MoO4·2H2O、370mg/LMgSO4·7H2O、22.4mg/L MnSO4·H2O、8.6mg/L ZnSO4·7H2O、0.25mg/L CuSO4·5H2O、27.8mg/L FeSO4·7H2O、37.3mg/L Na2MoEDTA、100mg/L肌醇、1.0mg/L维生素B1、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L维生素B6、2.0mg/L甘氨酸。
在诱导培养基中附加不同浓度的生长素(2,4-D 0.1-2.0mg/L，NAA 0.1-2.0mg/L)，研究不同培养基配方对花瓣愈伤组织的启动诱导效果，试验设计见表3。每处理30瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次。培养20d后，观察统计愈伤组织出愈率，出愈率＝出现愈伤数/接种总数×100％。
培养条件为：光照强度1200-2000LuX，光照时间8-12h/d，温度为25±2℃；各组培养基琼脂7-9g/L，蔗糖20-30g/L，pH为5.8。
表3不同激素组合对火焰树启动培养的影响
启动培养的成功除了外植体灭菌处理外，还取决于培养基的成分，培养20d后统计出愈率，试验结果见表4。其中花瓣愈伤组织诱导效果见附图1、2。
表4花瓣愈伤组织启动培养效果
经出愈率方差分析F＝6.758>F0.05＝5.14，说明不同培养基组合对花瓣愈伤组织启动培养影响显著，经多重比较结果表明a1与a3显著不差异，a2分别与a1、a3差异显著。由表5可知，诱导花瓣愈伤组织效果最好的是a2，出愈率最高，达83.3％，即花瓣愈伤组织诱导较适合的培养基为：诱导培养基+2,4-D 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+维生素C 0.2mg/L。
实施例3愈伤组织增殖培养
将诱导培养基获得的花瓣愈伤组织转接到含有以下组分的愈伤组织增殖培养基中：200mg/L NH4NO3、668mg/L Ca(NO3)2·4H2O、990mg/L K2SO4、170mg/L KH2PO4、0.25mg/LNa2MoO4·2H2O、370mg/LMgSO4·7H2O、22.4mg/L MnSO4·H2O、8.6mg/L ZnSO4·7H2O、0.25mg/L CuSO4·5H2O、27.8mg/L FeSO4·7H2O、37.3mg/L Na2MoEDTA、100mg/L肌醇、1.0mg/L维生素B1、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L维生素B6、2.0mg/L甘氨酸，100mg/L水解酪蛋白。
在增殖培养基中附加不同浓度激素组合(2,4-D 1.0mg/L，NAA0.1-1.0mg/L)，试验设计见表5。每处理10瓶，重复3次。每瓶接种1-3个大小为0.5cm*0.5cm的启动培养获得的愈伤组织。筛选出合适花瓣愈伤组织增殖的培养基组合。20d后，统计愈伤增殖率，观察愈伤组织颜色、质地、大小等，愈伤增殖率＝增殖愈伤数/接种总数×100％，增殖愈伤数为ΔV≥0.5V0的愈伤组织总数(ΔV为增加的愈伤组织体积，V0为接种时的体积)。
表5花瓣愈伤增殖培养基设计
培养条件为：光照强度1200-2000LuX，光照时间8-12h/d，温度为25±2℃；各组培养基琼脂7-9g/L，蔗糖20-30g/L，pH为5.8。
将启动培养中的愈伤组织转接到不同分化增殖培养基中继续培养，每5天观察记录 一次，20d后统计愈伤组织增殖率、分化率，观察愈伤组织颜色、质地并进行统计分析，结果见表6。其中愈伤组织增殖培养效果见附图3、4。
表6不同激素配比对花瓣愈伤组织增殖培养的影响
从表6及观察结果可知，愈伤组织增殖培养效果较好培养基是b6，愈伤组织增殖率达100％，愈伤组织呈白色，质地紧密(见图3、4)，后期在该培养基上继代培养基，愈伤组织生长良好，呈淡绿色，有可能进一步转化为胚性愈伤组织(见图5)。其中b4和b5处理，愈伤组织增殖率分别为95％和86.3％，分别在原来相应增殖培养基上继代培养，发现愈伤组织在第3代就出现褐化，且生长缓慢(见图6)。因此，较适合愈伤组织增殖培养的处理可初步认定为：增殖培养基+2,4-D 1.0mg/L+NAA1.0mg/L+维生素C 0.2mg/L，暗培养7d；该处理有利于花瓣愈伤组织的继代增殖培养及分化培养。
综上所述，火焰树花瓣外植体最佳灭菌的方法为：洗衣粉溶液浸泡15min→流水冲洗2h→75％酒精30s→0.1％HgCl28min→无菌水漂洗4次→1％NaClO 8min→无菌水漂洗3次。花瓣愈伤组织启动培养的最适宜培养基为：诱导培养基+2,4-D1.0mg/L+NAA 1mg/L+维生素C 0.2mg/L；愈伤组织增殖培养最适宜处理为：增殖培养基+2,4-D1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+维生素C 0.2mg/L，暗培养7d，该处理有利于花瓣愈伤组织的继代增殖培养及分化培养。
Claims (5)
1.一种火焰树愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：
1)取火焰树花瓣在洗衣粉溶液浸泡后流水冲洗，然后转至超净工作台依次用酒精、升汞、次氯酸钠灭菌处理，其中用70-80％酒精浸泡25-35s，转至0.1～0.2％HgCl25～12min后，无菌水漂洗3-5次，再用1％NaClO浸泡1～8min后，无菌水漂洗2-4次；每次无菌水漂洗时间为1-3min；无菌蒸馏水洗净后获得消毒的火焰树外植体；所述火焰树花瓣为火焰树长势饱满未开放花瓣；
2)愈伤组织诱导培养：取步骤1)已消毒的外植体切成0.4-0.6cm*0.4-0.6cm大小接种于诱导培养基中，培养条件为：光照强度1200-2000LuX，光照时间8-12h/d，温度25±2℃，pH＝5.8，所述诱导培养基，按每升计算，含有400mg NH4NO3、556mg Ca(NO3)2·4H2O、990mgK2SO4、96mg CaCl2·2H2O、170mg KH2PO4、0.25mg Na2MoO4·2H2O、370mg MgSO4·7H2O、22.4mgMnSO4·H2O、8.6mg ZnSO4·7H2O、0.25mg CuSO4·5H2O、27.8mg FeSO4·7H2O、37.3mgNa2EDTA、100mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5mg烟酸、0.5mg维生素B6、2.0mg甘氨酸、20-30g蔗糖、7-9g琼脂，诱导培养基中添加0.1～2.0mg2,4-D、0.1～2.0mg NAA、0.2mg VC；
3)愈伤组织增殖培养：取步骤2)所得的初代愈伤组织转接于继代培养基中，培养条件为温度25±2℃，pH＝5.8，先暗培养7d，然后正常光培养，光照强度1200-2000LuX，光照时间8-12h/d，所述增殖培养基，按每升计算，含有200mg NH4NO3、668mg Ca(NO3)2·4H2O、990mgK2SO4、170mg KH2PO4、0.25mg Na2MoO4·2H2O、370mgMgSO4·7H2O、22.4mg MnSO4·H2O、8.6mgZnSO4·7H2O、0.25mg CuSO4·5H2O、27.8mg FeSO4·7H2O、37.3mg Na2EDTA、100mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5mg烟酸、0.5mg维生素B6、2.0mg甘氨酸、100mg水解酪蛋白、20-30g蔗糖、7-9g琼脂；增殖培养基中添加1.0mg2,4-D、0.5～1.0mg NAA、0～0.2mgVC。
2.如权利要求1所述的一种火焰树愈伤组织的诱导方法，其特征在于：步骤1)中，外植体经洗衣粉溶液浸泡15min，再流水冲洗2h，后经75％酒精浸泡30s，转至0.1％HgCl2浸泡8min后，无菌水漂洗4次，再用1％NaClO浸泡8min后，无菌水漂洗3次；每次无菌水漂洗时间为2min。
3.如权利要求1所述的一种火焰树愈伤组织的诱导方法，其特征在于：步骤2)的外植体大小为0.5cm*0.5cm。
4.如权利要求1所述的一种火焰树愈伤组织的诱导方法，其特征在于：步骤2)诱导培养基添加1.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L NAA、0.2mg/L VC。
5.如权利要求1所述的一种火焰树愈伤组织的诱导方法，其特征在于：步骤3)增殖培养基添加1.0mg2,4-D、1.0mg NAA、0.2mg VC。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |