CN115211370B

CN115211370B - 一种赤霞珠葡萄花器官愈伤组织诱导培养基及培养方法

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Publication number: CN115211370B
Application number: CN202210990451.9A
Authority: CN
Inventors: 鞠延仑; 王婉妮; 徐学蕾; 姚衡; 房玉林; 何爽
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2022-08-18
Filing date: 2022-08-18
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2042-08-18
Also published as: CN115211370A

Abstract

本发明公开了一种赤霞珠葡萄花器官愈伤组织诱导培养基及培养方法，涉及植物组织培养领域。该培养基包括KNO₃，NH₄NO₃，MgSO₄·7H₂O，H₃BO₃，KH₂PO₄和CaCl₂·2H₂O等元素，该方法包括：(1)采集外植体，随后对外植体进行消毒处理；(2)将经步骤(1)消毒后的外植体接种于上述的诱导培养基中，进行愈伤组织诱导培养。本发明解决了现有技术中存在的葡萄愈伤组织诱导率较低的问题，增加了外植体的可获得性，减少了接种时的操作难度，为后续转基因过程提供了较多的受体材料。

Description

一种赤霞珠葡萄花器官愈伤组织诱导培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，特别是涉及一种赤霞珠葡萄花器官愈伤组织诱导培养基及培养方法。

背景技术

葡萄是一种多年生木质藤本类植物，拥有重要的营养和经济价值，可用作鲜食、酿酒、制干、制汁等。在葡萄中引入抗逆、抗病等基因，可以加速实现葡萄品种的性状改良，提高经济价值，推动产业发展。然而葡萄具有童期长且基因高度杂合的特性，传统的育种方法周期长，还会引入杂合基因，导致后代性状表达不稳定。分子育种是通过植物组织培养技术和转基因技术相结合从而实现定向改良作物基因的育种方式，采用分子育种可以缩短育种进程，大大减少人力财力资源的消耗。

植物组织培养技术是实现分子育种的基础和前提，目前在葡萄遗传转化领域存在的主要瓶颈是葡萄的再生困难。葡萄再生途径可分为器官再生和体细胞胚再生，体胚再生时嵌合体的发生率较低，且胚性细胞和抗生素的接触面积大，有利于遗传转化。利用葡萄花器官诱导成愈伤组织是葡萄体细胞胚再生的关键步骤，胚性愈伤组织是转基因技术的可用受体之一。

赤霞珠是酿酒葡萄品种，具有果粒小、皮厚、酸度高、风味浓郁等特点。而现有技术中在进行葡萄愈伤组织培养的过程中仍存在，污染率较高，葡萄愈伤组织诱导率低等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种赤霞珠葡萄花器官愈伤组织诱导培养基及培养方法，以解决上述现有技术存在的问题。该培养基采用了KNO₃，NH₄NO₃，MgSO₄·7H₂O，H₃BO₃，KH₂PO₄和CaCl₂·2H₂O等元素，并通过外植体采集、外植体消毒、培养基配制和愈伤组织诱导等步骤，能够得到一种赤霞珠葡萄花器官愈伤组织，解决了现有技术中存在的葡萄愈伤组织诱导率较低的问题，增加了外植体的可获得性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种葡萄花器官愈伤组织诱导培养基，包括以下组分：

1500-2500mg/L KNO₃，1500-2500mg/L NH₄NO₃，350-450mg/L MgSO₄·7H₂O，150-250mg/LKH₂PO₄，150-450mg/L CaCl₂·2H₂O，15-25mg/LMnSO₄·4H₂O，5-10mg/L ZnSO₄·7H₂O，5-10mg/LH₃BO₃，0.025-0.05mg/L CoCl₂·6H₂O，0.5-1mg/LKI，0.25-0.5mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025-0.05mg/L CuSO₄·5H₂O，15-30mg/L FeSO₄·7H₂O，15-40mg/LNa·EDTA·2H₂O，50-100mg/L肌醇，1.0-2.0mg/L维生素B1，0.5-1mg/L维生素B3，0.5-1mg/L维生素B6，1.0-2.0mg/L甘氨酸，0.5-1mg/LNOA，0.5-1mg/L 2,4-D，0.5-1.5mg/L 4-CPPU，0.1-05g/L肌醇，0.5-1g/L谷氨酰胺，15-30g/L蔗糖，1.5-3g/L植物凝胶。

进一步的，包括以下组分：

1900mg/L KNO₃，1650mg/LNH₄NO₃，370mg/LMgSO₄·7H₂O，170mg/LKH₂PO₄，440mg/LCaCl₂·2H₂O，22.3mg/LMnSO₄·4H₂O，8.6mg/LZnSO₄·7H₂O，6.2mg/LH₃BO₃，0.025mg/LCoCl₂·6H₂O，0.83mg/L KI，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O，27.85mg/LFeSO₄·7H₂O，37.25mg/LNa·EDTA·2H₂O，100mg/L肌醇，1.0mg/L维生素B1，0.5mg/L维生素B3，0.5mg/L维生素B6，2.0mg/L甘氨酸，0.5mg/LNOA，0.55mg/L 2,4-D，1.24mg/L4-CPPU，0.1g/L肌醇，0.5g/L谷氨酰胺，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶。

本发明还保护一种诱导培养基在葡萄花器官愈伤组织诱导培养中的应用。

本发明还保护一种葡萄花器官愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：

(1)采集外植体，随后对外植体进行消毒处理；

(2)将经步骤(1)消毒后的外植体接种于上述的诱导培养基中，进行愈伤组织诱导培养。

进一步的，外植体为处于单核靠边期的花粉细胞的小花蕾。

进一步的，消毒使用的消毒剂为体积分数为75％的乙醇和质量分数为1.5％的NaClO。

进一步的，乙醇的消毒时间为20-30s。

进一步的，NaClO的消毒时间为5-15min。

进一步的，诱导培养的培养温度为25℃。

进一步的，诱导培养的培养条件为在黑暗条件下培养。

本发明公开了以下技术效果：本发明解决了现有技术中存在的葡萄愈伤组织诱导率较低的问题，增加了外植体的可获得性，减少了接种时的操作难度，为后续转基因过程提供了较多的受体材料。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

步骤1、外植体采集：

步骤1.1、在葡萄开花前一周，小花蕾之间刚开始分离时采集花序；

步骤1.2、将花序放入塑封袋存于冰盒中带回，挑取长势相同的花序，将整个花序上大小具有差异的几个小花蕾切下排序，用镊子取出花蕾中的花药，分别对几个不同大小花蕾的花药制片，在放有花药的载玻片上滴1滴醋酸洋红染液，轻压盖玻片将花药压碎，吸取边缘多余的染液后静置5min，在显微镜下观察花粉细胞所处时期；

步骤1.3、选择处于单核靠边期的花粉细胞对应的小花蕾，此时小花蕾纵长约为2mm，花药呈现淡黄色，以大多数花粉细胞所处时期判断外植体采集时期，确定采集时期后采回花序；

步骤2、外植体消毒：

将花序在流水下冲洗4h左右，转入超净台后放置于灭菌后的组培瓶中，倒入没过花序的体积分数为75％的乙醇溶液，摇晃30s后倒掉乙醇溶液，用灭菌后的蒸馏水冲洗3次左右，再加入质量分数为1.5％的NaClO溶液，浸泡摇晃10min后弃入废液瓶，用无菌水冲洗五次，完成一次消毒过程，而后将花序放入灭菌后的干燥组培瓶中，瓶口缠绕封口膜后置于4℃冰箱中暂存；

步骤3、培养基配制：

配制愈伤组织诱导培养基，含大量元素：1900mg/L KNO₃，1650mg/LNH₄NO₃，370mg/LMgSO₄·7H₂O，170mg/LKH₂PO₄，440mg/L CaCl₂·2H₂O；微量元素：22.3mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O，6.2mg/LH₃BO₃，0.025mg/L CoCl₂·6H₂O，0.83mg/LKI，0.25mg/LNa₂MoO₄·2H₂O，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O；铁盐及络合物：27.85mg/L FeSO₄·7H₂O，37.25mg/LNa·EDTA·2H₂O，有机成分：100mg/L肌醇，1.0mg/L维生素B1，0.5mg/L维生素B3，0.5mg/L维生素B6，2.0mg/L甘氨酸；植物激素：0.5mg/L NOA(萘氧乙酸)，0.55mg/L 2,4-D，1.24mg/L4-CPPU(氯吡苯脲)；其它附加成分：0.1g/L肌醇，0.5g/L谷氨酰胺；碳源和凝固剂：30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶。用NaOH调节pH至5.8，121℃高压灭菌锅灭菌21min。

步骤4、愈伤组织的诱导：

将步骤2消毒后的花序再一次经过消毒处理，具体消毒处理操作同步骤2，将处理过的花序置于灭菌的滤纸上吸干水分，用镊子和手术刀切下小花蕾并保留约1mm的果梗，将小花蕾排列至步骤3制备好的诱导培养基上完成接种。将所有外植体置于25℃黑暗条件下培养，每4w继代一次，统计愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率。

实施例2

步骤1、外植体采集：

步骤1.2、将花序放入塑封袋存于冰盒中带回，挑取长势相同的花序，将整个花序上大小具有差异的几个小花蕾切下排序，用镊子取出花蕾中的花药，分别对几个不同大小花蕾的花药制片，在放有花药的载玻片上滴2滴醋酸洋红染液，轻压盖玻片将花药压碎，吸取边缘多余的染液后静置5min，在显微镜下观察花粉细胞所处时期；

步骤2、外植体消毒：

步骤3、培养基配制：

配制愈伤组织诱导培养基，含大量元素：2500mg/L KNO₃，2000mg/LNH₄NO₃，400mg/LMgSO₄·7H₂O，250mg/LKH₂PO₄，200mg/L CaCl₂·2H₂O；微量元素：15mg/L MnSO₄·4H₂O，5mg/LZnSO₄·7H₂O，6mg/LH₃BO₃，0.05mg/L CoCl₂·6H₂O，0.5mg/L KI，0.5mg/LNa₂MoO₄·2H₂O，0.05mg/L CuSO₄·5H₂O；铁盐及络合物：15mg/LFeSO₄·7H₂O，15mg/LNa·EDTA·2H₂O，有机成分：50mg/L肌醇，2.0mg/L维生素B1，1mg/L维生素B3，1mg/L维生素B6，1mg/L甘氨酸；植物激素：1mg/LNOA，1mg/L 2,4-D，0.5mg/L4-CPPU；其它附加成分：0.1g/L肌醇，1g/L谷氨酰胺；碳源和凝固剂：15g/L蔗糖，1.5g/L植物凝胶。用NaOH调节pH至6.4，121℃高压灭菌锅灭菌21min。

步骤4、愈伤组织的诱导：

对比例1

与实施例1的区别在于，步骤3中所采用的愈伤组织诱导培养基中的组分不包含KH₂PO₄。

对比例2

与实施例1的区别在于，步骤1中所采用的愈伤组织诱导培养基中的组分不包含H₃BO₃。

对比例3

与实施例1的区别在于，步骤3中所采用的愈伤组织诱导培养基为MC培养基。

对比例4

与实施例1的区别在于，步骤3中所采用的愈伤组织诱导培养基为MSI培养基。

对比例5

与实施例1的区别在于，未进行外植体消毒处理。

对比例6

与实施例1的区别在于，仅采用乙醇进行消毒处理。

统计实施例1-2和对比例1-4的愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率，结果见表1：

表1不同处理方法对“赤霞珠”葡萄愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率的影响

组别	愈伤组织诱导率(％)	胚性愈伤组织诱导率(％)
			实施例1	38.34	10.32
实施例2	36.25	9.71
			对比例1	24.32	3.64
对比例2	26.51	2.58
			对比例3	17.21	1.38
对比例4	16.32	1.48

统计实施例1-2和对比例5-6的污染率，结果见表2：

表2不同处理方法对“赤霞珠”葡萄外植体污染率的影响

组别	污染率(％)
		实施例1	44.21
实施例2	46.34
		对比例5	80.24
对比例6	69.61

根据表1及表2可以得知，实施例1采用小花蕾进行诱导并选择了特定的诱导培养基，所制得的愈伤组织与对比例1-4未采用实施例1中特定的诱导培养基所获得的愈伤组织相比，其愈伤组织诱导率至少提高了15个百分点，其胚性愈伤组织诱导率至少提高了10个百分点。可见本发明解决了现有技术中存在的葡萄愈伤组织诱导率较低的问题，增加了外植体的可获得性，减少了接种时的操作难度，降低了污染率，为后续转基因过程提供了较多的受体材料。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种葡萄花器官愈伤组织的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采集外植体，随后对外植体进行消毒处理；

（2）将经步骤（1）消毒后的外植体接种于诱导培养基中，进行愈伤组织诱导培养；

在步骤（1）中，所述外植体为处于单核靠边期的花序的小花蕾；所述消毒处理使用的消毒剂为体积分数为75%的乙醇和质量分数为1.5 %的NaClO；所述乙醇的消毒时间为20-30s；

所述NaClO的消毒时间为5-15min；在步骤（2）中，所述诱导培养的培养温度为25℃；在步骤（2）中，所述诱导培养在黑暗条件下进行；

所述诱导培养基，由以下组分组成：1900 mg/L KNO₃，1650 mg/L NH₄NO₃，370 mg/LMgSO₄·7H₂O，170 mg/L KH₂PO₄，440 mg/L CaCl₂·2H₂O；微量元素：22.3 mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6 mg/L ZnSO₄·7H₂O，6.2 mg/L H₃BO₃，0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O，0.83 mg/L KI，0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.025 mg/L CuSO₄·5H₂O；铁盐及络合物：27.85 mg/L FeSO₄·7H₂O，37.25 mg/L 乙二胺四乙酸钠盐；有机成分：100 mg/L 肌醇，1.0 mg/L 维生素B1，0.5 mg/L维生素B3，0.5 mg/L 维生素B6，2.0 mg/L甘氨酸；植物激素：0.5 mg/L NOA，0.55 mg/L 2,4-D，1.24 mg/L 4-CPPU；其它附加成分：0.1 g/L肌醇，0.5 g/L谷氨酰胺；碳源和凝固剂：30g/L蔗糖，3 g/L植物凝胶；所述葡萄花器官来源于赤霞珠。

2.一种诱导培养基在葡萄花器官愈伤组织诱导培养中的应用，其特征在于，所述诱导培养基，由以下组分组成：1900 mg/L KNO₃，1650 mg/L NH₄NO₃，370 mg/L MgSO₄·7H₂O，170mg/L KH₂PO₄，440 mg/L CaCl₂·2H₂O；微量元素：22.3 mg/L MnSO₄·4H₂O，8.6 mg/LZnSO₄·7H₂O，6.2 mg/L H₃BO₃，0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O，0.83 mg/L KI，0.25 mg/LNa₂MoO₄·2H₂O，0.025 mg/L CuSO₄·5H₂O；铁盐及络合物：27.85 mg/L FeSO₄·7H₂O，37.25mg/L 乙二胺四乙酸钠盐；有机成分：100 mg/L 肌醇，1.0 mg/L 维生素B1，0.5 mg/L 维生素B3，0.5 mg/L 维生素B6，2.0 mg/L甘氨酸；植物激素：0.5 mg/L NOA，0.55 mg/L 2,4-D，1.24 mg/L 4-CPPU；其它附加成分：0.1 g/L肌醇，0.5 g/L谷氨酰胺；碳源和凝固剂：30 g/L蔗糖，3 g/L植物凝胶；所述葡萄花器官来源于赤霞珠。