CN110199883B - 一种三七组培苗的培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种三七组培苗的培育方法：以三年生的三七花梗为材料，经过外植体消毒、接种、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎增殖、体细胞胚胎分化成苗及壮苗的方法实现三七组织快繁，通过以下4个步骤完成：步骤(1)：三七外植体无菌处理；步骤(2)：三七体细胞胚胎诱导；步骤(3)：三七体细胞胚胎增殖；步骤(4)：三七体细胞胚胎分化成苗及壮苗；本发明以三年生的三七花梗为材料，通过对消毒处理方法、培养基及激素配比等条件控制，建立三七组织快繁体系，实现分化成苗及壮苗培养一步化，缩短繁殖时间，降低培养成本，培育出成活率高、畸形率低、苗壮根粗的三七组培苗。

Description

一种三七组培苗的培育方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种三七组培苗的培育方法。
背景技术
三七为五加科人参属植物Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen，又名山漆、田七、金不换等，是多年生的宿根草本植物。其性温、味甘、苦，具有散瘀止血，消肿定痛之功效，常用于治疗咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛等。
现代药理学研究发现：三七对血液系统、心血管系统、中枢神经系统、免疫系统、内分泌系统等具有不同功效，由于三七中的三七总皂苷对心血管系统具有抗心律失常、抗心肌损伤、抗动脉粥样硬化、降血压、耐缺氧的作用，可以有效的治疗心脑血管疾病，这使得三七的需求量越来越大。随着三七的长期种植，三七的连作障碍、病虫害及种质资源退化等问题越来越突出，而植物组织培养可以优化种质资源，缩短育种时间，快速繁殖、培育抗性好、高产的品种，因此植物组织培养在三七培育上而越来越受到重视。在现有的三七组培研究报道中，张琪等使用三七种胚为诱导材料，通过体细胞胚胎发生途径获得三七再生植株(张琪等，植物学通报，1989)；刘瑞驹等以幼苗为材料，将茎、叶柄和叶分别进行离体培养，获得三七再生植株(刘瑞驹等，植物生理学通讯，1991)；陈伟荣等利用三七花序诱导了胚型愈伤组织，通过体细胞胚胎发生途径获得再生三七苗(陈伟荣等，华南农业大学学报，1992)；另有一些用叶片和叶柄作为材料，诱导获得三七再生植株(许鸿源等，中国中药杂志，2007)。尽管目前对三七植物组织快繁的研究较多，但以三年生的三七花梗为材料建立三七植物组织快繁体系并实现分化成苗及壮苗培养一步化的研究还未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三七培育方法，解决三七植物组织培养中存在的畸形胚较多、成苗率低、培养环节过多、相对成本高等问题。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种三七组培苗的培育方法，以三年生的三七花梗为材料，经过外植体消毒、接种、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎增殖、体细胞胚胎分化成苗及壮苗的方法建立三七组织快繁体系，通过以下步骤进行：
步骤(1)：三七外植体无菌处理，剪取三年生的三七花梗，用自来水冲洗后，用酒精和升汞消毒处理，获得无菌花梗；
步骤(2)：三七体细胞胚胎诱导，将步骤(1)中获得的无菌花梗接种到诱导培养基上，培养28—32天，得到三七体细胞胚胎；
步骤(3)：三七体细胞胚胎增殖：步骤(2)中获得的三七体细胞胚胎接种在增殖培养基上，培养28—32天，获得大量的三七体细胞胚胎；
步骤(4)：三七体细胞胚胎分化成苗及壮苗，将步骤(3)中获得的大量的三七体细胞胚胎接种在分化成苗及壮苗培养基上，每天光照10—14小时，光照强度为1200-1800LX，培养75—85天，至体细胞胚胎分化出根、茎、叶，形成完整的三七组培苗，并实现壮苗培养。
进一步的，步骤(1)的无菌花梗外植体的获取具体过程如下：剪取花梗用自来水冲洗备用，冲洗时间为2小时，然后在无菌室内酒精浸泡消毒处理，酒精浓度为75％，浸泡消毒时间为30秒，再用无菌水冲洗，冲洗次数为5次，接着用升汞浸泡消毒处理，升汞浓度为0.1％，浸泡消毒处理时间为6～12分钟，最后用无菌水冲洗后备用，冲洗次数为5次。
进一步的，步骤(2)中所使用的诱导培养基为：以1/4MS(琼脂6g/L、蔗糖20g/L)为基础培养基，附加0.2～0.3mg/L 6-BA，0.3～0.6mg/L KT，0.6～1.0mg/L 2,4-D，pH为6.4-6.8，培育方式为暗培育。
进一步的，步骤(3)中所使用的增殖培养基为：以1/2MS(琼脂6g/L、蔗糖20g/L)为基础培养基，附加0.3～0.9mg/L 6-BA，0.2～0.6mg/L KT，0.2～1.0mg/L 2,4-D和抗褐化剂(0.5g/L活性炭、2.0g/L PVP)，pH为6.4-6.8，培育方式为暗培育。
进一步的，步骤(4)中的分化成苗及壮苗培养基为：以1/8MS(琼脂6g/L、蔗糖20g/L)为基础培养基，附加0.2～1.5mg/L 6-BA，1.0～2.5mg/L IBA，0.2～1.0mg/L GA3和50g/L香蕉，pH为6.4-6.8。
进一步的，培养基中的琼脂添加量为6g/L，蔗糖添加为20g/L，培养温度控制在27±2℃，培养室空气相对湿度控制在65～75％。
更进一步的，三七花梗选取三年生的三七花梗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以三年生的三七花梗为材料，通过外植体消毒、接种、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎增殖、体细胞胚胎分化成苗及壮苗培养的方法建立三七组织快繁体系。其材料获取容易，降低畸形胚的发生率，提高了三七组培的成苗率及质量，实现分化成苗及壮苗培养一步化，减少三七组织快繁环节，降低培养成本。为三七组织快繁、种质资源保存及优化，以及为培育抗性好、产量高的三七品种提供可利用基础，促进三七产业发展。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
具体实施例：
一种三七组培苗的培育方法，以三年生的三七花梗为材料，经过外植体消毒、接种、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎增殖、体细胞胚胎分化成苗及壮苗的方法建立三七组织快繁体系，通过以下步骤进行：
步骤(1)：三七外植体无菌处理，剪取三七花梗，用自来水冲洗后，用酒精和升汞浸泡消毒处理，获得无菌花梗；更进一步的，无菌花梗外植体的获取具体过程如下：剪取花梗用自来水冲洗2小时，然后在无菌室内经酒精浸泡消毒处理，然后用无菌水冲洗，接着用升汞浸泡消毒处理，再用无菌水冲洗后备用；更为具体的，剪取花梗用自来水冲洗2小时，然后在无菌室内用75％酒精浸泡消毒处理30秒，再用无菌水冲洗5次，接着用0.1％升汞浸泡消毒处理，浸泡消毒处理6～12分钟，最后无菌水冲洗5次。在本步骤中，升汞浸泡消毒处理的处理时间是主要的影响因素，需要严格控制。
表1不同的消毒方法对三七花梗无菌处理的影响
Figure GDA0003707314760000031
从表1的结果可以看出，对三七花梗使用0.1％升汞浸泡消毒处理8分钟能明显有效降低其污染率，从而提高培养存活率，为最优的处理时间。
步骤(2)：三七体细胞胚胎诱导，将步骤(1)中获得的无菌花梗接种到诱导培养基上，培养28—32天，得到三七体细胞胚胎；更为具体的，三七体细胞胚胎诱导培养基为：1/4MS(琼脂6g/L、蔗糖20g/L)，0～0.6mg/L 6-BA，0～0.6mg/L KT，0.2～1.0mg/L 2,4-D，制备为诱导培养基对三七花梗进行体细胞胚胎诱导培育，培育方式为暗培育，暗环境下培养28—32天，本实施例中，不同植物激素配比是三七花梗诱导体细胞胚胎的主要影响因素。
表2不同植物激素配比对三七花梗诱导体细胞胚胎的影响
Figure GDA0003707314760000041
从表2的结果可以看出，6-BA和KT的添加能明显有利于三七体细胞胚胎的诱导，6-BA、KT和2,4-D三者协同作用更能明显促进三七体细胞胚胎的诱导。
步骤(3)：三七体细胞胚胎增殖：步骤(2)中获得的三七体细胞胚胎接种在增殖培养基上，培养28—32天，获得大量的三七体细胞胚胎；更为具体的，三七体细胞胚胎增殖培养基为：1/2MS(琼脂6g/L、蔗糖20g/L)，0.3～0.9mg/L 6-BA，0.2～0.6mg/L KT，0.2～1.0mg/L 2,4-D和抗褐化剂(0.5g/L活性炭、2.0g/L PVP)培育方式为暗培育，增殖培养需在暗环境下培养58—62天，本实施例中，不同植物激素配比是体细胞胚胎增殖的主要影响因素。
表3不同植物激素配比对体细胞胚胎增殖的影响
Figure GDA0003707314760000042
从表3的结果可以看出，抗褐化剂的添加有助于提高三七体细胞胚胎的增殖量，其中2.0g/LPVP的作用效果最为明显。
步骤(4)：三七体细胞胚胎分化成苗及壮苗，将步骤(3)中获得的大量三七体细胞胚胎接种在分化成苗及壮苗培养基上，每天光照10—14小时，光照强度为1200-1800LX，培养75—85天，至体细胞胚胎分化出根、茎、叶，形成完整的三七组培苗，并实现壮苗培养，更为具体的，三七体细胞胚胎分化成苗及壮苗的培养基为：1/8MS(琼脂6g/L、蔗糖20g/L)0.2～1.5mg/L 6-BA，1.0～2.5mg/L IBA，0.2～1.0mg/L GA3和50g/L香蕉，本实施例中，不同植物激素配比是体细胞胚胎分化成苗及壮苗的主要影响因素。
表4不同植物激素配比对体细胞胚胎分化成苗及壮苗的影响
Figure GDA0003707314760000051
从表4的结果可以看出，在培养基中添加1.5mg/L 6-BA，2.0mg/L IBA，1.0mg/LGA3能明显有利于三七体细胞胚胎成苗，并且易得到成活率高、苗壮根粗的三七组培苗。
上述所说的MS培养基中琼脂含量为6g/L、蔗糖含量为20g/L，其余成分均与MS培养基相同。1/2MS为所述MS培养基中的大量元素减半的培养基，1/4MS为所述MS培养基中的大量元素的1/4，1/8MS为所述MS培养基中的大量元素的1/8，6-BA为6-苄基腺嘌呤，KT为激动素，2,4-D为2，4-二氯苯氧乙酸，IBA为吲哚丁酸，GA3为赤霉素，PVP为聚乙烯吡咯烷酮，培育的环境控制在微酸范围内更为具体的，pH为6.4—6.8，在上述的培育的过程中，培养温度控制在27±2℃，培养室空气相对湿度控制在65～75％，同时，需要特别注意的是三七花梗选取三年生的三七花梗。
最优实施例：
一种三七组培苗的培育方法，以三年生的三七花梗为材料，经过外植体消毒、接种、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎增殖、体细胞胚胎分化成苗及壮苗的方法建立三七组织快繁体系，通过以下步骤进行：
步骤(1)：三七外植体无菌处理，剪取三七花梗，用自来水冲洗后，用酒精和升汞浸泡消毒处理，获得无菌花梗；更进一步的，无菌花梗外植体的获取具体过程如下：先将花梗用自来水清洗，然后在无菌室内经酒精浸泡消毒，然后用无菌水冲洗，接着用升汞浸泡消毒处理，再用无菌水冲洗后备用；更为具体的，剪取外植体花梗用自来水冲洗2小时，然后在无菌室内用75％酒精浸泡消毒处理30秒，再用无菌水冲洗5次，接着用0.1％升汞浸泡消毒处理，浸泡消毒处理6～12分钟，最后无菌水冲洗5次备用。在本步骤中，升汞消毒处理的处理时间是主要影响污染率及成活率的关键因素。对三七花梗使用0.1％升汞浸泡消毒处理8分钟能明显有效降低其污染率，从而提高培养存活率，为最优的处理时间。步骤(2)：三七体细胞胚胎诱导，将步骤(1)中获得的无菌花梗接种到诱导培养基上，培养30天，得到三七体细胞胚胎；更为具体的，三七体细胞胚胎诱导培养基为：1/4MS(琼脂6g/L、蔗糖20g/L)，0.3mg/L 6-BA，0.6mg/L KT，0.6mg/L 2,4-D，制备为诱导培养基对无菌花梗进行诱导培育，培育方式为暗培育，暗环境下培养30天，本实施例中，不同植物激素配比是三七花梗诱导体细胞胚胎的主要影响因素。6-BA和KT的添加能明显有利于三七体细胞胚胎的诱导。6-BA、KT和2,4-D三者协同作用更能明显促进三七体细胞胚胎的诱导。
步骤(3)：三七体细胞胚胎增殖：步骤(2)中获得的三七体细胞胚胎接种在增殖培养基上，培养30天，获得大量的三七体细胞胚胎；更为具体的，三七体细胞胚胎增殖培养基为：1/2MS(琼脂6g/L、蔗糖20g/L)0.9mg/L 6-BA，0.2mg/L KT，1.0mg/L 2,4-D和抗褐化剂(2.0g/L PVP)，培育方式为暗培育，增殖培养需在暗环境下培养60天，本实施例中，不同植物激素配比是体细胞胚胎增殖的主要影响因素。抗褐化剂的添加有助于提高三七体细胞胚胎的增殖量，其中2.0g/L PVP的作用效果最为明显。
步骤(4)：三七体细胞胚胎分化成苗及壮苗，将步骤(3)中获得的三七体细胞胚胎接种在分化成苗及壮苗培养基上，每天光照12小时，光照强度为1500LX，培养80天，至体细胞胚胎分化出根、茎、叶，形成完整的三七组织培苗，并实现壮苗培养，更为具体的，三七体细胞胚胎分化成苗及壮苗的培养基为：1/8MS(琼脂6g/L、蔗糖20g/L)1.5mg/L 6-BA，2mg/LIBA，1.0mg/L GA3和50g/L香蕉，本实施例中，不同植物激素配是对体细胞胚胎分化成苗及壮苗的主要影响因素。在培养基中添加1.5mg/L 6-BA，2.0mg/L IBA，1.0mg/L GA3能明显有利于三七的成苗，并且易得到成活率高、苗壮根粗的三七种苗。
上述所说的MS培养基中琼脂含量为6g/L、蔗糖含量为20g/L，其余成分均与MS培养基相同。1/2MS为所述MS培养基中的大量元素减半的培养基，1/4MS为所述MS培养基中的大量元素的1/4，1/8MS为所述MS培养基中的大量元素的1/8，6-BA为6-苄基腺嘌呤，KT为激动素，2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，IBA为吲哚丁酸，GA3为赤霉素，PVP为聚乙烯吡咯烷酮，培育的环境控制在微酸范围内更为具体的，pH为6.4，在上述的培育的过程中，培养温度控制在27±2℃，培养室空气相对湿度控制在65～75％，同时，需要特别注意的是三七花梗选取三年生的三七花梗。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开权利要求的范围内，可以对主题组合布局组的成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (1)

1.一种三七组培苗的培育方法，其特征在于：该方法以三年生的三七花梗为材料，建立三七植物组织快繁体系，通过以下步骤进行：
步骤(1)：三七外植体无菌处理，剪取三七花梗，用自来水冲洗后，用酒精和升汞消毒处理，获得无菌花梗；无菌花梗外植体的获取具体过程如下：剪取花梗用自来水冲洗备用，冲洗时间为2小时，然后在无菌室内酒精浸泡消毒处理，酒精浓度为75％，浸泡消毒时间为30秒，再用无菌水冲洗，冲洗次数为5次，接着用升汞浸泡消毒处理，升汞浓度为0.1％，浸泡消毒处理时间为6～12分钟，最后用无菌水冲洗后备用，冲洗次数为5次；
步骤(2)：三七体细胞胚胎诱导，将步骤(1)中获得的无菌花梗接种到诱导培养基上，培养28- 32天，得到三七体细胞胚胎；所述诱导培养基为：以1/4MS为基础培养基，附加0.2～0.3mg/L 6-BA，0.3～0.6mg/L KT，0.6～1.0mg/L 2,4-D， pH为6.4-6.8，培育方式为暗培育；
步骤(3)：三七体细胞胚胎增殖：步骤(2)中获得的三七体细胞胚胎接种在增殖培养基上，培养28- 32天，获得大量的三七体细胞胚胎；所述增殖培养基为：以1/2MS为基础培养基，附加0.3～0.9mg/L 6-BA，0.2～0.6mg/L KT，0.2～1.0mg/L 2,4-D和抗褐化剂， pH为6.4-6.8，培育方式为暗培育，其中，抗褐化剂为活性炭0.5g/L或PVP 2.0g/L；
步骤(4)：三七体细胞胚胎分化成苗及壮苗，将步骤(3)中获得的三七体细胞胚胎接种在分化成苗及壮苗培养基上，每天光照10-14小时，光照强度为1200-1800LX，培养75-85天，至体细胞胚胎分化出根、茎、叶，形成完整的三七组培苗，并实现壮苗培养；所述分化成苗及壮苗培养基为：以1/8MS为基础培养基，附加0.2～1.5mg/L 6-BA，1.0～2.5mg/L IBA，0.2～1.0mg/L GA3和50g/L香蕉，pH为6.4-6.8；
以上培养基中的琼脂添加量为6g/L，蔗糖添加为20g/L，培养温度控制在27±2℃，培养室空气相对湿度控制在65～75％。
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