CN108522277B

CN108522277B - 一种“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法

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Publication number: CN108522277B
Application number: CN201810202606.1A
Authority: CN
Inventors: 张丽敏; 席培宇; 彭熙; 李安定; 蔡国俊; 张建利; 龙秀琴; 王济红
Original assignee: GUIZHOU INSTITUTE OF MOUNTAINOUS RESOURCE
Current assignee: GUIZHOU INSTITUTE OF MOUNTAINOUS RESOURCE
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: CN108522277A

Abstract

一种“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法，该方法包括外植体消毒处理、腋芽初诱导培养、丛生芽继代增殖培养和生根培养4个技术环节，方法以刚萌发15～20天的半木质化带芽茎段为外植体，依次通过抗氧化剂Vc和柠檬酸混合蒸馏水溶液、高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡、消毒的方法将外植体褐变污染率控制在10%以下；最后通过在初诱导和继代增殖培养二阶段的培养基中添加活性炭和聚乙烯吡咯烷酮来吸附有害物质和抑制酚类物质分解，保障丛生芽诱导分化率在95%以上，增值系数9.0以上。在生根培养基中添加蛋白胨，生根率达100%，平均每株分化根系5～8根。本方法简便易行，为该猕猴桃良种种苗工厂化培育技术体系集成提供依据。

Description

一种“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法

技术领域

本发明涉及通过组织培养技术的植物再生，进一步来说，涉及“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法。

背景技术

猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属落叶藤本果树,其果实营养丰富,其维生素含量居各种水果之首；猕猴桃全株均可入药，其根、果实等部位提取物具有抗肿瘤、抗氧化等作用。“红阳”猕猴桃是1989年由四川省苍溪县农业局从中华猕猴桃实生苗中选育出的优系，因其鲜果横剖面沿果心有紫红色线条，呈放射状分布，似太阳光芒四射，故称“红阳猕猴桃”，该品种果实短圆柱形，肉质鲜嫩，果心小，果味浓，品质极佳，总糖含量为13.45％，高出世界流行品种“海沃德”近5％，已成为近10年来国内种植推广面积较大的品种。当前嫁接苗细菌性溃疡病已严重导致产量和品质下降，只有采用组培育苗方法，才能解决该产业致命性的问题。

猕猴桃属植物组培研究报道较多。谢志兵等（2003）认为把组培苗直接接种在吲哚丁酸(IBA)浓度为0.7mg·L^-1的生根培养基中，存活率高且诱导生根效果最好，单株生根数量及根总长均高于其它浓度。郭韩玲等（2008）报道了早金猕猴桃的组培育苗方法，认为在MS培养基中添加6.0mg·L^-16-苄氨基嘌呤(6-BA)和0.4mg·L^-1萘乙酸(NAA)后增殖培养最好，在1/2培养基中添加0.4mg·L^-1IBA后生根率最高。田宏观等对“米良1号”猕猴桃的组培育苗技术研究后发现，带芽茎段在MS+1.0 mg·L^-1玉米素(ZT)上诱导培养最好，外植体可直接分化出丛生芽；成熟茎段出芽早，幼嫩茎段出芽迟，有芽茎段出芽早，无芽茎段出芽迟；MS+1.0 mg·L^-1IBA有较好的诱导生根作用。吕海燕等（2015）对狗枣猕猴桃的组培育苗技术研究也发现，幼嫩带芽茎段虽不能再生形成愈伤组织，但其腋芽能直接萌发，并迅速成苗；带芽茎段最佳取样时间为春季未木质化的嫩枝；腋芽一步成苗培养基配方为：MS＋1.25mg·L^-16-BA＋0.25 mg·L^-1NAA，腋芽萌发率达92.9%，继代周期为30-40d，增值系数可达5.33；最佳生根培养基为：1/2MS＋0.2mg·L^-1NAA，生根率100％，平均根数12.5条。张太奎等（2017）报道了引种品种“Hort16A”猕猴桃离体再生技术，结果表明:外植体在MS+0.05mg·L^-1NAA+0.3mg·L^-1ZT中培养20d后诱导愈伤组织效果最好，诱导率达97.78%；继续培养14d后，不定芽分化率达84.44%；不定芽在MS+1.5mg·L^-1ZT中培养30d后，增殖倍数达3.67；无菌苗在1/2MS+0.7mg·L^-16-BA+0.1g·L^-1活性炭(AC)培养基中生根最佳，生根率98.9%，平均每株生根数7.67根。蔡冬元（2014）报道了长叶猕猴桃的初诱导培养方法，认为:在MS培养基中添加1.0 mg·L^-16-BA和0.1mg·L^-1NAA后有利于带芽茎段初诱导培养，添加0.5 mg·L^-16-BA和0.1mg·L^-1NAA后有利于叶片初诱导培养。吴延军（CN101647393A）公开了毛花猕猴桃的组织培养方法，认为半木质化茎段为最佳外植体，最佳诱导培养基为MS+2.0～5.0 mg·L^-16-BA+0.1～0.5 mg·L^-1NAA，最佳增殖培养基为MS+1.0～5.0mg·L^-16-BA+0.1～0.5mg·L^-1NAA或0.1～0.5 mg·L^-1IBA，生根培养基为MS或1/2MS+1.0g·L^-1AC+0.1～0.5mg·L^-1NAA或0.05～1.0 mg·L^-1IBA。赵兰在中国发明专利申请CN104012410A、CN104012408A、CN104012412A中公开了猕猴桃基生枝的初诱导、继代增殖和生根繁殖的方法，认为在改良后的MS培养基上添加1.0～2.0mg·L^-16-BA、1.0～1.5mg·L^-1激动素(KT)和0.1～0.3mg·L^-1NAA后继代增殖效果最好。软枣猕猴桃组培育苗技术研究报道较多，以茎段、叶块、叶柄、腋芽、茎尖和未成熟胚等作为外植体进行组织培养均有成功报道；在培养基的选择上，主要使用MS培养基，也有学者使用1/2MS培养基；在激素使用方面，多使用细胞分裂素6-BA、ZT、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和生长素IBA、NAA，根据外植体、培养阶段的不同，选择一种或者几种激素组合及相应的浓度；增殖系数5.33～5.8；王振兴（CN105359976A）公开了在非离体条件下诱导软枣猕猴桃形成再生新梢的方法，通过机械损伤茎段产生愈伤组织，然后用4.5mg·L^-1噻苯隆TDZ 溶液浸湿脱脂棉，用脱脂棉覆盖愈伤组织后，诱导分化再生新梢。

“红阳”猕猴桃组培育苗技术有较多报道。邵卫平等（2015）认为用2.5 mg·L^-1赤霉素处理“红阳”猕猴桃种子12h后播种，萌芽率最高;用MS+2.0 mg·L^-16-BA+0.05 mg·L^- ¹NAA，培养刚发芽的种子，可获得实生苗;以带芽茎段为外植体对猕猴桃实生苗进行单株扩繁，可得到基因型相同的株系，可为无菌砧木培养提供参考依据。张琛等（2014）报道了“红阳”猕猴桃初代培养适宜灭菌方法，认为叶片或茎段用75%酒精灭菌45s，0.1%升汞消毒4～6min灭菌效果最好，最适初代培养基为：MS+1.0 mg·L^-16-BA+0.1 mg·L^-1 NAA。石玮等（2015）报道了“红阳”猕猴桃叶片的组培育苗方法，结果表明：MS+0.5mg·L^-1ZT＋0.5mg·L^-12,4-D诱导产生淡黄色疏松的愈伤组织，MS+3.0mg·L^-16-BA＋1.0mg·L^-1NAA诱导产生绿色致密的愈伤组织，愈伤组织诱导率均为100％；在MS+5.0mg·L^-16-BA＋0.5mg·L^-1NAA培养基上愈伤组织的不定芽分化率达到100％；在1/2MS+1.2 mg·L^-1IBA培养基上不定芽生根率为83.3％。唐建民（CN102823498A、CN103493734A）通过调整MS培养基中大量元素种类和浓度，优化激素组合后，筛选出红肉猕猴桃继代增殖培养和生根培养最佳方法，认为在改良后的MS培养基中添5.0mg·L^-16-BA和5.0mg·L^-1NAA有利于继代增殖培养，添加0.45.0mg·L^-1NAA和0.2mg·L^-1IBA有利于生根培养。王珊（CN105123514A）认为在WPM培养基中添加0.5～2.0mg·L^-16-BA、0.1～1.0mg·L^-1NAA、2～5mg·L^-1AC和5～10mg·L^-1Vc为红阳猕猴桃茎段最佳初诱导培养基。玉米素ZT对诱导木本植物腋芽分化丛生芽有显著效果，但价格高达2000多元1g，且高温灭菌后容易变性。本发明专利使用价格低且细胞分裂能力强的TDZ与生长素NAA组合后，建立了“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段腋芽丛生芽诱导、丛生芽继代增殖和生根培养的组培育苗方法，增殖系数可达9.0以上，生根率100%。该方法目前未见报道。

中国专利数据库中涉及猕猴桃组培的专利申请件有数十件，例如200610050251.6号《大籽猕猴桃组培快速繁殖方法》、200810064466.2号《软枣猕猴桃组织培养方法》、ZL200910152973.6号《毛花猕猴桃组培快速繁殖方法》、ZL201310520758.3号《一种中华猕猴桃的组培快繁方法》、201510040096.9号《中华猕猴桃Hort 16A后代优良品系组培苗多倍体诱导方法》、201510199343.X号《一种猕猴桃砧木M9的组培快速育苗方法》、201610547804.2号《一种猕猴桃脱毒组培苗移栽方法》、201710658541.7号《一种软枣猕猴桃花药培养成单倍体植株的方法》、201710889310.7号《一种红华猕猴桃组培种苗的繁育方法》以及201710665376.8号《一种猕猴桃组织培养方法及其应用》等。这些申请件都不属于“红阳”猕猴桃组培育苗，更不是“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法。

发明内容

本发明旨在提供一种能降低“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段污染率、褐变率，提高丛生芽继代增殖效率，降低激素使用成本，程序简便的组培育苗方法，为优化集成“红阳”猕猴桃良种种苗培育提供参考依据。

发明人提供的“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法，包括以下步骤：

（1）外植体消毒：采集刚萌发15～20d的“红阳”猕猴桃半木质化新梢，去掉叶片，取带芽茎段做外植体；冲洗干净后，用3000mg·L^-1维生素C+2000 mg·L^-1柠檬酸蒸馏水溶液浸泡50min，然后用4500 mg·L^-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡40min，用蒸馏水冲洗5次，再用1000 mg·L^-1氯化汞水溶液常规消毒15min，蒸馏水冲洗5次；

（2）植物细胞组织培养各阶段的基本培养基均为：1/2MS+12g·L^-1琼脂+35 g·L^-1蔗糖，pH值6.0；各阶段培养条件为：温度24℃～26℃，光照为1500～2000 Lux，光照时间为12～14h/d。

（3）腋芽初诱导培养：将消毒后的外植体按生长极性竖立接种，诱导腋芽萌发。培养35d后，可萌发9～10个长约1.0cm的丛生芽；培养基配方：基本培养基+2.5g·L^-1AC+1.8 g· L^-1 PVP+2.8 mg·L^-1 TDZ+

0.02～0.04mg·L^-1 NAA。

（4）丛生芽继代增殖培养：用刀片将高度1.0cm以下丛生芽从基部分割成单芽后按极性竖立接种，诱导丛生芽继代增殖；培养40d后，每个单株从基部萌蘖分化出9～12个丛生芽；培养基配方：基本培养基+2.5 g·L^-1AC+1.8g·L^-1 PVP+3.5 mg·L^-1 TDZ+0.01 mg·L^-1NAA。

（5）生根诱导培养：将继代增殖形成的1.5cm高以上丛生芽剪切成单芽后接种于的生根培养基上，诱导生根；培养45d后，100%产生根系，每株5～8根，根长1.0-3.5cm；培养基配方：基本培养基+2 g·L^-1蛋白胨+0.2 mg·L^-1 6-BA+0.2 mg·L^-1IBA+0.9 mg·L^-1 NAA。

上述（3）、（4）二个阶段的基本培养基中均添加2.5g·L^-1AC（活性炭）来吸附外植体分泌的有害物质，添加1.8g·L^-1 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）抑制酚类物质的产生，将褐化率降至10%以下。

本发明的创新点：

本发明提供的“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法，首先通过采用维生素C和柠檬酸混合蒸馏水溶液浸泡，可以显著提高半木质化外植体抗褐变的能力；然后采用高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡杀菌，10%升汞消毒，可将初诱导污染率控制在10%以下。采用细胞分裂活性较强的TDZ与生长素NAA组合后，可直接诱导带芽茎段分化丛生芽，与已报到的“米良1号”猕猴桃和“毛花猕猴桃”组培育苗结果相似，但激素成本仅为已报道使用的玉米素ZT的1/5。本发明方法简便易行，可为“红阳”猕猴桃良种种苗工厂化培育技术体系集成提供参考依据。

具体实施方式

实施例1：

(1)外植体消毒处理：2017年4月，采集刚萌发15d的“红阳”猕猴桃半木质化新梢30条，自来水冲洗后，蒸馏水冲洗5遍，去叶片留带2～3芽茎段；用3000 mg·L^-1维生素C和2000mg·L^-1柠檬酸混合蒸馏水溶液浸泡50min，蒸馏水冲洗5遍；在超净工作台上，用4500 mg·L^-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡40min，蒸馏水冲洗5遍;将带芽茎段剪切成长度1.5cm单芽茎段，再用1000 mg·L^-1氯化汞水溶液消毒15min，蒸馏水冲洗5遍；

（2）植物细胞组织培养各阶段的基本培养基均为：1/2MS+12g·L^-1琼脂+35 g·L^-1蔗糖，pH值6.0；各阶段培养条件为：温度24℃～26℃，光照为1500～2000Lux，光照时间为12～14h/d；

（3）腋芽初诱导培养：将消毒后的外植体按生长极性竖立接种，培养基配方：基本培养基+2.5 g·L^-1AC+1.8 g·L^-1PVP+2.8 mg·L^-1TDZ+0.02 mg·L^-1 NAA；共接种60个，培养10d后，5个褐变死亡，褐化率8.3%；其余55个外植体35d后全部萌发,9个以上长度1.0cm左右带1叶丛生芽;

（4）丛生芽继代增殖培养：用刀片将长度1.0cm以下丛生芽从基部分割成单芽后按生长极性竖立接种，培养基配方：基本培养基+2.5g·L^-1 AC+1.8 g·L^-1 PVP+2.8 mg·L^-1TDZ+0.02 mg·L^-1 NAA。共接种500个，培养40d后，493个分化9～12丛生芽，平均每株分化丛生芽9.3个，分化率98.6%；

（5）生根诱导培养：继代增殖培养55天后，丛生芽平均长度达1.5cm以上，将丛生芽剪切成单芽后接种，培养基配方：基本培养基+2 g·L^-1蛋白胨+0.2 mg·L^-1 6-BA+0.2mg·L^-1 IBA+0.9 mg·L^-1 NAA。共接种4500个，培养45d后，全部产生根系，每株5～8根，根长1.0～3.5cm。

实施例2：

(1)外植体消毒处理：2017年4月，采集刚萌发20天的“红阳”猕猴桃半木质化新梢30条，自来水冲洗后，蒸馏水冲洗5遍，去叶片留带2～3芽茎段；用3000 mg·L^-1维生素C和2000 mg·L^-1柠檬酸混合蒸馏水溶液浸泡50min，蒸馏水冲洗5遍；在超净工作台上，用4500

mg·L^-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡40min，蒸馏水冲洗5遍；将带芽茎段剪切成长度1.5cm的单芽茎段后，再用1000 mg·L^-1氯化汞水溶液消毒15min，蒸馏水冲洗5遍；

（3）腋芽初诱导培养：将消毒后的外植体按生长极性竖立接种，培养基配方：基本培养基+2.5 g·L^-1AC+1.8 g·L^-1PVP+2.8 mg·L^-1TDZ+

0.02 mg·L^-1 NAA；共接种60个，培养10d后，6个褐变死亡，褐化率10.0%；其余54个外植体38d后全部萌发9个以上长度1.0cm左右带1叶丛生芽;

（4）丛生芽继代增殖培养：用刀片将长度1.0cm以下丛生芽从基部分割成单芽后按生长极性竖立接种，培养基配方：基本培养基+2.5 g·L^-1 AC+1.8 g·L^-1 PVP+2.8 mg·L^-1TDZ+0.04 mg·L^-1 NAA，pH值6.0。共接种500个，培养42d后，489个分化9～12丛生芽，平均每株分化丛生芽9.15个，分化率97.8%;

（5）生根诱导培养：继代增殖培养55天后，丛生芽平均长度达1.5cm以上，将丛生芽剪切成单芽后接种；培养基配方：基本培养基+2 g·L^-1蛋白胨+0.2 mg·L^-16-BA+0.2 mg·L^-1 IBA+0.9 mg·L^-1 NAA；共接种4500个，培养45d后，全部产生根系，每株5～8根，根长1.0～3.5cm。

Claims

1.一种“红阳”猕猴桃半木质化带芽茎段的组培育苗方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）外植体消毒：采集刚萌发15～20d的“红阳”猕猴桃半木质化新梢，去掉叶片，取带芽茎段做外植体；冲洗干净后，用3000 mg·L^-1维生素C+2000 mg·L^-1柠檬酸蒸馏水溶液浸泡50min，然后用4500 mg·L^-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡40min，用蒸馏水冲洗5次，再用1000mg·L^-1氯化汞水溶液常规消毒15min，蒸馏水冲洗5次；

（2）确定培养基和培养条件：植物细胞组织培养各阶段的基本培养基均为：1/2MS+12g·L^-1琼脂+ 35g·L^-1蔗糖，pH值6.0；各阶段培养条件为：温度24℃～26℃，光照为1500～2000Lux，光照时间为12～14h/d；

（3）腋芽初诱导培养：将消毒后的外植体按生长极性竖立接种，诱导腋芽萌发；培养35d后，萌发9～10个长约1.0cm的丛生芽；培养基配方：基本培养基+2.5g·L^-1活性炭+1.8 g ·L^-1 聚乙烯吡咯烷酮+2.8 mg·L^-1噻苯隆+0.02～0.04 mg·L^-1萘乙酸；

（4）丛生芽继代增殖培养：用刀片将高度1.0cm以下丛生芽从基部分割成单芽后按极性竖立接种，诱导丛生芽继代增殖；培养40d后，每个单株从基部萌蘖分化出9～12个丛生芽；培养基配方为：基本培养基+2.5g·L^-1活性炭+1.8g·L^-1聚乙烯吡咯烷酮+3.5 mg·L^-1噻苯隆+0.01mg·L^-1萘乙酸；

（5）生根诱导培养：将继代增殖形成的1.5cm高以上丛生芽剪切成单芽后接种于生根培养基上，诱导生根；培养45d后，100%产生根系，每株5～8根，根长1.0-3.5cm；培养基配方：基本培养基+2g·L^-1蛋白胨+0.2 mg·L^-1 6-苄氨基嘌呤+0.2 mg·L^-1吲哚丁酸+0.9 mg·L^-1萘乙酸。