CN115088623B - 一种诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法 - Google Patents

一种诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法，属于植物组织培养快繁技术领域，是将蓖麻无菌苗的子叶节培养在加有0.2‑1.0mg/L 6‑BA的MS培养基进行暗培养后，转入光下继续培养，发现随着6‑BA浓度的提高，可以促进蓖麻子叶节丛芽的发生。将再生苗带有腋芽的茎段再次转入6‑BA的上述培养基之后，可以促进茎段芽的高频发生。将诱导出的幼苗转接入含有0.3mg/L IBA的1/2MS培养基，可以诱导出根，完成植株的再生。本发明无需特殊的培养设备，处理步骤简单，较短时间就可以获得大量无菌苗，为蓖麻遗传转化体系的建立提供了前提技术。

Description

一种诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法
技术领域
本发明属于植物组织培养快繁技术领域，具体涉及一种诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法,能促进蓖麻子叶节在短时间内获得大量无菌苗，主要用于优质无菌蓖麻种苗的培育，和蓖麻遗传转化体系的建立，可以推广于蓖麻种植的应用领域，和提高蓖麻产量和蓖麻种子油脂含量，以及抗病性等领域的研究开发。
背景技术
蓖麻(Ricinuscommunis)是大戟科(Euphorbiaceae)的一种双子叶植物。它起源于地中海盆地东南、东非和印度，但也广泛的分布于热带地区，现在也作为观赏植物和经济作物在世界各地有广泛种植。蓖麻种子富含油脂，含油量约为40％至60％，而且蓖麻油的流动性很强，凝固点较低，在-22℃下仍可流动，被大量用作航空航天的高级润滑剂和动力皮带的保护油，还可以用于制备生物柴油，媒染剂、药物等，用途非常广泛。同时蓖麻种子中还具有抗肿瘤活性的蓖麻毒蛋白。蓖麻综合利用价值极高，对蓖麻的需求量也日益增大，对蓖麻进行生物工程遗传改良也逐渐被重视起来。
目前蓖麻种植业还存在诸多问题，品种比较混杂、种子的繁殖体系还不够健全，使蓖麻的种植效益较低。同时蓖麻的产量，含油量和抗病性也需要提高，而组织培养和遗传转化技术，是创制优质种质资源的重要途径。蓖麻稳定高效组培体系的建立是改良种质，快速扩繁种苗和遗传转化体系建立的重要前提。
蓖麻组织培养体系的建立自上世纪80年代便开始摸索，已经取得了一定的进展。如丁兰等以蓖麻种子培养的无菌苗作为外植体，研究了上胚轴、下胚轴、子叶和根的脱分化能力和再分化能力，以及不同种类和浓度激素对芽增殖和生根的影响。王等以离体培养蓖麻的营养芽，得到了再生植株，发现在培养基中添加适量VC可以减轻褐化现象，并发现同时使用IAA和IBA，可以促进生根。Sujatha用芽尖和胚轴为外植体建立了较高效的蓖麻离体再生体系，并尝试先使用TDZ培养基，一段时间后将外植体转到6-BA培养基上，获得了较高的芽增殖率，但是由于蓖麻自身再生能力与增殖能力极低，在培养中易出现褐化、转化率低以及成活率低等问题，蓖麻组培体系和遗传转化体系一直难以成功应用。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种快速高效获得大量优质无菌苗的诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法，包括以下步骤：
步骤1：蓖麻无菌苗的培养，将经过消毒处理的蓖麻种子播种在1/2MS培养基，待其萌发；
步骤2：丛芽的诱导培养，子叶刚长出后，无菌取出，切取其子叶节转接入预培养基暗培养6天后，取出转接入诱导丛芽培养基，放于光照培养箱继续进行培养，培养至在原子叶节的切口周围有芽点冒出；
还包括再生苗的生根培养，诱导获得的蓖麻幼苗生长到至少有2片真叶，切取下来转入生根培养基，放入光照培养箱进行生根培养；
所述预培养基、诱导丛芽培养基和生根培养基的基础培养基均为MS培养基。
所述MS培养基的配方为：琼脂浓度为7.5mg/L，蔗糖浓度为30g/L，无糖无琼脂MS粉4.41g/L。
其中，所述预培养基和诱导丛芽培养基均为加入6-BA(细胞分裂素6-苄氨基嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、蓖麻胚乳研磨液、AgNO3、Vc、SNP的MS培养基；所述生根培养基为含有IBA的1/2MS培养基。
优选地，所述预培养基和诱导丛芽培养基均设有多个激素浓度组合，包括(1)0.2mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA、5g/L蓖麻胚乳研磨液、30μmol/LSNP、1mg/L AgNO3和200mg/LVc；(2)0.4mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA、5g/L蓖麻胚乳研磨液、30μmol/LSNP、1mg/L AgNO3和200mg/L Vc；(3)0.6mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA、5g/L蓖麻胚乳研磨液、30μmol/LSNP、1mg/LAgNO3和200mg/L Vc；(4)0.8mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA、5g/L蓖麻胚乳研磨液、30μmol/LSNP、1mg/L AgNO3和200mg/L Vc；(5)1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA、5g/L蓖麻胚乳研磨液、30μmol/LSNP、1mg/L AgNO3和200mg/L Vc。
优选地，所述预培养基为加入0.8mg/L 6-BA的MS培养基；所述诱导丛芽培养基为加入0.8mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA、5g/L蓖麻胚乳研磨液、30μmol/LSNP、1mg/L AgNO3和200mg/L Vc的MS培养基；所述生根培养基为含有0.3mg/L IBA的1/2MS培养基。
在所述步骤1中，将蓖麻种子用温水浸泡约1h，其间换一次水，浸泡后，采用95％乙醇浸泡2min后转入超净台，用无菌水洗5次之后，在平皿中剥去种皮，放入无菌水中浸泡待处理，剥好的种子用20％NaClO溶液浸泡15min，再用无菌水洗5-6次后，播种于玻璃培养瓶内的1/2MS培养基上，16L/8D(16hlight/8h dark)，光照30μmol·m-2·s-1，21℃培养箱中培养至萌发；
在所述步骤2中，将萌发到2片子叶刚展开时的蓖麻幼苗(下胚轴伸长到2cm左右时)，在超净台中从培养瓶取出，置于平皿上，用解剖刀切取子叶节转接入预培养基，白天21℃，晚上19℃(12h 21℃，12h 19℃)条件下暗培养6天后，取出转接入诱导丛芽培养基，放于光照培养箱继续进行培养(16hlight/8h dark，24℃ Light/21℃ Dark)，光照强度为30μmol/m2·s，白天温度为24℃，晚上温度为21℃条件下，再继续培养15天左右，在原子叶节的切口周围有芽点冒出(其中白天和晚上各占12h)。
在丛芽的诱导培养后，还可进行扩繁芽：将丛生芽在超净台中取出，将茎基部切出，转入含有0.02mg/L IBA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、5g/L蓖麻胚乳研磨液和7.5g/L琼脂，6-BA浓度分别为0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L的MS培养基中，同诱导培养温度光照条件下继代培养20天左右。
优选地，1.0mg/L 6-BA中扩繁出的丛芽最多。
上述培养基需要调节pH至5.9-6.1，121℃高温灭菌20min后待用(冷却后加入激素)。
植物激素6-BA和IBA均先配制成1mg/ml母液，具体的配制方法如下：分别称取50mg6-BA和IBA，放入烧杯中，加入2ml左右0.1M NaOH，充分溶解后，加水，待体系均匀后定容至50ml，用0.22μm的滤膜过滤除菌，备用。
6-BA的具体作用浓度分别是0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L。IBA的具体作用浓度在诱导芽时是0.02mg/L,诱导生根时是0.3mg/L。
原初转接的蓖麻的子叶节的数量每个培养瓶是4-5个，长度为0.5cm左右，所述测定分析指标是在暗培养6天后和转入光培养条件下第7天、第15天、第21天、第30天都进行观察，具体包括：
(1)生长的状态：不同时间点外植体和新生叶的颜色和大小形态；
(2)出芽的时间和部位：是在子叶节上端，还是腋芽；
(3)出芽的数量：计数不同部分在不同时间点出芽的数量；
(4)真叶的生长情况：记录出真叶的时间和数量；
(5)生根情况分析：记录生根的时间和数量。
所述技术共重复3次，每次每个激素浓度组合都有6个重复。
由于采用上述技术方案，本发明的优点和积极效果：
本发明以汾篦10号为实验材料，建立了蓖麻丛芽高频再生体系，可以短期获得大批优质种苗。
本发明采用不同浓度6-BA对蓖麻子叶节进行暗处理6天，发现在0.6，0.8和1.0mg/L 6-BA浓度的作用下，蓖麻子叶节诱导生芽的数量较多，与对照0.2mg/L6-BA，0.4mg/L6-BA相比显示，在0.6mg/L，0.8mg/L和1.0mg/L 6-BA的作用下，诱导获得的芽的数量每个子叶节约为4-8个，0.8mg/L6-BA诱导获得的芽最多；
而且黑暗预处理子叶节处长出的苗的状态都好于直接放在光照条件下培养的状态，颜色翠绿，株高略高；将再生出来的子叶节切口周围，腋芽处的芽，以及顶芽在约1个月后分别转接入新培养基继续进行芽诱导培养时，发现随着6-BA作用浓度的增加，再生芽再分化增殖出的芽的数量会进一步增多；再生芽再次转入扩繁培养基中，1.0mg/L6-BA扩繁出的芽最多；再生芽转入生根培养基4天后，0.3mg/L IBA培养基中发现有部分苗就开始生根，8-10天时大部分苗都可以诱导出短粗的根。上述数据说明在黑暗条件下，0.6-1.0mg/L 6-BA的作用可以有效促进出芽的数量，不仅新生芽的数量较多，而且由新生芽来的苗的长势良好，能在短期内快速生根。表明6-BA结合短时间黑暗预处理子叶节，是诱导子叶节高频出芽的有效方法。
本发明无需特殊的培养设备，处理步骤简单，使具有非常可观经济效益的栽培作物蓖麻能在最容易培养的条件下短时间获得大量优质无菌种苗，解决了蓖麻丛芽发生率低，不易成活的难题，后期培养可以减少化学农药的施加，一定程度增加经济收入。通过组培技术为利用蓖麻子叶节短期扩繁优质蓖麻种苗提供了一种简单快速的实用技术，同时已经建立的丛芽再生途径可以为遗传转化技术的摸索提供重要基础。
附图说明
下面通过参考附图并结合实例具体地描述本发明，本发明的优点和实现方式将会更加明显，其中附图所示内容仅用于对本发明的解释说明，而不构成对本发明的任何意义上的限制，在附图中：
图1是没有经过暗处理，一直光下培养30天的由子叶节诱导获得的再生苗，从左至右分别是0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L 6-BA诱导处理获得再生苗；
图2是暗处理6天之后转入光下24天的由子叶节诱导获得的再生苗，从左至右分别是对照，0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L，0.8mg/L 6-BA；
图3是单个子叶节由暗培养6天后转光下培养诱导24天获得的再生苗，从左至右分别是对照，0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L，0.8mg/L 6-BA诱导培养；
图4是对照(没有6-BA处理，没有经过暗培养)的茎尖和茎基部切段的二次诱导芽的培养，从左至右分别是培养1天，18天，30天；
图5是0.4mg/L 6-BA没有黑暗预处理的再生苗的茎尖和茎基部切段的二次诱导芽的培养，从左至右分别是培养6天，28天；
图6是0.4mg/L 6-BA 0.01mg/L IAA黑暗预处理的再生苗的茎尖和茎基部切段的二次诱导芽的培养，从左至右分别是培养28天，34天；
图7是0.6mg/L 6-BA 0.02mg/L IBA没有暗处理的再生苗的茎尖和茎基部切段转入0.6mg/L 6-BA 0.02mg/L IBA的二次诱导芽的培养，从左至右分别是培养13天，28天，32天；
图8是0.6 6-BA暗培养预处理6天后获得的再生苗的茎尖和茎基部切段转入0.6mg/L 6-BA 0.02mg/L IBA的二次诱导芽的培养，从左至右分别是培养18天，26天，30天；
图9是0.6mg/L 6-BA 0.02mg/L IBA黑暗预处理6天后的再生苗的茎尖和茎基部切段转入0.6mg/L 6-BA 0.02mg/L IBA的二次诱导芽的培养，从左至右分别是培养20天，34天；
图10是0.8mg/L 6-BA 0.02mg/L IBA黑暗预处理6天后的再生苗的茎尖和茎基部切段转入0.8mg/L 6-BA，0.02mg/L IBA的激素配比条件下二次诱导芽1个月后，再次切取茎基部转入1.0mg/L 6-BA，0.02mg/L IBA的三次诱导扩繁芽；
图11是再生苗的生根培养，左右分别为转入生根培养基16天的侧面苗和下部根；
图12是蓖麻子叶节诱导丛芽的再生过程，萌发中的种子-------获得下胚轴和胚根------切取子叶节进行暗培养--------暗培养6天的子叶节------转入光培养约20天的获得丛芽-------切取丛芽基部继续进行光培养约15天获得更多芽点。
具体实施方式
下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明：
如图12所示，一种诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法，包括以下步骤：
蓖麻无菌苗的培养：
将保存在冰箱冷藏室的汾蓖10号种子取出，用温水浸泡约1h，其间换一次水，浸泡后，采用95％乙醇浸泡2min后转入超净台，用无菌水洗5次之后，在平皿中剥去种皮，放入无菌水中浸泡待处理，剥好的种子用20％NaClO溶液浸泡15min，再用无菌水洗5-6次后，播种于玻璃培养瓶内的1/2MS培养基上，16L/8D，光照30μmol·m-2·s-1，21℃培养箱中培养至萌发；
丛芽的诱导培养：
待上述无菌苗培养而来的种子萌发至子叶刚开始顶出，在操净工作台酒精灯旁取出，切取约0.5cm左右的子叶节，转接入下述不同的实施案例中进行诱导生芽培养。
实施例1：
1.不加生长素，只加不同浓度6-BA的培养基中光培养条件下诱导生芽，和再生芽的二次诱导培养：
将发芽约5-7天的幼苗子叶节在超净台取出，在平皿中切取子叶节，接入含有1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、6-BA浓度分别为0mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L和0.6mg/L，5g/L蓖麻胚乳研磨液，7.5g/L琼脂的MS培养基中，每个培养瓶4-5个。转入16L/8D光周期，光照约30μmol·m-2·s-1，白天温度为24℃，晚上温度为21℃条件下光照培养基继续培养15-30天。
实验发现对照，即不加6-BA的培养基中培养的子叶节而来的幼苗较高，但是茎秆细，叶片大而薄，在腋芽几乎没有芽点；加有6-BA培养基中的植株茎较粗，较短，茎叶较黄，顶芽饱满，较大，在叶腋处可见有少数腋芽突起伸长，随着6-BA浓度增加，芽点依次增多；其中6-BA浓度为0.6mg/L时，最多可见有3-4个，如图1和图4所示。
2.继代：将上述幼苗的顶芽、腋芽、子叶节膨大的基部分别切出，转接入0.6mg/L6-BA、0.02mg/L IBA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、7.5g/L琼脂、5g/L蓖麻胚乳研磨液的MS培养基中，同样温度光照条件下继续培养10天左右，发现原来的子叶较快黄化，在原茎基部腋芽处可诱导分化出芽，而且随着6-BA浓度增加，芽的数量有所增加。当6-BA诱导浓度为0.4mg/L时，最多可见有5个芽左右，如图5所示。
实施例2：
1.不加生长素，只加不同浓度6-BA暗培养6天后，转光下诱导生芽和再生芽的二次诱导培养：
将发芽约5-7天的幼苗子叶节在超净台取出，在平皿中将子叶节切下，接入1mg/LAgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、7.5g/L琼脂、6-BA分别为0mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L和0.8mg/L的MS培养基中，每个培养瓶4-5个。在白天21℃，晚上19℃条件下暗培养6天后转入16L/8D光周期，光照约30μmol·m-2·s-1，白天温度为24℃，晚上温度为21℃条件下的光照培养箱中继续培养15-30天。
发现对照不加6-BA的培养基中植株较高，但是茎秆细，叶片大而薄，在腋芽几乎没有芽点；6-BA 0.4mg/L、0.6mg/L培养基中的植株茎较粗，较短，叶片颜色较绿，顶芽饱满，较大，在叶腋处可见有腋芽，而且随着6-BA浓度的增加，长出的芽点依次增多，如图2和3所示。
2.继代：将上述由子叶节诱导出的小幼苗的顶芽、腋芽、子叶节膨大的基部分别切出，转接入6-BA 0.6mg/L、IBA 0.02mg/L、AgNO3 1mg/L、Vc 200mg/L、SNP 30μmol/L、琼脂7.5g/L、蓖麻胚乳研磨液5g/L的MS培养基中，同样温度光照条件下继代培养10天左右，发现能够诱导出较多丛生芽，当6-BA浓度为0.6时，最多可见有6个，如图8。
实施例3：
1.同时添加不同浓度6-BA和0.02mg/L IBA暗培养6天后，转入光下培养培养获得再生苗的子叶节诱导生芽，和再生芽的二次诱导：
将发芽约5-7天的幼苗子叶节在超净台取出，在平皿中切取0.5-1cm的子叶节，转接入含有0.02mg/L IBA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、6-BA分别为0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L和0.8mg/L，以及7.5g/L琼脂的MS培养基中，每个培养瓶转接4-5株。在白天21℃，晚上19℃条件下暗培养6天后转入光周期为16L/8D，光照强度约为30μmol·m-2·s-1，白天温度为24℃，晚上温度为21℃条件下继续培养15-30天。同时添加不同浓度6-BA和0.02mg/L IBA的条件下，在幼苗茎的叶腋和顶芽出均可诱导出较多顶芽、腋芽。
2.继代：将上述由子叶节诱导出的小幼苗的顶芽、腋芽、膨大的茎基部分别切出，接入0.6mg/L 6-BA、0.01mg/L IAA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、5g/L蓖麻胚乳研磨液和7.5g/L琼脂的MS培养基中，同样温度光照条件下继代培养10天左右，发现以腋芽和膨大的颈部为外植体虽然也能够诱导出丛芽，但是与当0.6mg/L或0.8mg/L 6-BA，同时添加0.02mg/L IBA浓度相比，茎同样粗，但是丛芽数量较少，如图6所示为0.4mg/L 6-BA和IAA暗培养6天后，由膨大的茎基部诱导出的丛芽大多为4个。
实施例4：
1.同时添加0.02mg/L IBA，不同浓度6-BA直接光下培养获得幼苗的子叶节诱导生芽，和再生芽的二次诱导培养：
将发芽约5-7天的幼苗子叶节在超净台取出，在平皿中切取子叶节，接入IBA0.02mg/L、AgNO3 1mg/L、Vc 200mg/L、SNP 30μmol/L、琼脂7.5g/L、6-BA分别为0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L的MS培养基中，每个培养瓶4-5株。在白天21℃，晚上19℃条件下培养箱暗培养6天后，转入16L/8D光周期，光照约为30μmol·m-2·s-1，白天温度为24℃，晚上温度为21℃条件下培养箱继续培养15-30天。
在本实施例不同浓度6-BA培养条件下，与单独只有6-BA的作用情况下(实施例1)相比，同样没有黑暗处理的由子叶节而来的幼苗株高较高，茎叶较黄，发现在叶腋部位均可诱导出数量不等的腋芽。
2.继代：将上述由子叶节诱导出的小幼苗的顶芽、腋芽、膨大的茎基部分别切出，接入0.6mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、5g/L蓖麻胚乳研磨液和7.5g/L琼脂的MS培养基中，同样温度光照条件下继代培养10天左右，发现在同时添加0.02mg/L IBA的条件下，与单独6-BA的作用情况下相比，同样发现转接入新的再次诱导芽的培养基后，原来幼苗茎叶很快较黄，但是同样能够诱导出较多丛芽，当6-BA浓度为0.6mg/L时，可见有5-6个左右，如图7。
实施例5：
1.同时添加不同浓度6-BA和0.02mg/L IBA暗培养6天后，转入光下培养培养获得再生苗的子叶节诱导生芽，和再生芽的二次诱导：
将发芽约5-7天的幼苗子叶节在超净台取出，在平皿中切取0.5-1cm的子叶节，转接入含有0.02mg/L IBA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、6-BA分别为0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L和0.8mg/L，以及7.5g/L琼脂的MS培养基中，每个培养瓶转接4-5株。在白天21℃，晚上19℃条件下暗培养6天后，转入光周期为16L/8D，光照强度约为30μmol·m-2·s-1，白天温度为24℃，晚上温度为21℃条件下继续培养15-30天。同时添加不同浓度6-BA和0.02mg/L IBA的条件下，整个幼苗较矮小较绿，在幼苗茎的叶腋和顶芽处均可诱导出较多顶芽和腋芽。
2.继代：将上述由子叶节诱导出的小幼苗的顶芽、腋芽、膨大的茎基部分别切出，接入0.6mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、5g/L蓖麻胚乳研磨液和7.5g/L琼脂的MS培养基中，同样温度光照条件下继代培养10天左右，发现以腋芽和膨大的颈部为外植体能够诱导出更多丛生芽，而且叶片颜色深绿，状态最佳。当6-BA浓度为0.6和或0.8mg/L时，最多可见有15个左右丛芽，如图9所示。
实施例6：
1.同时添加不同浓度6-BA和0.02mg/L IBA暗培养6天后，转入光下培养培养获得再生苗的子叶节诱导生芽，和再生芽的二次诱导、三次扩繁：
将发芽约5-7天的幼苗子叶节在超净台取出，在平皿中切取0.5-1cm的子叶节，转接入含有0.02mg/L IBA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、6-BA分别为0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L和0.8mg/L，以及7.5g/L琼脂的MS培养基中，每个培养瓶转接4-5株。在白天21℃，晚上19℃条件下暗培养6天后，转入光周期为16L/8D，光照强度约为30μmol·m-2·s-1，21℃下继续培养15-30天。同时添加不同浓度6-BA和0.02mg/L IBA的条件下，整个幼苗较矮小较绿，在幼苗茎的叶腋和顶芽处均可诱导出较多芽点。
2.继代：将上述由子叶节诱导出的小幼苗的顶芽、腋芽、膨大的茎基部分别切出，接入0.8mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、5g/L蓖麻胚乳研磨液和7.5g/L琼脂的MS培养基中，同样温度光照条件下继代培养10天左右，发现以腋芽和膨大的颈部为外植体能够诱导出更多丛生芽，而且叶片颜色深绿，状态最佳。
3.扩繁芽：继代一个月后，将丛生芽在超净台中取出，在平皿中将茎基部切出，转入含有0.02mg/L IBA、1mg/L AgNO3、200mg/L Vc、30μmol/L SNP、5g/L蓖麻胚乳研磨液和7.5g/L琼脂，6-BA浓度分别为0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L的MS培养基中，同样温度光照条件下继代培养20天左右，1.0mg/L 6-BA中扩繁出的丛芽最多，最多可见有15个左右丛芽，如图10所示。
再生苗的生根培养：(0.8mg/L 6-BA暗培养预处理6天后获得的再生苗的茎尖和茎基部切段转入0.8mg/L 6-BA 0.02IBA的二次诱导芽的培养)
将幼苗培养到有至少2片真叶时，在操净工作台，从培养瓶中取出，切取长约为2-3cm的小幼苗，转接入加有0.3mg/L IBA，5g/L蓖麻胚乳研磨液和6.5g/L琼脂的MS培养基中，转入光周期为16L/8D，光照强度约为30μmol·m-2·s-1，温度为21℃的培养箱中进行生根培养，培养约16天左右时可见又粗又壮的根系生出，如图11所示。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (2)

1.一种诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：蓖麻无菌苗的培养，将经过消毒处理的蓖麻种子播种在1/2MS培养基，待其萌发；
具体为将蓖麻种子用温水浸泡1h，其间换一次水，浸泡后，采用95%乙醇浸泡2min后转入超净台，用无菌水洗5次之后，在平皿中剥去种皮，放入无菌水中浸泡待处理，剥好的种子用20% NaClO溶液浸泡15min，再用无菌水洗5-6次后，播种于玻璃培养瓶内的1/2 MS培养基上，16L/8D，光照30μmol·m-2·s-1，21℃培养箱中培养至萌发；
步骤2：丛芽的诱导培养，子叶刚长出后，无菌取出，切取其子叶节转接入预培养基暗培养6天后，取出转接入诱导丛芽培养基，放于光照培养箱继续进行培养，培养至在原子叶节的切口周围有芽点冒出；
具体为将萌发到2片子叶刚展开时的蓖麻幼苗，在超净台中从培养瓶取出，置于平皿上，用解剖刀切取子叶节转接入预培养基，白天21ºC，晚上19ºC条件下暗培养6天后，取出转接入诱导丛芽培养基，放于光照培养箱继续进行培养，光照强度为30µmol/m2·s，白天温度为24ºC，晚上温度为21ºC条件下，再继续培养15天，在原子叶节的切口周围有芽点冒出；
还包括再生苗的生根培养，诱导获得的蓖麻幼苗生长到至少有2片真叶，切取下来转入生根培养基，放入光照培养箱进行生根培养；
所述预培养基为加入0.8mg/L 6-BA的MS培养基；所述诱导丛芽培养基为加入0.8mg/L6-BA、0.02mg/LIBA、5g/L蓖麻胚乳研磨液、30µmol/L SNP、1mg/L AgNO3和200mg/L Vc的MS培养基；所述生根培养基为含有0.3 mg /L IBA的1/2 MS培养基；
所述MS培养基的配方为：琼脂浓度为7.5g/L，蔗糖浓度为30g/L，无糖无琼脂MS粉4.41g/L。
2. 根据权利要求1所述的诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法，其特征在于：在丛芽的诱导培养后，进行扩繁芽：将丛生芽在超净台中取出，将茎基部切出，转入含有0.02mg/LIBA、1mg/LAgNO3、200mg/LVc、30µmol/LSNP、5g/L蓖麻胚乳研磨液、1.0mg/L 6-BA的MS培养基中，同诱导培养温度光照条件下继代培养20天。
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