CN101138320B - 一种麻风树的高效离体再生方法 - Google Patents

一种麻风树的高效离体再生方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种麻风树的高效离体再生方法，是通过对麻风树无菌苗不同部位为外植体在分化培养基上再生频率的比较，筛选出下胚轴的再生率最高，并以麻风树下胚轴为外植体，分别接种到含有不同激素浓度的MS分化培养基上，筛选出比较理想的诱导再生培养基的配方为MS+1.0mg/L BA+2.0mg/L IAA，且不同生长激素浓度培养基诱导麻风树组培苗生根的结果显示在MS+1.0mg/L IAA培养基上生根效果最好。本发明的麻风树高效离体再生技术的建立可以使其遗传转化工作顺利进行，可获得较高的转化率和转化效果，为麻风树在采用现代生物技术手段育种方面奠定基础。

Description

一种麻风树的高效离体再生方法
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，尤其是一种麻风树的高效离体再生方法。
背景技术
麻风树又名假花生，臭油桐属大戟科的半肉质小乔木或大灌木，全株有毒。茎、叶、树皮均有丰富的白色乳汁，内含大量毒蛋白。种子毒蛋白浓度最高，毒性与蓖麻毒蛋白类似。麻风树种籽经过压榨、脂化作用处理可提取清澈的黄金色液体燃料油，含油量约为60％，超过大豆、油菜等油料作物。这种新型燃油适用于各种柴油发动机，并在硫含量、一氧化碳和铅等的排放量以及其他技术上优于国内零号柴油，是一种低成本高环保燃料。将这种生态燃料油与普通柴油按1∶9的比例混合使用，可大大降低车辆废气中硫和铅的排放，既减少了污染，又降低了车辆的运营成本。德国戴姆勒一克莱斯勒实验室检测证明，麻风树籽油几乎在各个方面都明显胜过传统的柴油，特别是它的硫含量非常低，燃烧时没有气味，几乎不产生碳黑。随着我国改革开放的不断深入，全球经济一体化的进程形势加大，中国的经济水平进一步提高，人们对能源的需求有增无减。据专家预测，到2010年，世界柴油需求量将从38％增加到70％，届时会出现供给严重不足。这为生物柴油的发展提供了广阔空间。发展生物柴油可促进中国农林产业发展，走出一条农林产品向工业产品转化的富农强农的发展之路。我国是世界石油消费第二大国，开源截流是当务之急。从开源上讲，就是要多元化，除了开发国内、国外地下石油资源外，开发生物柴油也是一个补充，可见发展麻风树前景广阔。
麻风树是一种多年生灌木或乔木，耐旱性强，对土攘肥力和湿度要求不高，环境适应能力强，可以种植在其他植物不易生长的土地上，大面积推广可以使贫膺的土地重新变得肥沃，是干旱地区理想的造林树种，具有较高的经济价值和环保价值。由于我国地域辽阔，要想实现麻风树在更大范围进行推广，还要对其性状进行相应的改造，如我国有大面积的盐碱地，如果能够种植如麻风树类的经济植物意义重大，因此通过育种技术增加麻风树的多种生物学特性将有极其重要的意义。
提高转化效率一直是植物遗传转化研究的一个重要目标。为了提高植物的遗产转化效率，研究者们不断探索有利条件。植物遗传转化研究是根据植物细胞的全能性，运用多种现代分子生物学技术，对植物加以改造。因此，农杆菌介导的转化首先是要有高的再生率，其次是有效的抗性筛选标记或方法，有强的启动子和高效表达的载体等。但是，目前植物的遗传转化研究还存在许多问题，主要为转化效率低。转化基因植物出现以来，转化效率低是多种植物遗传转化遇到的困难，如基因枪法重复性差，单子叶植物不易被农杆菌侵染，用于筛选转化材料的抗生素抑制材料的再生等。因此建立高效的转化系统仍然是该领域的主要任务。而建立高效的转化系统的关键步骤就是提高受体的外植体的离体再生率。
由于麻风树近年才被人们重视，因此目前我国在麻风树育种方面刚刚开始，由于麻风树多为野生状态，遗传资源简单，又因其为木本植物，采用常规育种来改变其遗传性状相当困难。因此采用现代生物技术，如基因转化等手段来辅助育种必然成为首选。目前国际一些发达国家已经开始着手进行对麻风树的分子水平育种工作。由于提高转化效率的关键步骤就是提高受体的外植体的离体再生率，因此麻风树的高效离体再生技术成为研究的重要课题。
发明内容
本发明的目的就是要通过组织培养技术提供一种麻风树的高效离体再生方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种麻风树的高效离体再生方法的步骤是：
(1).挑取饱满的麻风树种子，经消毒处理后，剥去胚乳，将胚接种在MS培养基上萌发，得到无菌苗；
(2).切取无菌苗下胚轴接种到MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA的分化培养基上诱导出再生的芽；
(3).将下胚轴再生的芽接种到MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA的分化培养基上继代，进行增粗培养，得到长势粗壮的麻风树再生苗；
(4).将长势粗壮的麻风树再生苗接种到MS+1.0mg/LIAA培养基上诱导生根；
(5).待麻风树再生苗根长到2～3cm时进行移栽，即完成麻风树的离体再生。
而且，对饱满麻风树种子所采用的消毒方法是：将饱满麻风树种子经自来水冲洗后，去掉外种皮，用95％乙醇浸泡30S，0.025％HgCl2溶液表面灭菌15min，无菌水冲洗浸泡3～5次；将胚接种在MS培养基上萌发的培养条件是：温度25℃，光照12h/d，光照光强为1600～2000lx。
而且，将麻风树无菌苗的下胚轴接种到MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA分化培养基进行诱导再生的芽的培养条件是：培养温度控制在25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Ix；且MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA分化培养基需要附加3％蔗糖、0.7％琼脂，并调至pH5.8。
而且，将下胚轴再生的芽接种到MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA的分化培养基上继代并进行增粗培养的条件是：温度控制在25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Ix。
而且，将增粗培养的麻风树再生苗接种到MS+1.0mg/L IAA培养基上诱导生根所需要的培养条件是：培养温度控制在25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Ix，且该培养基中需要附加2％蔗糖、0.7％琼脂，并调至pH5.8。
本发明的优点及有益效果是：
1.本发明的麻风树高效离体再生技术的建立可以使其遗传转化工作顺利进行，获得较高的转化率和转化效果，因此本研究将为麻风树在采用现代生物技术手段育种方面奠定基础。
2.本发明通过对麻风树无菌苗不同部位为外植体在分化培养基上再生频率的比较，筛选出下胚轴的再生率最高；以麻风树下胚轴为外植体，分别接种到含有不同激素浓度的MS分化培养基上，筛选出比较理想的诱导再生培养基的配方为MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA；不同生长激素浓度培养基诱导麻风树组培苗生根的结果显示在MS+1.0mg/L IAA培养基上生根效果最好。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明所采用的试验设备如下：
超净工作台；光照培养箱；医用高压消毒锅；冰箱；微波炉；电子天平；PH值计；温度计；移液器；酒精灯；镊子；剪子；解剖刀；三角瓶；烧杯；量筒；玻璃棒；培养皿；容量瓶；滤纸；营养钵；摇床。
本发明所采用的试验试剂如下：
MS培养基；6-BA试剂；NAA试剂；蔗糖；琼脂粉；蒸馏水；NaOH试剂；IAA试剂。
本发明关于麻风树的高效离体再生方法步骤如下：
(1).挑取饱满的麻风树种子，经自来水冲洗后，去掉外种皮，用95％乙醇浸泡30S，0.025％HgCl2溶液表面灭菌15min，无菌水冲洗浸泡3～5次；剥去胚乳后，将胚接种在MS培养基上萌发，培养条件是：温度25℃，光照12h/d，光照光强为1600～2000lx；取10日龄无菌苗进行各种不同处理的组培试验。
(2).取预培养10日龄麻风树无菌苗的子叶、下胚轴、叶柄等组织部位，用剪刀剪成1～3厘米小块。分别接种到MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA的分化培养基上；附加3％蔗糖、0.7％琼脂，调至pH5.8；将接种的培养基放入培养室，培养温度控制在25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Ix；培养15天调查再生率。
(3).取麻风树下胚轴为外植体，分别接种到含有不同激素浓度的MS分化培养基上，附加3％蔗糖、0.7％琼脂，调至pH5.8；将接种的培养基放入培养室，培养温度控制在25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Ix。培养15天调查再生率。
(4).取长到2～5cm的麻风树再生苗，分别接种到含有不同生长素浓度的MS生根培养基上。附加2％蔗糖、0.7％琼脂，调至pH5.8。将接种了的培养基放入培养室，培养温度控制在25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000Ix。培养15天调查生根数及生根率。
通过下面表1、表2、表3的试验结果及分析评论，来进一步阐述并确认本发明的先进性：
表1  不同组织部位对麻风树再生芽诱导影响的统计结果
  不同组织部位   接种外植体数   再生芽的外植体数     再生率％
  子叶叶柄下胚轴   404040   112840     27.570.0100
分析：从表1可以看出，在以麻风树的子叶、叶柄、下胚轴为外植体对麻风树再生芽诱导的试验中，以下胚轴的再生芽诱导最高，叶柄次之，子叶最低。
表2  不同培养基对麻风树离体再生的影响
    不同培养基配方   接种外植体数     再生芽的外植体数     再生率％
    1.MS+BA0.5mg/L+0.5mg/LIAA2.MS+1.0mg/LBA+1.0mg/LIAA3.MS+2.0mg/LBA+2.0mg/LIAA4.MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LIAA5.MS+2.0mg/LBA+1.0mg/LIAA6.MS+1.0mg/LBA+0.5mg/LIAA7.MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA8.MS+0.5mg/LBA+1.0mg/LIAA9.MS+0.5mg/LBA+2.0mg/LIAA   404040404040404040     26393391224403129     65.097.582.522.530.060.010077.572.5
分析：从表2可以看出采用麻风树下胚轴诱导再生苗效率最高的为MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA与MS+1.0mg/LBA+1.0mg/LIAA，再生率分别为100％和97.5％。
表3  不同培养基对麻风树再生苗生根的影响结果
    不同培养基配方   接种再生芽数     生根的外植体数     生根率％     每个外植体平均生根数
    MS+0.2mg/LNAAMS+0.1mg/L NAAMS+1.0mg/LIAAMS+2.0mg/L/L IAA   40404040     13234040     32.557.5100100     1.22.15.32.9
分析：从表3可以看出，所有4种培养基配方都能够使麻风树组培苗诱导生根，比较高的为MS+1.0mg/LIAA与MS+2.0mg/L/LIAA，生根率都达到100％，说明在诱导麻风树组培苗生根上IAA的效果要好于NAA；每个外植体平均生根数上MS+1.0mg/L IAA好于MS+2.0mg/L/L IAA，说明较低浓度的生长素IAA更易于麻风树组培苗生根；从生根质量来看MS+1.0mg/L IAA诱导的根粗壮且长，而MS+2.0mg/L/L IAA诱导的根比较细小，不利于移栽成活。
结论：
1：外植体的选择对组织培养至关重要，不同外植体的芽诱导率明显不同，这从表1中可以清楚地看出。以麻风树的子叶、叶柄、下胚轴为外植体对麻风树再生芽诱导的试验中，以下胚轴的再生芽诱导最高，叶柄次之，子叶最低。分析原因由于在这些组织部位中分生组织的分布不同，其中生长迅速的子叶、叶柄、下胚轴中均含有较多的分生组织，因此有利于再生芽诱导。同时在对麻风树再生芽诱导的过程中，还发现叶柄作为外植体，在剪取时不容易，经常被剪碎，由于离体的组织太小，不易存活，因此大多数外植体在诱导过程中就已经死掉，从而影响了再生率；下胚轴分布大量分生组织，直接影响再生率，特别在其靠近生长点的一端分生组织最多，因此在其一端会先出现大量的再生芽。
2.从激素的水平来看，当IAA浓度不变，随着6-BA浓度的增大，麻风树下胚轴诱导再生苗效率呈现下降趋势，说明较高浓度的6-BA不利于麻风树下胚轴组织分化；当6-BA浓度不变，随着IAA浓度的增大，麻风树下胚轴诱导再生苗效率呈现上升趋势，说明较高浓度的IAA利于麻风树下胚轴组织分化。但当6-BA浓度过低，IAA浓度过高时，麻风树下胚轴诱导再生苗效率并不是最高，只有在它们的比例适宜时效果才最好。另外比较MS+1.0mg/LBA+2.0m/LIAA与MS+1.0mg/LBA+1.0mg/LIAA，两者的诱导率虽然相近，但前者分化芽的质量明显好于后者，因为MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA诱导出的再生芽经过继代一次就能长成完整植株。而MS+1.0mg/LBA+1.0mg/LIAA很早就能诱导出再生芽，但其很难在很短时间培养成苗，因为由它所诱导出的芽多数为畸形芽，要经过多次继代才能获得完整植株。所以综合以上因素，麻风树下胚轴诱导再生苗效果最好的培养基配方为：MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA。
需要强调的是：由于麻风树的下胚轴诱导再生苗生长势极弱，如果直接用于生根则很难移栽成活，因此对麻风树下胚轴诱导再生苗进行继代培养是十分必要的。一般继代培养所用的培养基仍为分化培养基，只是将再生芽从下胚轴外植体切下，因为这时有外植体存在将不利于再生芽对培养基中营养成分的吸收。

Claims (2)

1.一种麻风树的高效离体再生方法，其特征在于：再生方法的步骤是：
(1).挑取饱满的麻风树种子，经消毒处理后，剥去胚乳，将胚接种在MS培养基上萌发，得到无菌苗；
(2).切取步骤(1)中得到的无菌苗下胚轴接种到MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA的分化培养基上诱导出再生的芽；培养条件是：培养温度控制在25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000lx；且MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA分化培养基需要附加3％蔗糖、0.7％琼脂，并调至pH5.8；
(3).将步骤(2)中得到的下胚轴再生的芽接种到MS+1.0mg/LBA+2.0mg/LIAA的分化培养基上继代，进行增粗培养，得到长势粗壮的麻风树再生苗；培养基需要附加3％蔗糖、0.7％琼脂，并调至pH5.8，将接种的培养基放入培养室，培养温度控制在25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000lx；
(4).将步骤(3)中长势粗壮的麻风树再生苗接种到MS+1.0mg/L IAA培养基上诱导生根；培养条件是：培养温度控制在25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000lx，且该培养基中需要附加2％蔗糖、0.7％琼脂，并调至pH5.8；
(5).待步骤(4)中得到的麻风树再生苗根长到2～3cm时进行移栽，即完成麻风树的离体再生。
2.根据权利要求1所述的一种麻风树的高效离体再生方法，其特征在于：对饱满麻风树种子所采用的消毒方法是：将饱满麻风树种子经自来水冲洗后，去掉外种皮，用95％乙醇浸泡30S，0.025％HgCl2溶液表面灭菌15min，无菌水冲洗浸泡3～5次；将胚接种在MS培养基上萌发的培养条件是：温度25℃，光照12h/d，光照光强为1600～2000lx。 
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