CN101096673A - 利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，该方法是将香蕉ECS在根癌农杆菌菌液中黑暗静置一段时间后，于香蕉ECS液体培养基中进行共培养，共培养结束后，把香蕉ECS直接转移到体胚诱导和发育选择培养基上进行培养，将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光暗交替条件下培养至体胚萌发得到的小苗，最后将小苗转移至生根筛选培养基上，光暗交替条件下进行培养即获得完整的转化植株。本发明改变共培养条件，解决共培养过程中香蕉ECS的褐化问题；同时缩短了获得香蕉转化植株的周期，由于共培养后的香蕉ECS直接转移到体胚诱导和发育培养基上进行筛选培养，获得转化植株的周期缩短了2～3个月。
Description
技术领域
本发明属于香蕉遗传转化技术领域，特别涉及一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法。
背景技术
目前，病虫害日益猖獗，香蕉生产面临着严峻的考验，急需培育品质优良的抗病新品种。由于栽培蕉高度不育、无种子，因此通过传统杂交育种的方法难于获得新品种，而利用基因工程技术获得抗病的转基因香蕉是有效的育种途径之一。建立适合于所有基因型的稳定高效的香蕉基因转化体系是进行香蕉基因工程育种的前提。目前研究表明香蕉ECS是最理想的转化受体，但现有技术存在的不足导致某些香蕉品种无法进行遗传改良，根癌农杆菌介导外源基因转化香蕉胚性悬浮细胞(embryogenic cell suspensions，ECS)的现有技术为：香蕉ECS在根癌农杆菌菌液中浸泡后，转移到添加了乙酰丁香酮的半固体培养基上共培养3或6天，将根癌农杆菌侵染后的香蕉ECS接种到添加了相应抗生素的半固体增殖培养基上进行转化细胞的筛选，培养约2～3个月后，把筛选得到的抗性克隆转移到添加了相应抗生素的体胚诱导和发育培养基上，获得成熟的抗性体胚后转移到体胚萌发培养基上，最后将萌发的体胚转接到添加了相应抗生素的生根培养基上进行生根筛选培养，获得完整的转基因植株。主要存在两方面的不足：(1)某些香蕉品种的ECS与根癌农杆菌在半固体培养基上共培养，极易褐化从而导致转化失败；(2)共培养后，将根癌农杆菌侵染的香蕉ECS先接种到半固体增殖培养基上进行转化细胞的筛选，延长了获得转化植株的周期。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法。该方法可解决共培养过程中香蕉ECS的褐化问题，保证转化的成功，而且可缩短获得转化植株的周期。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，包括如下步骤：
(1)将导入了质粒的根癌农杆菌于YEB固体培养基上划线，26±1℃，黑暗条件下培养，然后挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，26±1℃，振荡培养得到菌液；菌液离心去上清后，用10倍体积的香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基(MLM)重悬菌体，得到工程菌液。
(2)取在香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基(MLM)中继代培养3～5天的香蕉ECS，离心去上清后，每0.5ml PCV(密实体积)ECS加入10ml经步骤(1)获得的工程菌液，26±1℃，黑暗静置2～6小时。
(3)然后加入香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基(MLM)共培养，所述共培养条件为：26±1℃，黑暗条件下振荡培养，所述振荡培养条件如下：将培养物于90～120rpm转速下振荡培养168～240小时；或者将培养物先在30～50rpm转速下振荡培养10～14小时，然后再提高转速至90～120rpm，继续培养60～156小时。采用液体培养基和共培养条件组成共培养体系，称之为液体共培养系统。
(4)共培养完成后，将培养物静置去上清，用香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基(MLM)将沉淀稀释10倍，然后将悬浮物均匀铺于体胚诱导和发育选择培养基(EIM)上，26±1℃，黑暗培养3个月，每个月更换一次体胚诱导和发育选择培养基(EIM)。
(5)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光暗交替条件下培养至体胚萌发得到小苗，然后将小苗转移至生根筛选培养基上，光暗交替条件下进行培养可获得完整的转化植株。
所述液体培养基组成为：以MS为基本培养基，添加1mgl-1生物素、100mgl-1谷氨酰胺、100mgl-1麦芽提取物、1mgl-1 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和45gl-1蔗糖，高压灭菌前pH为5.3。
所述体胚诱导和发育选择培养基组成为：SH大量元素，SH微量元素，MS维生素，添加1mgl-1生物素，100mgl-1谷氨酰胺，100mgl-1麦芽提取物，230mgl-1脯氨酸，0.2mgl-1NAA(萘乙酸)，0.1mgl-1激动素，45gl-1蔗糖，10gl-1乳糖，3gl-1gelrite，500mg l-1先锋霉素和50～100mgl-1的相应的筛选抗生素，高压灭菌前pH为5.3；所述抗生素根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定，如卡那霉素、geneticin或潮霉素等。
为了更好地实现本发明，所述香蕉包括贡蕉、龙芽蕉或巴西香蕉等。
所述质粒为pCAMBIA2301。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)改变共培养条件，解决共培养过程中香蕉ECS的褐化问题，保证了转化的成功。
根癌农杆菌介导的基因转化要取得成功，必须保证农杆菌和植物细胞的生长状态均良好。当植物细胞生长较慢就容易造成农杆菌过度生长，从而毒害植物细胞使其褐化死亡，导致转化失败。本发明用液体共培养系统代替现有技术中的半固体共培养系统，由于液体培养基比半固体培养基更适合香蕉ECS的生长，因此香蕉ECS生长旺盛，不易受农杆菌的毒害而褐化，最后成功获得转化植株。主要原因为：①与半固体培养基相比，植物细胞在液体培养基中与营养成分的接触更加充分，且气体交换更加活跃，不易造成植物细胞缺氧死亡；②培养物分泌的有害物质可以被液体培养基稀释，从而减轻对植物细胞的毒害。
在进行根癌农杆菌介导转化贡蕉ECS的研究表明，采用半固体培养基进行共培养，贡蕉ECS很快褐化，最后筛选不到转化植株；而采用液体共培养系统，共培养过程中贡蕉ECS不褐化，最后筛选到280～490棵转化植株/0.5ml PCV ECS。
(2)缩短了获得香蕉转化植株的周期
由于共培养后的香蕉ECS不需要先转移至增殖培养基上进行2～3个月的细胞筛选培养，而是直接转移到体胚诱导和发育培养基上进行筛选培养，因此获得转化植株的周期缩短了2～3个月。
附图说明
图1为根癌农杆菌介导转化贡蕉ECS研究结果图。
图2为贡蕉转基因抗性植株中gusA的PCR检测图。
图3为贡蕉转基因抗性植株中nptII的PCR检测图。
图4为贡蕉转基因抗性植株中nptII的Southern印迹检测(EcoRI酶切)图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所需培养基：
(1)YEB培养基：含0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％蔗糖和2mM硫酸镁，pH为7.2。固体YEB培养基中添加15gl-1琼脂粉。
(2)香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基(MLM)：以MS为基本培养基，添加1mgl-1生物素，100mgl-1谷氨酰胺，100mgl-1麦芽提取物，1mgl-12，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和45gl-1蔗糖，pH为5.3。
(3)体胚诱导和发育选择培养基(EIM)：SH大量元素，SH微量元素，MS维生素，添加1mgl-1生物素，100mgl-1谷氨酰胺，100mgl-1麦芽提取物，230mgl-1脯氨酸，0.2mgl-1NAA(萘乙酸)，0.1mgl-1激动素，45gl-1蔗糖，10gl-1乳糖，3gl-1gelrite，500mgl-1先锋霉素和50mgl-1geneticin，pH为5.3。
(4)体胚萌发培养基：MS大量元素，MS微量元素，MW维生素，0.5mgl-1BAP(6-苄基氨基嘌呤)，2mgl-1IAA(吲哚乙酸)，30gl-1蔗糖，2gl-1 gelrite和200mgl-1先锋霉素，pH为5.8。
(5)生根筛选培养基：以MS为基本培养基，添加1gl-1活性炭，30gl-1蔗糖，7gl-1琼脂粉，200mgl-1先锋霉素和50mgl-1geneticin，pH为5.8。
实施例1
一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，包括如下步骤：
(1)采用冻融法将质粒pCAMBIA2301(CAMBIA实验室，澳大利亚)转入根癌农杆菌EHA105(CAMBIA实验室，澳大利亚)中。pCAMBIA2301含有gusA报告基因和nptII筛选标记基因。(黄霞.根癌农杆菌介导香蕉(Musaspp.)基因转化的研究.中山大学博士学位论文，2002)
(2)取导入了pCAMBIA2301的EHA105菌种于添加30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的YEB固体培养基上划线，26±1℃，黑暗条件下培养48小时。然后，挑取单菌落接种于含30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的10ml YEB液体培养基中，26±1℃，250rpm振荡培养24小时，用新鲜的YEB培养基稀释5倍后，继续26±1℃，250rpm振荡培养4小时，得到菌液。
(3)菌液于5000rpm离心10分钟，去上清后用10倍体积的香蕉ECS继代培养培养基(MLM)重悬菌体，得到工程菌液。
(4)取MLM中继代培养4天的贡蕉ECS，4000rpm离心10分钟，去上清后，每0.5ml PCV(密实体积)ECS加入10ml经步骤(3)获得的工程菌液，置于100ml锥形瓶中，26±1℃，黑暗静置2小时。香蕉ECS的获得参照魏岳荣等的方法(魏岳荣.贡蕉胚性细胞悬浮系的建立和植株再生.生物工程学报，2005，21(1)：58-65)。
(5)加入10ml新鲜的MLM共培养，共培养条件为：26±1℃，黑暗条件下振荡培养。培养条件为：100rpm振荡培养168小时。
(6)共培养完成后，培养物静置5分钟，去上清，用新鲜的MLM将沉淀稀释10倍，然后取1ml悬浮物均匀铺于下述准备好的EIM上。26±1℃，黑暗培养3个月，每个月更换一次新鲜的EIM。EIM按下述方法准备：将体胚诱导和发育选择培养基(EIM)倒入直径为90mm的培养皿中，凝固后表面覆盖一张普通定性滤纸。
(7)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下培养1个月左右。
(8)将体胚萌发得到的小苗转移至生根筛选培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下进行培养，约1个月后可获得完整的转化植株。
实施例2
一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，包括如下步骤：
(1)采用冻融法将质粒pCAMBIA2301(CAMBIA实验室，澳大利亚)转入根癌农杆菌EHA105(CAMBIA实验室，澳大利亚)中。
(2)取导入了pCAMBIA2301的EHA105菌种于添加30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的YEB固体培养基上划线，26±1℃，黑暗条件下培养48小时。然后，挑取单菌落接种于含30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的10ml YEB液体培养基中，26±1℃，250rpm振荡培养24小时，用新鲜的YEB培养基稀释5倍后，继续26±1℃，250rpm振荡培养4小时，得到菌液。
(3)菌液于5000rpm离心10分钟，去上清后用10倍体积的香蕉ECS继代培养培养基(MLM)重悬菌体，得到工程菌液。
(4)取MLM中继代培养4天的贡蕉ECS，4000rpm离心10分钟，去上清后，每0.5ml PCV(密实体积)ECS加入10ml经步骤(3)获得的工程菌液，置于100ml锥形瓶中，26±1℃，黑暗静置2小时。
(5)加入10ml新鲜的MLM共培养，共培养条件为：26±1℃，黑暗条件下振荡培养。培养条件为：先40rpm振荡培养12小时，然后转速提高至100rpm继续培养60小时。
(6)共培养完成后，培养物静置5分钟，去上清，用新鲜的MLM将沉淀稀释10倍，然后取1ml悬浮物均匀铺于下述准备好的EIM上。26±1℃，黑暗培养3个月，每个月更换一次新鲜的EIM。EIM按下述方法准备：将体胚诱导和发育选择培养基(EIM)倒入直径为90mm的培养皿中，凝固后表面覆盖一张普通定性滤纸。
(7)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下培养1个月左右。
(8)将体胚萌发得到的小苗转移至生根筛选培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下进行培养，约1个月后可获得完整的转化植株。
实施例3
一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，包括如下步骤：
(1)采用冻融法将质粒pCAMBIA2301(CAMBIA实验室，澳大利亚)转入根癌农杆菌EHA105(CAMBIA实验室，澳大利亚)中。
(2)取导入了pCAMBIA2301的EHA105菌种于添加30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的YEB固体培养基上划线，26±1℃，黑暗条件下培养48小时。然后，挑取单菌落接种于含30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的10ml YEB液体培养基中，26±1℃，250rpm振荡培养24小时，用新鲜的YEB培养基稀释5倍后，继续26±1℃，250rpm振荡培养4小时，得到菌液。
(3)菌液于5000rpm离心10分钟，去上清后用10倍体积的香蕉ECS继代培养培养基(MLM)重悬菌体，得到工程菌液。
(4)取MLM中继代培养4天的贡蕉ECS，4000rpm离心10分钟，去上清后，每0.5ml PCV(密实体积)ECS加入10ml经步骤(3)获得的工程菌液，置于100ml锥形瓶中，26±1℃，黑暗静置2小时。
(5)加入10ml新鲜的MLM共培养，共培养条件为：26±1℃，黑暗条件下振荡培养。培养条件为：先40rpm振荡培养12小时，然后转速提高至100rpm继续培养156小时。
(6)共培养完成后，培养物静置5分钟，去上清，用新鲜的MLM将沉淀稀释10倍，然后取1ml悬浮物均匀铺于下述准备好的EIM上。26±1℃，黑暗培养3个月，每个月更换一次新鲜的EIM。EIM按下述方法准备：将体胚诱导和发育选择培养基(EIM)倒入直径为90mm的培养皿中，凝固后表面覆盖一张普通定性滤纸。
(7)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下培养1个月左右。
(8)将体胚萌发得到的小苗转移至生根筛选培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下进行培养，约1个月后可获得完整的转化植株。
以gusA为报告基因，nptII作为筛选标记基因，贡蕉ECS根据上述转化步骤进行试验，获得以下结果：
表1共培养时间和转速对根癌农杆菌介导贡蕉ECS基因转化的影响(试验重复3次)
| 共培养时间(转速) | NSE*(Mean±SE) | NP**(Mean±SE) |
| 168小时(100rpm)72小时(先40rpm 12小时，然后100rpm 60小时)168小时(先40rpm 12小时，然后100rpm 156小时) | 1631.3±271.8b1669.7±220.5b2608.0±152.1a | 280.3±55.1b264.3±34.2b489.7±40.5a |
*NSE(抗性体胚个数/0.5ml PCV ECS)；**NP(转化植株数/0.5ml PCV ECS)。使用Duncan’s new multiple range test方法进行显著性分析。
如图1所示为根癌农杆菌介导转化贡蕉ECS研究结果，其中，A、共培养后，贡蕉ECS中GUS基因的瞬时表达。其中a、100rpm共培养72小时；b、100rpm共培养168小时；c、40rpm培养12小时，然后100rpm继续培养156小时(bar＝6mm)；B、100rpm共培养168小时后，贡蕉ECS于体胚诱导和发育培养基上诱导出抗性体胚(bar＝9.8mm)；C、40rpm培养12小时，然后100rpm继续培养156小时后，贡蕉ECS于体胚诱导和发育培养基上诱导出抗性体胚(bar＝8mm)；D、非转化体胚中的GUS表达(bar＝0.4mm)；E、转化体胚中的GUS表达(bar＝0.4mm)；F、转化不定芽中的GUS表达(bar＝1.8mm)；G、非转化(左)及转化(右)植株的叶片中的GUS表达(bar＝5.4mm)；H、非转化(左)及转化(右)植株的根中的GUS表达(bar＝3.7mm)；I、非转化植株移栽网室8个月后，叶片中的GUS表达(bar＝4.8mm)；J、转化植株移栽网室8个月后，母株(下)及吸芽(上)的叶片中的GUS表达(bar＝4.8mm)。
如图2所示为贡蕉转基因抗性植株中gusA的PCR检测图，其中，M：DNA marker；P：质粒pCAMBIA2301(阳性对照)；1：蒸馏水(负对照)；2：非转化植株的DNA(阴性对照)；3～14：各贡蕉转基因抗性植株的DNA。PCR扩增后获得与质粒pCAMBIA2301相同的约1200bp的带，初步证实gusA已导入贡蕉转基因抗性植株。
如图3所示为贡蕉转基因抗性植株中nptII的PCR检测图。其中，M：DNA marker；P：质粒pCAMBIA2301(阳性对照)；1：蒸馏水(负对照)；2：非转化植株的DNA(阴性对照)；3～14：各贡蕉转基因抗性植株的DNA。PCR扩增后获得与质粒pCAMBIA2301相同的约750bp的带，初步证实nptII已导入贡蕉转基因抗性植株。
如图4所示为贡蕉转基因抗性植株中nptII的Southern印迹检测(EcoRI酶切)图。其中，P：质粒pCAMBIA2301/EcoRI(阳性对照)；C：非转化植株的DNA/EcoRI(阴性对照)；1～7：GUS检测为阳性的贡蕉转基因植株的DNA/EcoRI。Southern杂交后检测到阳性信号，证实nptII已导入贡蕉转基因抗性植株。
实施例4
一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，包括如下步骤：
(1)采用冻融法将质粒pCAMBIA2301(CAMBIA实验室，澳大利亚)转入根癌农杆菌EHA105(CAMBIA实验室，澳大利亚)中。
(2)取导入了pCAMBIA2301的EHA105菌种于添加30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的YEB固体培养基上划线，26±1℃，黑暗条件下培养48小时。然后挑取单菌落接种于含30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的10mlYEB液体培养基中，26±1℃，250rpm振荡培养24小时，用新鲜的YEB培养基稀释5倍后，继续26±1℃，250rpm振荡培养4小时，得到菌液。
(3)菌液于5000rpm离心10分钟，去上清后用10倍体积的香蕉ECS继代培养培养基(MLM)重悬菌体，得到工程菌液。
(4)取MLM中继代培养5天的龙芽蕉ECS，4000rpm离心10分钟，去上清后，每0.5ml PCV(密实体积)ECS加入10ml经步骤(3)获得的工程菌液，置于100ml锥形瓶中，26±1℃，黑暗静置4小时。
(5)加入10ml新鲜的MLM共培养，共培养条件为：26±1℃，黑暗条件下振荡培养。培养条件为：先30rpm振荡培养14小时，然后转速提高至90rpm继续培养100小时。
(6)共培养完成后，培养物静置5分钟，去上清，用新鲜的MLM将沉淀稀释10倍，然后取1ml悬浮物均匀铺于下述准备好的EIM上。26±1℃，黑暗培养3个月，每个月更换一次新鲜的EIM。EIM按下述方法准备：将体胚诱导和发育选择培养基(EIM)倒入直径为90mm的培养皿中，凝固后表面覆盖一张普通定性滤纸。
(7)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下培养1个月左右。
(8)将体胚萌发得到的小苗转移至生根筛选培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下进行培养，约1个月后可获得完整的转化植株。
实施例5
一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，包括如下步骤：
(1)采用冻融法将质粒pCAMBIA2301(CAMBIA实验室，澳大利亚)转入根癌农杆菌EHA105(CAMBIA实验室，澳大利亚)中。
(2)取导入了pCAMBIA2301的EHA105菌种于添加30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的YEB固体培养基上划线，26±1℃，黑暗条件下培养48小时。然后挑取单菌落接种于含30mgl-1利福平和100mgl-1卡那霉素的10mlYEB液体培养基中，26±1℃，250rpm振荡培养24小时，用新鲜的YEB培养基稀释5倍后，继续26±1℃，250rpm振荡培养4小时，得到菌液。
(3)菌液于5000rpm离心10分钟，去上清后用10倍体积的香蕉ECS继代培养培养基(MLM)重悬菌体，得到工程菌液。
(4)取MLM中继代培养3天的巴西香蕉ECS，4000rpm离心10分钟，去上清后，每0.5ml PCV(密实体积)ECS加入10ml经步骤(3)获得的工程菌液，置于100ml锥形瓶中，26±1℃，黑暗静置6小时。
(5)加入10ml新鲜的MLM共培养，共培养条件为：26±1℃，黑暗条件下振荡培养。培养条件为：先50rpm振荡培养10小时，然后转速提高至120rpm继续培养60小时。
(6)共培养完成后，培养物静置5分钟，去上清，用新鲜的MLM将沉淀稀释10倍，然后取1ml悬浮物均匀铺于下述准备好的EIM上。26±1℃，黑暗培养3个月，每个月更换一次新鲜的EIM。EIM按下述方法准备：将体胚诱导和发育选择培养基(EIM)倒入直径为90mm的培养皿中，凝固后表面覆盖一张普通定性滤纸。
(7)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下培养1个月左右。
(8)将体胚萌发得到的小苗转移至生根筛选培养基上，于26±1℃，16小时/8小时的光暗交替条件下进行培养，约1个月后可获得完整的转化植株。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1、一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将导入了质粒的根癌农杆菌于YEB固体培养基上划线，26±1℃，黑暗条件下培养，然后挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，26±1℃，振荡培养得到菌液；菌液离心去上清后，用10倍体积的香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基重悬菌体，得到工程菌液；
(2)取在香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基中继代培养3～5天的香蕉ECS，离心去上清后，每0.5ml PCV ECS加入10ml经步骤(1)获得的工程菌液，26±1℃，黑暗静置2～6小时；
(3)然后加入香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基共培养，所述共培养条件为：26±1℃，黑暗条件下振荡培养，所述振荡培养条件如下：将培养物于90～120rpm转速下振荡培养168～240小时；或者将培养物先在30～50rpm转速下振荡培养10～14小时，然后再提高转速至90～120rpm，继续培养60～156小时；
(4)共培养完成后，将培养物静置去上清，用香蕉ECS液体培养基即继代培养培养基将沉淀稀释10倍，然后将悬浮物均匀铺于体胚诱导和发育选择培养基上，26±1℃，黑暗培养3个月，每个月更换一次体胚诱导和发育选择培养基；
(5)将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光暗交替条件下培养至体胚萌发得到小苗，然后将小苗转移至生根筛选培养基上，光暗交替条件下进行培养即获得完整的转化植株；
所述液体培养基组成为：以MS为基本培养基，添加1mgl-1生物素、100mgl-1谷氨酰胺、100mgl-1麦芽提取物、1mgl-12，4-二氯苯氧乙酸和45gl-1蔗糖，高压灭菌前pH为5.3；
所述体胚诱导和发育培养基组成为：SH大量元素，SH微量元素，MS维生素，添加1mgl-1生物素，100mgl-1谷氨酰胺，100mgl-1麦芽提取物，230mgl-1脯氨酸，0.2mgl-1萘乙酸，0.1mgl-1激动素，45gl-1蔗糖，10gl-1乳糖，3gl-1gelrite，500mgl-1先锋霉素和50～100mgl-1的相应的筛选抗生素，高压灭菌前pH为5.3；所述筛选抗生素根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定。
2、根据权利要求1所述的一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，其特征在于：所述香蕉包括贡蕉、龙芽蕉或巴西香蕉。
3、根据权利要求1所述的一种利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法，其特征在于：所述质粒为pCAMBIA2301。
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