CN114836468B - 一种白桦根转基因方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效的白桦根转基因方法，属于植物转基因技术领域。为解决现有白桦转基因体系外植体培养周期长、转化周期长、效率低的问题，本发明提供了一种高效的白桦根转基因方法，选取具有根蘖繁殖能力的白桦根作为转基因材料，经过白桦根的培养、携带目的基因的农杆菌遗传转化、共培养诱导愈伤组织形成，抗性筛选诱导不定芽的形成，最终通过诱导形成完整的植株。本发明与现有白桦转基因方法相比，缩短了转化周期，提高了转化效率，避免了外植体选择的困难，统一了转基因子代植株的遗传背景，提高了材料的使用率，进一步解决了脱菌难的问题。本发明提供的高效的白桦根转基因方法操作简单，易于掌握。

Description

一种白桦根转基因方法
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，尤其涉及一种高效的白桦根转基因方法。
背景技术
白桦（Betula platyphylla Suk.）为桦木科桦属植物，为落叶乔木，生长速度快、是东北地区次生林的先锋树种，耐寒能力强，喜酸性土壤，在胶合板、单板的家具制造以及纸浆材等方面有广泛的应用。由于其重要的生态、观赏和实用经济价值，历来被列为国家科技计划研究的重要树种之一。对其遗传改良的范围也在不断扩大，其主要目标是培育速生、优质和高抗的林木新品种。因此利用分子生物学手段进行林木新品种培育提供材料，具有重要的应用价值。
目前采用的白桦叶盘法转化实验中，过于衰老的组织不易于农杆菌的侵染，过于幼嫩的组织容易被农杆菌包裹死亡，并且由于白桦茎与叶片上长有许多绒毛，在筛选培养过程中很容易包裹农杆菌，造成脱菌困难的现象。且白桦的茎段带有芽点，会造成许多的假阳性植株。白桦愈伤转化法中，由于愈伤组织具有很强的分化能力，在已形成的愈伤组织上进行侵染，会造成子代中存在大量的嵌合体及假阳性植株，须消耗大量的筛选时间。在白桦合子胚转化法中需要先对白桦种子进行选取、萌发及消毒，过程复杂。种子萌发时间不易掌握，并且消毒不彻底会污染本次转化的所有材料。而‘切种子’这一步骤也由于种子小且圆润不易操作。每个种子的遗传背景不同，通过白桦合子胚转化得到的转基因株系所携带的遗传背景也不同，不易于对转基因植株的分子实验探究。
发明内容
为解决现有白桦转基因体系外植体培养周期长、转化周期长、效率低的问题，本发明提供了一种高效的白桦根转基因方法。
本发明的技术方案：
一种高效的白桦根转基因方法，将白桦组培苗根部置于转化液中，所述转化液中含有携带目的基因的农杆菌；在转化液浸泡条件下将白桦组培苗根切段侵染，侵染完成后将所得根段置于共培养培养基中进行暗培养，暗培养完成后将根段移至愈伤筛选培养基中，光照条件下进行愈伤培养得到愈伤组织，将所得愈伤组织转移至分化筛选培养基中进行分化培养及筛选得到不定芽，将所得不定芽转移至生根筛选培养基中进行不定芽生根诱导培养及筛选，对生根筛选培养基中正常生长的白桦苗进行分子鉴定，鉴定正确后即为稳定转化的转基因白桦植株。
进一步的，所述白桦组培苗根部是将组培白桦苗微扦插于生根培养基中室温条件下生根培养1~2月得到，所述生根培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
进一步的，所述转化液是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、150 μM的AS和0.02 %的tween-20配制而成，pH为5.8-6.2。
进一步的，所述转化液中农杆菌的OD600为0.6-0.8。
进一步的，所述白桦组培苗根部切段侵染是将白桦组培苗根部在转化液浸泡条件下切成1cm长的根段，侵染5~10min。
进一步的，所述共培养培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.02 mg/L的NAA、0.8 mg/L的6-BA、0.5 mg/L的GA3和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2；所述根段置于共培养培养基中暗培养是在室温条件下暗培养为3~4天。
进一步的，所述光照条件为室温条件下14h光照和10h黑暗交替培养，光照强度为500mmol/m2·s，所述愈伤培养的时间为14~30d。
进一步的，所述愈伤筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.02mg/L的NAA、0.8 mg/L的6-BA、0.5 mg/L的GA3、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
进一步的，所述分化筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、1 mg/L的6-BA、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
进一步的，所述生根筛选培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
本发明的有益效果：
本发明提供的高效的白桦根转基因方法与白桦叶盘法转化周期120天相比，转化周期缩短了1/2，与愈伤法转化周期100天相比缩短了1/3。本发明白桦根转基因方法转化效率最高可达53 %，平均效率可达29%，是愈伤转化法和合子胚转化法的3倍，叶盘法的12倍。
本发明选取具有根蘖繁殖能力的白桦根作为转基因材料，缩短了材料的培养周期，避免了外植体选择的困难，统一了转基因子代植株的遗传背景，提高了材料的使用率。白桦组培苗根部表面光滑，更易于脱菌。并且由于根的表面积小，在筛选过程中，与抗性培养基接触率更大，更能很好的筛选和抑菌。
本发明农杆菌侵染过程中，将根浸泡在侵染液中进行切割，保持了外植体的新鲜度，切口与侵染液的直接接触，更易于转化，操作简单，易于掌握。
本发明在生根培养基和生根筛选培养基中添加碳粉，通过活性炭的吸附性，减少代谢产物对白桦根的生长影响。同时从培养基分离根时减少了根被培养基包裹的情况，进一步解决了脱菌困难的问题。
附图说明
图1为实施例3转基因白桦苗DNA水平分子鉴定结果照片；
图2为实施例1中野生型组培白桦根的取材部分的照片；
图3为实施例1中白桦根段侵染农杆菌的照片；
图4为实施例1中侵染后的白桦根段共培养的照片；
图5为实施例1中白桦根段愈伤培养的照片；
图6为实施例1中愈伤组织分化培养的照片；
图7为实施例1中不定芽生根诱导培养的照片；
图8和图9为实施例1转基因白桦苗GUS染色结果图片；
图10为普通生根培养基培养得到的白桦根和添加碳粉的生根培养基培养得到的白桦根的生长对比图；
图11为实施例2转基因白桦苗LUC活体荧光成像结果照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供了一种高效的白桦根转基因方法，包括如下步骤：
步骤1、将野生型组培白桦苗微扦插于生根培养基中室温条件下进行生根培养。
生根培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2 mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤2、将含有35S启动子驱动GUS基因表达的pBI121-GUS载体的农杆菌置于5 mL含20 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，于28 ℃条件下，220 rpm培养2-3d。
本实施例使用的农杆菌感受态细胞EHA105和pBI121-GUS载体由商业购买得到。
步骤3、吸取步骤2中的农杆菌培养液500 μL转接至新的20 mL双抗LB培养基中继续培养至OD600为0.6-0.8，离心收集菌体并将菌体重悬于20 mL转化液中。
转化液是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、150 μM的AS和0.02 %的tween-20配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤4、在超净工作台中，将10 mL转化液倒于平板中，选取生长1-2月大的白桦组培苗，取未被培养基包裹的根部并将其浸泡于转化液中；图2为本实施例中野生型组培白桦根的取材部分的照片；
步骤5、用刀片将转化液中浸泡的白桦组培苗根切成1 cm长的根段并去除根尖及幼小的侧根，侵染10 min。图3为本实施例白桦根段侵染农杆菌的照片。
步骤6、侵染过后，将根段置于共培养培养基中，22 ℃条件下，暗培养3d后，移至愈伤筛选培养基中，在14 h光照和10 h黑暗条件下交替培养，光强为500mmol/m2·s条件下进行愈伤培养25d，期间每5天更换一次愈伤筛选培养基。图4为本实施例中侵染后的白桦根段共培养的照片；图5为本实施例中白桦根段愈伤培养的照片。
愈伤筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.02 mg/L的NAA、0.8mg/L的6-BA、0.5 mg/L的GA3、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤7、待长出愈伤组织后，将愈伤组织转移至分化筛选培养基中进行分化培养及筛选，期间每5天更换一次培养基。图6为本实施例中愈伤组织分化培养的照片。
分化筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、1 mg/L的6-BA、250mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤8、愈伤组织生成2-3 cm长的不定芽后，将不定芽转移至生根筛选培养基中进行不定根诱导及筛选。图7为本实施例中不定芽生根诱导培养的照片。
生根筛选培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2 mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤9、对在抗性培养基中正常生长的转基因白桦苗进行GUS染色，鉴定白桦转基因效果，GUS染色方法按本领域常规GUS染色方法进行，图8和图9为本实施例转基因白桦苗GUS染色结果图片，从图中可以看到，转基因白桦苗经染色呈现蓝色，显示转基因成功，鉴定正确后即为稳定转化的转基因植株。
本实施例共50个切口，最终得到了9个转基因株系，转化效率为18 %。
在组织培养中，白桦根会产生大量的代谢产物，这些产物会导致根老化、过硬。同时有大量黑色代谢产物包裹在根的表面。将根与培养基分离时，会有大量的培养基包裹在根的表面，这样的根不易于侵染。为解决这些问题，本发明在生根培养基和生根筛选培养基中添加碳粉中加入碳粉，通过活性炭的吸附性，减少代谢产物对白桦根的生长影响。同时从培养基分离根时减少了根被培养基包裹的情况，进一步解决了脱菌困难的问题。
图10为普通生根培养基培养得到的白桦根和添加碳粉的生根培养基培养得到的白桦根的生长对比图，a为普通生根培养基，b为添加碳粉的生根培养基，从图中可以看出，生根培养基中添加碳粉后，白桦根生长的更健康，没有代谢产物，表面也不易被培养基包裹。
实施例2
本实施例提供了一种高效的白桦根转基因方法，包括如下步骤：
步骤1、将野生型组培白桦苗微扦插于生根培养基中室温条件下进行生根培养。
生根培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2 mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤2、将含有pROKⅡ-LUC载体的农杆菌置于5 mL含20 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，于28 ℃条件下，220 rpm培养2-3 d。
本实施例中的使用的农杆菌感受态细胞EHA105由商业购买得到，pROKⅡ-LUC载体由东北林业大学林木遗传育种实验室王超团队按本领域常规基因连接方法构建得到。
步骤3、吸取步骤2中的农杆菌培养液500 μL转接至新的20 mL双抗LB培养基中继续培养至OD600为0.6-0.8，离心收集菌体并将菌体重悬于20 mL转化液中。
转化液是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、150 μM的AS和0.02 %的tween-20配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤4、在超净工作台中，将10 mL转化液倒于平板中，选取生长1-2月大的白桦组培苗，取未被培养基包裹的根部并将其浸泡于转化液中；
步骤5、用刀片将转化液中浸泡的白桦组培苗根切成1 cm长的根段并去除根尖及幼小的侧根，侵染8 min。
步骤6、侵染过后，将根段置于共培养培养基中，22 ℃条件下，暗培养4 d后，移至愈伤筛选培养基中，在14 h光照和10 h黑暗条件下交替培养，光强为500mmol/m2·s条件下进行愈伤培养21d，期间每5天更换一次愈伤筛选培养基。
愈伤筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.02 mg/L的NAA、0.8mg/L的6-BA、0.5 mg/L的GA3、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤7、待长出愈伤组织后，将愈伤组织转移至分化筛选培养基中进行分化培养及筛选，期间每5天更换一次培养基。
分化筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、1 mg/L的6-BA、250mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤8、愈伤组织生成2-3 cm长的不定芽后，将不定芽转移至生根筛选培养基中进行不定根诱导及筛选。
生根筛选培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2 mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤9、对在抗性培养基中正常生长的转基因白桦苗进行LUC活体荧光成像，鉴定白桦转基因效果，LUC活体荧光成像按本领域常规LUC活体荧光成像方法进行，图11为本实施例转基因白桦苗LUC活体荧光成像结果照片；从图中可以看到清晰的荧光成像，显示转基因成功，鉴定正确后即为稳定转化的转基因植株。
本实施例共40个切口，最终得到了5个株系，转化效率为12.5 %。
实施例3
本实施例提供了一种高效的白桦根转基因方法，包括如下步骤：
步骤1、将野生型组培白桦苗微扦插于生根培养基中室温条件下进行生根培养。
生根培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2 mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤2、将含有pEgP237-FLA9-2A-GFP载体的农杆菌置于5 mL含20 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，于28 ℃条件下，220 rpm培养2-3 d。
本实施例中的使用的农杆菌感受态细胞EHA105由商业购买得到，pEgP237-FLA9-2A-GFP载体由东北林业大学林木遗传育种实验室王超团队按本领域常规基因连接方法构建得到。
步骤3、吸取步骤2中的农杆菌培养液500 μL转接至新的20 mL双抗LB培养基中继续培养至OD600为0.6-0.8，离心收集菌体并将菌体重悬于20 mL转化液中。
转化液是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、150 μM的AS和0.02 %的tween-20配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤4、在超净工作台中，将10 mL转化液倒于平板中，选取生长1-2月大的白桦组培苗，取未被培养基包裹的根部并将其浸泡于转化液中；
步骤5、用刀片将转化液中浸泡的白桦组培苗根切成1 cm长的根段并去除根尖及幼小的侧根，侵染10min。
步骤6、侵染过后，将根段置于共培养培养基中，22 ℃条件下，暗培养4d后，移至愈伤筛选培养基中，在14 h光照和10 h黑暗条件下交替培养，光强为500mmol/m2·s条件下进行愈伤培养30d，期间每6天更换一次愈伤筛选培养基。
愈伤筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.02 mg/L的NAA、0.8mg/L的6-BA、0.5 mg/L的GA3、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤7、待长出愈伤组织后，将愈伤组织转移至分化筛选培养基中进行分化培养及筛选，期间每6天更换一次培养基。
分化筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、1 mg/L的6-BA、250mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤8、愈伤组织生成2-3 cm长的不定芽后，将不定芽转移至生根筛选培养基中进行不定根诱导及筛选。
生根筛选培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2 mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
步骤9、对在抗性培养基中正常生长的转基因白桦苗进行DNA水平分子鉴定，图1为本实施例转基因白桦苗DNA水平分子鉴定结果照片；L3、L19、L22、L36、L45为随机抽取的转基因株系，从图中可以看出，不同转基因株系均获得了转基因片段，显示转基因成功，鉴定正确后即为稳定转化的转基因植株。
本实施例共96个切口，最终得到了51个株系，转化效率为53.13 %。
通过实施例1-3的比较发现，三个实施例的转化效率差异较大，推测造成转化效率差异的原因可能是转化使用的载体不同造成的。因此将不同的表达载体分别做了三组重复实验，结果统计见表1。表1中使用的所有载体均由东北林业大学林木遗传育种实验室王超团队按本领域常规基因连接方法构建得到。
表1 白桦根转基因体系转化效率统计表
表1显示，pROKII过表达载体的转化效率为12.5 %-13 %之间，pBI121-GFP融合表达载体的转化效率为16 %-20 %之间，CRISPR/Cas9基因沉默表达载体转化效率为47.19 %-53.13 %之间。该结果说明不同载体对白桦根转基因体系的转化效率有着明显差异。但排除不同载体对转化效率的影响，本发明白桦根转基因方法仍然获得了显著优于现有技术的转化效率。

Claims (8)

1.一种白桦根转基因方法，其特征在于，将白桦组培苗根部置于转化液中，所述白桦组培苗根部是将组培白桦苗微扦插于生根培养基中室温条件下生根培养1~2月得到，所述生根培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2 mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉和6g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2；所述转化液中含有携带目的基因的农杆菌；在转化液浸泡条件下将白桦组培苗根切段侵染，所述白桦组培苗根部切段侵染是将白桦组培苗根部在转化液浸泡条件下切成1cm长的根段，侵染5~10min；侵染完成后将所得根段置于共培养培养基中进行暗培养，暗培养完成后将根段移至愈伤筛选培养基中，光照条件下进行愈伤培养得到愈伤组织，将所得愈伤组织转移至分化筛选培养基中进行分化培养及筛选得到不定芽，将所得不定芽转移至生根筛选培养基中进行不定芽生根诱导培养及筛选，对生根筛选培养基中正常生长的白桦苗进行分子鉴定，鉴定正确后即为稳定转化的转基因白桦植株。
2.根据权利要求1所述一种白桦根转基因方法，其特征在于，所述转化液是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、150 μM的AS和0.02 %的tween-20配制而成，pH为5.8-6.2。
3.根据权利要求2所述一种白桦根转基因方法，其特征在于，所述转化液中农杆菌的OD600为0.6-0.8。
4.根据权利要求3所述一种白桦根转基因方法，其特征在于，所述共培养培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.02 mg/L的NAA、0.8 mg/L的6-BA、0.5 mg/L的GA3和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2；所述根段置于共培养培养基中暗培养是在室温条件下暗培养为3~4天。
5.根据权利要求4所述一种白桦根转基因方法，其特征在于，所述光照条件为室温条件下14h光照和10h黑暗交替培养，光照强度为500mmol/m2·s，所述愈伤培养的时间为14~30d。
6.根据权利要求5所述一种白桦根转基因方法，其特征在于，所述愈伤筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.02 mg/L的NAA、0.8 mg/L的6-BA、0.5 mg/L的GA3、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
7.根据权利要求6所述一种白桦根转基因方法，其特征在于，所述分化筛选培养基是在WPM培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、1 mg/L的6-BA、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
8.根据权利要求7所述一种白桦根转基因方法，其特征在于，所述生根筛选培养基是在1/2 MS培养基的基础上增加20 g/L蔗糖、0.2 mg/L的NAA、0.4 g/L的碳粉、250 mg/L的头孢霉素、50 mg/L的卡那霉素和6 g/L的琼脂配制而成，pH为5.8-6.2。
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