KR101239643B1 - 장미 스위트엘로우 체세포배(배발생캘러스 포함)를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법 - Google Patents

장미 스위트엘로우 체세포배(배발생캘러스 포함)를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 장미 품종 '스위트 엘로우(Sweet Yellow)'의 기내 식물체 뿌리에서 유도된 체세포배 및 배발생 캘러스를 재료로 아그로박테리움-매개 형절전환체를 대량생산할 수 있는 효율적인 유전자 전이법에 관한 것이다.

Description

장미 스위트엘로우 체세포배(배발생캘러스 포함)를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법{MASS PRODUCTION METHOD FOR DEVELOPING TRANSGENIC PLANT BY USING SOMATIC EMBRYO(INCUDING SOMATIC EMBRYODENIC CALLUS) IN ROSE SWEET YELLOW}
본 발명은 장미 품종 '스위트 엘로우(Sweet Yellow)'의 기내 식물체 뿌리에서 유도된 체세포배 및 배발생 캘러스를 재료로 아그로박테리움-매개 형절전환체를 대량생산할 수 있는 효율적인 유전자 전이법에 관한 것이다.
장미 신품종은 주로 품종간 또는 종간교잡에 의해 육성되는데, 2006년 말 일본의 Suntory사에서 형질전환 기술을 이용하여 푸른색 장미 품종을 개발하여 2009년말 상업화되었다는 보고와 같이 벼나 콩 등 주곡작물에서 주요 육종 기술로 자리 잡고 있는 형질전환 기술이 최근에는 장미의 품종 육성을 위한 육종의 한 기술로서 이용되기 시작하였지만 현재까지 상업화된 형질전환 장미 품종은 없다.
기존에 보고된 장미 형질전환 기술은 기내 배양 식물체의 잎으로부터 유도한 캘러스를 유전자전이의 절편체로 이용하여 외래 목적 유전자를 플라스미드벡터에 삽입하고 있는 아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens )에의 감염에 의하거나 그 유전자를 삽입하고 있는 플라스미드벡터를 유전자총을 이용해 유전자전이를 시도하였으나 유전자총 기법은 형질전환체 내로의 외래 유전자가 너무 많이 카피되고 이입되어 복잡한 외래유전자좌를 유발함과 동시에 예상치 못한 유전자 침묵현상을 야기시킨다는 문제점을 보였으며, 또한, 유전자전이 효율이 매우 낮으며 전이된 이후 선발 배지에서 재분화된 식물체에서의 도입유전자 발현율도 낮을 뿐 아니라 도입 유전자의 발현이 형질전환체 전체에서 확인되었다는 보고는 거의 없다.
또한, 전기영동법에 의한 형질전환이 이용되나, 이는 조직배양 없이도 간편하게 수행할 수 있다는 장점을 갖는 반면 안정적인 형질전환체 획득이 어렵다는 문제점을 안고 있었다.
반면, 유전자전이의 절편체로서 이용할 경우 유전자전이 효율도 높을 뿐 아니라 유전자전이 후 선발 배지에서 재분화된 식물체 전체에서 도입 유전자가 발현될 가능성이 매우 높은 체세포배발생 캘러스를 이용하여 장미로의 유전자전이를 시도한 예가 거의 없다. 체세포배발생 캘러스(embryogenic callus)의 Agrobacterium tumefaciens-매개 형질전환에 대한 보고에서 형질전환체는 뿌리계가 약하고 새 가지에 꽃이 피지 않는 것으로 알려져 있다(Alexander Vainstein (2002) Breeding For Ornamentals: Classical and Molecular Approches, Kluwer Academic 185~186). 또한, 유전자발현이 장미 식물체 전체적으로 확인된 연구 보고는 전무하다.
유전자전이를 하고자 하는 대상재료에 부분적인 유전자전이가 되어 키메라 형질전환체의 발생가능성이 높은 기존의 유전자전이 기술과는 달리, 유전자전이를 하고자 하는 대상재료 전체적으로 유전자전이가 될 수 있는 본 발명에서 개발된 체세포배발생 캘러스를 이용한 유전자전이 기술은 일본 Suntory사에서 호주의 Florigene사와 공동연구를 통해 형질전환 기술을 이용하여 개발한 푸른색 장미 품종이 상업화되어 형질전환 기술이 장미의 품종 육성을 위한 육종 기술로서 이용되기 시작한 즈음에, 푸른색 화색 품종등과 같이 개발되기만 하면 희소성에 의해 무한한 부가가치 창출 가능성이 크나 기존의 전통적인 육종기술로서 개발되기 어려운 특성이 도입된 장미 품종을 개발하여 장미의 시장점유율을 높일 수 있다고 기대된다.
본 발명은 형질전환 기술을 이용하여 장미 신품종을 육성하고자 형질전환 기술 개발에 관한 것으로, 형질전환의 재료로서 이용될 경우 유전자 전이 효율이 높으나 현재까지 연구 보고된 바 없는 장미 체세포배발생 캘러스를 이용한 외래유전자의 전이 기술 및 유전자의 전이 후 선발배지에서 획득된 식물체를 건실하게 생장시켜 발근 후 온실 순화하는 할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다.
본 발명은 국립원예특작과학원 육성 장미 품종 'Sweet Yellow'의 기내뿌리로부터 체세포배발생캘러스를 유도한 후 증식과정에서 선발된 체세포배(배발생캘러스 포함)를 외래유전자 전이 재료로 이용하여 특정 작물의 형질전환 기술을 확립하고자 할 때 표식유전자로서 널리 이용되고 있는 유전자인 GUS(β-glucuronidase) 및 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자를 삽입하고 있는 아그로박테리움 튜메파시엔스에 감염 후, 공동배양을 통해 외래유전자를 도입한 후 배발아 선발배지로 옮겨 배양하면서 외래유전자의 도입여부를 확인한 후, 외래유전자가 전이된 체세포배(배발생캘러스 포함)로부터 신초원기를 유도하고 그 원기로부터 신초를 재분화시킨 후, 건실한 지상부 생장을 위해 신초생장 및 다신초유도 선발배지에서의 거쳐 도입 유전자의 발현 확인 후 발근 및 순화하였다.
본 발명은 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법으로서, 장미 품종 '스위트엘로우'의 기내식물체 뿌리에서 유도·선발된 체세포배 또는 배발생 캘러스를 GUS 유전자가 형질전환된 아그로박테리 움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 및 GFP 유전자가 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens )과 공동배양하는 단계, 상기 공동배양된 체세포배 또는 배발생 캘러스를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 배발아 선발배지에서 배양하는 단계, 상기 배양된 체세포배 또는 배발생 캘러스를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 단독으로 또는 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 배발아 선발배지 또는 배성숙 선발배지에서 배양하는 단계, 상기 배발아 선발배지 또는 배성숙 선발배지에서 배양한 신초원기를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 신초유도 선발배지에서 배양하는 단계, 상기 신초유도 선발배지에서 배양된 신초를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 신초 생장 선발배지에서 배양하는 단계, 상기 신초 생장 선발배지에서 배양된 1~1.5㎝의 신초를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 다신초 유도 선발배지에서 배양하는 단계, 상기 다신초 유도 선발배지에서 배양된 다신초를 50mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 발근 유도 선발배지에서 배양하는 단계, 및 상기 발근 유도 선발배지에서 배양된 발근묘를 순화시키는 단계를 포함한다.
이때, 공동배양은 30~80μM의 아세토시린곤(acetosyringone), 3mg·L-1의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 30g·L-1의 수크로오스(sucrose), 300mg·L-1의 L-프롤린(proline) 및 2.5g·L-1 피타겔(phytagel)이 첨가된 SH 배지Schenk and Hildebrandt's basal salts medium)(pH 5.2)에서 25±2℃의 온도조건과 암상태로 3일간 이루어질 수 있다.
상기 공동배양된 체세포배 또는 배발생 캘러스를 4℃에서 7일간 암배양할 수 있다.
상기 배발아 선발배지는 0.1mg·L-1 인돌-3-부티르산(IBA), 1mg·L-1 6-벤질아미노퓨린(BAP), 30g·L-1 말토오즈(maltose), 4g·L-1 아가로즈(agarose)가 첨가된 SH 배지일 수 있다.
또한, 상기 배성숙배지는 1mg·L-1 2,4-D, 1mg·L-1 아브시스산(ABA), 1mg·L-1 BAP, 0.3mg·L-1 지베렐린(GA3), 30g·L-1 수크로오스(sucrose) 및 4g·L-1 아가로즈(agarose)가 첨가된 SH 배지일 수 있다.
또한, 상기 신초유도 선발배지는 0.3mg·L-1 BAP, 30g·L-1 수크로오스(sucrose) 및 8g·L-1 아가(agar)가 첨가된 MS 배지(Murashige and Skoog's basal salts medium)일 수 있다.
또한, 상기 신초생장 선발배지는 2mg·L-1 BAP, 0.1mg·L-1 α-나프탈렌아세트산(NAA), 30g·L-1 수크로오스(sucrose), 8g·L-1 아가(agar)가 첨가된 MS 배지일 수 있다.
또한, 상기 다신초 유도 선발배지는 1mg·L-1 BAP, 0.001mg·L-1 IBA, 30g·L-1 수크로오스(sucrose) 및 8g·L-1 아가(agar)가 첨가된 MS 배지일 수 있다.
또한, 상기 발근유도 선발배지는 0.3mg·L-1 NAA, 30g·L-1 수크로오스(sucrose) 및 8g·L-1 아가(agar)가 첨가된 MS 배지일 수 있다.
본 발명을 통하여 국내 육성 품종 'Sweet Yellow' 유래 체세포배(배발생 캘러스 포함)를 이용하여 GUS(β-glucuronidase) 및 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자의 전이 효율을 획기적으로 증진시켰으며, 유전자 전이 후 선발배지에서 획득된 식물체를 건실하게 생장시켜 발근 후 온실 순화하는 할 수 있는 기술을 개발하였다.
본 발명에 의해 개발된 장미의 효율적인 외래유전자 전이 기술은 전통적인 육종방법으로 도입하기 힘든 특성을 가지는 장미 품종을 육성하는데 기여할 수 있으리라 기대된다.
도 1은 장미 체세포배(배발생캘러스 포함)로의 유전자전이 및 형질전환 식물체 획득 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 배발생 및 2차 배발생 캘러스 유도 배지에서 증식중인 '스위트옐로우'의 체세포배발생캘러스(a) 및 유전자전이 재료로 선발된 체세포배(배발생캘러스 포함)(b)의 사진이다.
도 3a는 pCAMBIA3301 벡터 내 삽입되어 있는 GUS 유전자(유전자 등록번호:AF234316) 염기서열(붉은색 염기서열은 catalase intron이 삽입된 부분임)을 나타낸 것이다.
도 3b는 pCAMBIA3301 벡터 내 삽입된 GUS유전자 위치를 나타낸, pCAMBIA3301 벡터의 개열지도이다.
도 4a는 pMJ109 벡터 내 삽입되어 있는 sGFP 유전자(유전자 등록번호: U84737) 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4b는 pMJ109 벡터 내 삽입된 GFP유전자 위치를 나타낸, pMJ109 벡터의 개열지도이다.
도 5는 아그로박테리움 공동배양 후 시료로의 유전자 전이를 확인하는 사진(a) 및 배 발아유도 선발배지에 배양된 시료의 사진(b)이다.
도 6은 GUS 유전자전이가 확인된 시료가 발아한 사진(a), 신초가 유도된 사진(b), 신초의 사진(c) 및 다신초가 생장한 사진(d)이다.
도 7은 GUS유전자 전이 후 선발배지에서 획득한 신초에서 도입유전자, GUS유전자가 발현한 사진이다.
도 8은 GFP유전자 전이 후 선발배지에서 획득한 신초 원기에서의 도입유전자, GFP유전자가 발현한 사진이다.
도 9은 GUS(a) 및 GFP(b) 유전자 전이된 후 획득된 신초에서 발근된 사진이다.
본 발명은 도 1에서 설명된 것 같이 유전자전이 재료로서 국립원예특작과학원에서 육성된 장미 품종 'Sweet Yellow'의 기내뿌리로부터 유도된 후 증식과정에서 선발된 체세포배(배발생캘러스 포함)(이하 시료라 칭함)를 사용하여 아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens )에 감염시킨 후 암배양을 통해 특정 작물의 형질전환 기술을 확립하고자 할 때 표식유전자로서 널리 이용되고 있는 유전자인 GUS(β-glucuronidase) 및 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자의 전이를 시도한 후 유전자의 전이가 확인된 체세포배(배발생캘러스 포함)로부터 신초원기를 유도하고 그 원기로부터 신초를 재분화시킨 후 건실한 식물체로 생장시키기 위해 신초생장 및 다신초 유도 배지를 경유한 후 외래유전자의 발현을 확인하여 발근시켜 온실 순화하는 것으로 구성된다. 그 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
이하 본 발명은 하기의 실시예를 통하여 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해서만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]체세포배(체세포배발생 캘러스 포함)로의 효율적인 유전자 도입
실시예 1-1: 유전자전이 재료 준비
국립원예특작과학원에서 육성된 장미 품종 'Sweet Yellow' 기내 식물체 뿌리로부터 캘러스를 유도한 후 체세포배 발생 및 2차 체세포배 발생 캘러스 유도 배지(3 mg·L-1 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 이하 "2,4-D"라 한다), 30 g·L-1 수크로오스(sucrose), 300 mg·L-1 L-프롤린(proline) 및 2.5 g·L-1 피타겔(phytagel)이 첨가된 SH 배지(Schenk and Hildebrandt's basal salts medium), 이하, 'RCP 배지'라 한다)로 옮겨 배양한 후 3~4주마다 직경 1.5~2cm로 모아서 계대배양하였다(도 2(a) 참조). 이 과정에서 도 2(b)와 같이 둥글고 겉이 매끄럽고 하얀빛을 띠는 체세포배 및 그 주변의 배발생 캘러스(이하 '시료'라 한다)를 선발하여 유전자 전이 재료로서 준비하였다. 이에 대한 상세한 설명은 본 발명의 참조로 그 내용이 전체로서 통합되는 한국특허출원 10-2008-0115875에 기술되어 있다.
실시예 1-2: 유전자를 삽입하고 있는 균배양
-70℃ 냉동고에 보관중인 아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens) AgL1 균주 저장액 1mL을 50mg·L-1의 카나마이신(Kanamycin) 및 50mg·L-1의 리팜피신(rifampicin)이 첨가된 LB(Luria-Bertani) 액체배지에 첨가한 후 28℃의 회전 인큐베이터에서 170~200rpm의 속도로 O.D.600=0.7~1.6 정도가 될 때까지 1~2일간 배양하였다.
또한, 아그로박테리움 튜메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens ) LBA4404 균주 저장액 1mL을 50mg·L-1의 스펙티노마이신(spectinomycin) 및 10mg·L-1의 테트라사이클린(tetracycline)이 첨가된 LB(Luria-Bertani) 액체배지에 첨가한 후 28℃의 회전 인큐베이터에서 170~200rpm의 속도로 O.D.600=0.7~1.6 정도가 될 때까지 1~2일간 배양하였다.
아그로박테리움 튜메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens ) AgL1은 GUS유전자(도 3a)가 삽입되어 있는, 도 3b의 개열지도로 표현되는 pCAMBIA3301벡터가 삽입되어 형질전환된 것이다. 도 3b에 도시된 것처럼, 본 발명에서 이용하는 아그로박 테리움 튜메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens ) AgL1은 GUS(β-glucuronidase) 유전자 및 PPT(phosphinothricin) 유전자의 발현이 CaMV35S 프로모터에 의해 제어되는 pCAMBIA3301벡터에 의해 형질전환되었다.
또한, 아그로박테리움 튜메파시엔스 ( Agrobacterium tumefaciens ) LBA4404은 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자(도 4a)가 삽입되어 있는, 도 4b의 개열지도로 표현되는 pMJ109 벡터가 삽입되어 형질전환된 것이다.
실시예 1-3: 시료의 균 감염 및 배양을 통한 유전자전이 시도
액체배지 상에서 O.D.600=0.7~1.6 정도가 될 때까지 배양된 아그로박테리움을 6,000rpm의 속도로 7분간 원심분리하여, 아그로박테리움 배양 배지로부터 분리된 아그로박테리움 침강 덩어리를 50μM 아세토시린곤(acetosyringone)을 첨가한 SH 액체 배지에 균질하게 섞어 아그로박테리움 현탁액을 만들었다. 상기 실시예 1-1에서 미리 준비된 체세포배 및 배발생캘러스를 상기 아그로박테리움 현탁액에 30분간 감염시킨 후 멸균된 filter paper를 이용하여 시료에 묻어 있는 아그로박테리움액을 제거하였다. 아그박테리움이 감염된 시료를 30~80μM 아세토시린곤(acetosyringone)이 첨가된 RCP배지(pH 5.2)로 옮겨 25±2℃의 온도조건과 암상태로 3일간 배양하여 시료로 유전자가 전이되도록 시도하였다.
실시예 1-4: 도입유전자 전이 확인 및 배 발아유도
GUS(β-glucuronidase) 및 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자를 전이시키기 위해 아그로박테리움과 공동배양한 체세포배 및 배발생 캘러스를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 SH 액체배지(pH 5.7)로 세척한 후 멸균된 filter paper상에서 시료에 묻어 있는 세척액을 제거하였다. 그 후, 시료를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 배 발아배지[0.1mg·L-1 인돌-3-부티르산(indole-3-butyric acid, 이하 "IBA"라 한다), 1mg·L-1 6-벤질아미노퓨린(6-benzylaminopurine, 이하 'BAP'라 한다), 30g·L-1 말토오즈(maltose), 4g·L-1 아가로즈(agarose)가 첨가된 SH 배지, 이하 'REG 배지'라 한다]로 옮겨(도 5(b) 참조), 4℃의 온도조건으로 7일간 암배양하였다. 그 후 명배양조건으로 옮겨 GUS 유전자 도입 시료의 경우 제퍼슨(1987)에 따라 GUS assay 분석에 의해 유전자 도입여부를 조사하였다. GUS 유전자전이 시도 시료 전부에 GUS 유전자가 전이되었음을 알 수 있었다(도 5(a) 참조).
[실시예 2] 유전자가 전이된 체세포배(배발생 캘러스 포함)로부터 형질전환 식물체 획득
GUS유전자의 전이가 확인되었거나 GFP유전자의 전이 시도 후 REG 선발배지에서 배양중인 시료가 체세포배인 경우에는 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 단독으로 또는 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 REG 배지로 옮기고, 배양중인 시료가 배발생 캘러스인 경우 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 단독으로 또는 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 배성숙배지(1 mg·L-1 2,4-D, 1 mg·L-1 아브시스산(abscisic acid, 이하 "ABA"라 한다), 1 mg·L-1 BAP, 0.3 mg·L-1 지베렐린(GA3), 30 g·L-1 수크로오스(sucrose), 및 4 g·L-1 아가로즈(agarose)가 첨가된 SH 배지(이하, 'REM 배지'라 한다)로 옮겨, 녹색을 띤 후(도 6(a) 참조) 신초 원기가 출현할 때까지 3주마다 배지를 교체해 주면서 배양하였다.
신초 원기가 눈으로 확인된 시료는 신초의 모습으로 생장될 때까지 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 신초유도 선발배지(0.3mg·L-1 BAP, 30g·L-1 수크로오스(sucrose), 8g·L-1 아가(agar)가 첨가된 MS 배지(Murashige and Skoog's basal salts medium)로 옮겨 배양한(도 6(b) 참조) 다음, 신초의 건실한 생장을 위해 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 신초생장 선발배지(2mg·L-1 BAP, 0.1mg·L-1 α-나프탈렌아세트산(α-naphtalene acetic acid; 이하, "NAA"라 한다), 30g·L-1 sucrose, 8g·L-1 agar가 첨가된 MS 배지)로 옮겨 배양하였다(도6(c) 참조). 그 다음 발근전 식물체의 지상부 생육을 건실하게 하기 위해 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 다신초 유도 선발배지(1mg·L-1 BAP, 0.001mg·L-1 IBA, 30g·L-1 수크로오스(sucrose), 8g·L-1 아가(agar)가 첨가된 MS 배지)로 옮겨 배양하였다(도 6(d) 참조).
[실시예 3] 선발 식물체로부터 도입 유전자 발현 확인 및 온실 순화
GUS 유전자의 전이가 확인된 후 다신초 유도 선발배지에서 생육중인 식물체의 일부를 떼어 GUS assay 분석을 한 결과, 하기 표 1 및 도 7과 같이 검정한 식물체 전체에서 GUS 유전자의 발현을 확인할 수 있었다.
GUS 유전자 전이 후 선발배지에서 획득한 신초의 GUS 유전자 발현율
구분 검정 신초 수 GUS 유전자 발현율(%)
1차 3 100
2차 5 100
계 8 100
또한 GFP 유전자전이 시도 후 신초유도 선발배지에서 유도된 신초원기를 현미경 관찰 결과, 도 8과 같이 시료를 포함한 신초원기 전체에서 도입 유전자인 GFP 유전자의 발현을 확인할 수 있었다.
이와 같이 선발 식물체의 전체에서 도입유전자가 발현된 것은 유전자전이의 재료로서 체세포배(배발생캘러스 포함)를 이용할 경우의 가장 큰 장점이 그대로 나타난 결과라 할 수 있다.
도입된 유전자의 발현이 확인된 식물체는 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 발근유도 선발배지(0.3mg·L-1 NAA, 30g·L-1 수크로오스(sucrose), 8g·L-1 아가(agar)가 첨가된 MS 배지)로 옮겨(도 9 참조) 배양하여 발근 후 온실로 옮겨, 형질전환 장미의 완전한 식물체를 얻었다.

Claims (9)

  1. 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법으로서,
    장미 품종 '스위트엘로우'의 기내식물체 뿌리에서 유도·선발된 체세포배 또는 배발생 캘러스를 GUS 유전자가 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens ) 및 GFP 유전자가 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스( Agrobacterium tumefaciens)와 공동배양하는 단계,
    상기 공동배양된 체세포배 또는 배발생 캘러스를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 배발아 선발배지에서 배양하는 단계,
    상기 배양된 체세포배 또는 배발생 캘러스를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 단독으로 또는 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 배발아 선발배지 또는 배성숙 선발배지에서 배양하는 단계,
    상기 배발아 선발배지 또는 배성숙 선발배지에서 배양한 신초원기를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 신초유도 선발배지에서 배양하는 단계,
    상기 신초유도 선발배지에서 배양된 신초를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 신초 생장 선발배지에서 배양하는 단계,
    상기 신초 생장 선발배지에서 배양된 1~1.5㎝의 신초를 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 다신초 유도 선발배지에서 배양하는 단계,
    상기 다신초 유도 선발배지에서 배양된 다신초를 50mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 발근 유도 선발배지에서 배양하는 단계, 및
    상기 발근 유도 선발배지에서 배양된 발근묘를 순화시키는 단계를 포함하는 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 공동배양은 30~80μM의 아세토시린곤(acetosyringone), 3mg·L-1의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 30g·L-1의 수크로오스(sucrose), 300mg·L-1의 L-프롤린(proline) 및 2.5g·L-1 피타겔(phytagel)이 첨가된 SH 배지(Schenk and Hildebrandt's basal salts medium)(pH 5.2)에서 25±2℃의 온도조건과 암상태로 3일간 이루어지는 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 공동배양된 체세포배 또는 배발생 캘러스를 4℃에서 7일간 암배양하는 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 배발아 선발배지는 세포탁심(cefotaxim) 이외에 0.1mg·L-1 인돌-3-부티르산(IBA), 1mg·L-1 6-벤질아미노퓨린(BAP), 30g·L-1 말토오즈(maltose), 4g·L-1 아가로즈(agarose)가 첨가되어 있는 SH 배지인, 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 단독으로 또는 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 배성숙 선발배지는 세포탁심이 단독으로 또는 세포탁심 및 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 것 외에, 1mg·L-1 2,4-D, 1mg·L-1 아브시스산(ABA), 1mg·L-1 BAP, 0.3mg·L-1 지베렐린(GA3), 30g·L-1 수크로오스(sucrose) 및 4g·L-1 아가로즈(agarose)가 첨가되어 있는 SH 배지인, 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 신초유도 선발배지는 세포탁심(cefotaxim) 및 PPT(phosphinothricin)이외에, 0.3mg·L-1 BAP, 30g·L-1 수크로오스(sucrose) 및 8g·L-1 아가(agar)가 첨가되어 있는 MS 배지(Murashige and Skoog's basal salts medium)인, 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 50mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 신초 생장 선발배지는 세포탁심(cefotaxim) 및 PPT(phosphinothricin) 이외에, 2mg·L-1 BAP, 0.1mg·L-1 α-나프탈렌아세트산(NAA), 30g·L-1 수크로오스(sucrose), 8g·L-1 아가(agar)가 첨가되어 있는 MS 배지인, 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 250mg·L-1 세포탁심(cefotaxim) 및 2mg·L-1 PPT(phosphinothricin)이 함께 첨가된 다신초 유도 선발배지는 세포탁심(cefotaxim) 및 PPT(phosphinothricin) 이외에, 1mg·L-1 BAP, 0.001mg·L-1 IBA, 30g·L-1 수크로오스(sucrose) 및 8g·L-1 아가(agar)가 첨가되어 있는 MS 배지인, 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 50mg·L-1 세포탁심(cefotaxim)이 첨가된 발근 유도 선발배지는 세포탁심(cefotaxim) 이외에, 0.3mg·L-1 NAA, 30g·L-1 수크로오스(sucrose) 및 8g·L-1 아가(agar)가 첨가되어 있는 MS 배지인, 장미 스위트엘로우 체세포배 및 배발생 캘러스를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20100056879A (ko) * 2008-11-20 2010-05-28 대한민국(농촌진흥청장) 장미 기내 식물체 뿌리로부터 고빈도 체세포배발생 캘러스 유도 및 증식

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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논문1:J. Plant Biotecnol vol.37 *
논문2:J. Plant Biotecnol vol.35 *

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20170014024A (ko) 2015-06-22 2017-02-08 대한민국(농촌진흥청장) 장미의 내건성 개선 방법
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