KR102624679B1 - 박편배양을 통한 천궁 클론묘의 대량생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박편배양을 통해 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법에 관한 것으로, 천궁 종근을 박편배양함으로써 유도된 대량의 신초 중에서 우량 신초를 선발하고, 기내에서 근경형성을 효과적으로 유도함으로써 천궁 우량 클론묘의 대량증식 및 우량 종근 확보 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 박편배양을 통한 천궁 클론묘의 대량생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천궁 종근을 박편배양하여 유도된 다수의 신초 중에서 우량 신초를 선발하여 생장시키고 근경형성을 유도한 후, 인공배지에서 수경재배하는 단계를 포함하는 천궁(Cnidium officinale Makino)의 우량 무병 클론묘를 대량생산하는 방법에 관한 것이다.
천궁(Cnidium officinale Makino)은 미나리과의 다년생 초본으로, 아시아 지역에서 재배되고 있는 약용식물이다. 천궁은 전형적인 한지형 식물로 여름철 최고기온이 28℃ 정도로 일교차가 큰 곳이 생육 적지이다. 천궁은 꽃대가 올라오는 비율이 적고 꽃이 핀다 하여도 종자가 맺히지 않는다. 따라서, 천궁의 생산 또는 개량을 위해서는 근경(뿌리줄기)을 25~30 g 정도로 나누어 심어 재배한다. 천궁의 근경은 고르지 않은 결정상 덩어리 모양으로, 표면이 어두운 갈색이고 거칠며, 돌기된 윤절이 많고, 길이는 5~10 ㎝, 지름은 3~5 ㎝이다. 한방에서는 이러한 근경을 말려서 약으로 이용하는데, 혈관을 확장시키고 혈류를 증가시켜 혈액순환 개선에 효능이 있으며, 혈액 응고, 항염증, 고혈압, 중추성 근이완 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
종근(seminal root)은 종자안의 어린 뿌리가 신장해서 생기는 뿌리로, 씨뿌리라고도 한다. 천궁은 종근 번식을 하는 대표적인 약용작물인데, 상기 종근은 병충해에 오염되기 쉽고, 여름철 기온 상승으로 인해 고사하는 경우가 많다. 또한, 병원균에 감염된 종근을 그대로 토양에 식재하여 자라난 신초를 채취해 배양할 경우, 무균배양에 실패하거나 병원균에 감염된 불량한 오염주를 증식시키게 된다. 이로 인해 천궁 종근의 수량이 감소하여 종근의 시장 가격이 상승되는 악순환 구조를 보인다. 따라서, 무병종묘 생산 기술과 스마트팜 기술을 이용한 무병의 천궁 우량묘를 대량생산하는 방법에 관한 연구가 필요한 실정이다.
또한, 천궁은 다양한 염색체수를 가지고 있어 유전적으로 완전히 안정되지 않았고 아직까지 품종화가 이루어져 있지 않기 때문에, 계통 선발을 통한 클론묘를 육성하여 안정적인 생산 체계를 구축할 필요가 있다. 클론묘는 식물의 기내(in vitro) 배양을 통하여 영양계 번식 작물에서 우수한 계통을 품종화하기 위해 이용되어져 왔으며, 1개의 신초로부터 반복적인 개체 증식을 유도하여 동일한 DNA를 가진 클론묘를 생산할 수 있다. 이 때, 증식기간이 오래 지속되면 그 과정에서 변이체가 발생되기도 하는데, 이를 효율적으로 제어하기 위해서는 단기간에 다수의 클론 개체를 증식하는 방법이 개발되어야 하며, 성공적인 클론묘 생산을 위해서는 생장이 우수하며 증식이 용이한 우량 개체를 조기 선발해야한다.
한편, 한국등록특허 제1733213호에는 '천궁의 고온 장해 경감제 및 이를 이용한 천궁의 고온 장해 경감방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1982937호에는 '천궁 추출물을 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '박편배양을 통한 천궁 클론묘의 대량생산 방법'에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 천궁의 종근을 박편배양하여 다수의 신초를 획득하였고, 박편에서 분리한 신초를 기내(in vitro) 배양한 후, 증식율 및 DNA 함량이 높은 우량 신초를 선발하여 근경형성을 유도하고 인공배지에 식재하여 수경재배한 결과, 100%의 순화율을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 천궁(Cnidium officinale Makino)의 종근을 박편배양하는 단계를 포함하는 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 천궁(Cnidium officinale Makino)의 우량 클론묘를 제공한다.
본 발명의 박편배양을 통한 천궁 클론묘의 대량생산 방법은 천궁 종근을 박편배양함으로써 유도된 대량의 신초 중에서 우량 신초를 선발하고, 기내에서 근경형성을 효과적으로 유도함으로써 천궁 우량 클론묘의 대량증식 및 우량 종근 확보 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 천궁 종근을 박편배양하여 다량의 신초를 유도하는 과정이다.
도 2는 우량 신초를 선발하기 위해 개별 신초의 증식율(A) 및 DNA 함량(B)을 분석한 그래프이다. DNA 함량이 높은 그룹(HD), 중간 그룹(MD), 낮은 그룹(LD)으로 나누었다. 도면 내 서로 다른 문자 a~c는 서로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 3은 선발된 우량 신초에서 근경형성을 유도한 사진(A) 및 수크로즈 또는 앱시스산 농도에 따른 근경 형성율을 분석한 그래프(B)이다. 도면 내 서로 다른 문자 a~c는 서로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 4는 근경이 형성된 클론묘를 그로우폼에 식재하여 순화시킨 후, 생체중(A), 엽수(B), 엽장(C), 엽면적(D)을 분석한 그래프이다.
도 2는 우량 신초를 선발하기 위해 개별 신초의 증식율(A) 및 DNA 함량(B)을 분석한 그래프이다. DNA 함량이 높은 그룹(HD), 중간 그룹(MD), 낮은 그룹(LD)으로 나누었다. 도면 내 서로 다른 문자 a~c는 서로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
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도 4는 근경이 형성된 클론묘를 그로우폼에 식재하여 순화시킨 후, 생체중(A), 엽수(B), 엽장(C), 엽면적(D)을 분석한 그래프이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천궁(Cnidium officinale Makino) 종근을 박편배양하는 단계를 포함하는 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "박편배양(slice culture)"은 종근을 절단하여 배양하는 것을 의미하며, 이를 통해 병원균에 감염된 종근을 구별하고, 정아우세(apical dominance) 현상을 억제시키며 종근 표면에 존재하는 잠아(dormant bud) 발달을 유도하여 다수의 신초를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법은, 구체적으로
(a) 표면살균한 천궁 종근을 1~10 ㎜ 두께로 절단하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 절단한 종근 박편을 배양하여 신초를 유도하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 유도된 신초를 박편에서 분리하고 기내(in vitro)에서 신초배양배지에 치상하여 3~5주간 배양한 후, 우량 신초를 선발하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 선발된 우량 신초를 근경형성배지에 치상하고 5~7주간 배양하여 근경이 형성된 클론묘를 생장시키는 단계;를 포함하는 것일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 종근 절단은 더욱 바람직하게는 3~7 ㎜ 두께로 절단하는 것일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 5 ㎜ 두께로 절단하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (b) 단계의 박편배양은 바람직하게는 4~6 ㎎/ℓ 벤질아데닌(benzyladenin)을 첨가한 멸균수에서 장일조건으로 5~9일간 이루어지는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5 ㎎/ℓ 벤질아데닌을 첨가한 멸균수에서 16시간/일의 광조건으로 7일간 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (c) 단계의 우량 신초 선발은 증식율 및 DNA 함량 분석을 통해 우량 클론을 선발하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 상기 (c) 단계의 신초배양배지는 바람직하게는 0.5~1.5 ㎎/ℓ 벤질아데닌 및 2~4%(w/v) 수크로즈를 포함하는 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 ㎎/ℓ 벤질아데닌 및 3%(w/v) 수크로즈를 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (d) 단계의 근경형성배지는 바람직하게는 3~7%(w/v) 수크로즈를 포함하거나 또는 3~7%(w/v) 수크로즈 및 0.3~1.5 ㎎/ℓ 앱시스산을 포함하는 배지일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5%(w/v) 수크로즈를 포함하거나 또는 5%(w/v) 수크로즈 및 0.5~1 ㎎/ℓ 앱시스산을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (d) 단계에서 근경이 형성된 클론묘의 생장은 바람직하게는 명배양 또는 암배양에서 이루어지는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5%(w/v) 수크로즈를 포함하는 배지에서 명배양하거나 5%(w/v) 수크로즈에 0.5~1 ㎎/ℓ 앱시스산을 추가로 포함하는 배지에서 암배양하는 것일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법은, 상기 근경이 형성된 클론묘를 인공배지에 식재하고 3~5주간 수경재배하여 순화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 인공배지는 바람직하게는 그로우폼(grow foam, Smithers-Oasis Korea)일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 생산된 천궁(Cnidium officinale Makino)의 우량 클론묘를 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 의해 재배된 천궁의 우량 클론묘는 생체중, 엽구, 엽장 및 엽면적 등의 생육 특성이 증진된 것으로, 무균의 우량 종근으로부터 증식되었으므로 무병묘이고, 증식율이 우수하며, 형질이 균일한 것이 특징이다. 상기 우량 클론묘의 생체중이 380~550 mg, 엽수가 6.5~10개, 엽장이 45~50 mm, 엽면적이 3~3.7 ㎠인 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 천궁 종근의 박편배양
본 발명에 사용한 천궁(Cnidium officinale Makino) 종근은 2016~2017년에 경상북도 영양과 강원도 대관령 지역에서 수확한 것을 4℃ 냉장고에서 1~2개월간 보관하다가 실험에 사용하였다. 발명에 사용한 천궁 종근 시료의 일부는 충북대학교 원예과학과에 표본 시료로 보관하였다. 천궁 종근을 흐르는 수돗물에 1시간 동안 세척하고, 살균제(벤레이트티) 1,000 ppm에 1시간 동안 침지하여 1차적으로 표면의 박테리아 및 곰팡이 포자 등을 제거하였다. 이후, 흐르는 수돗물로 다시 세척한 뒤에 표면살균을 실시하였다. 표면살균은 70%(v/v) 에탄올에서 수 초간, 2%(v/v) NaOCl에 계면활성제(tween 20)를 2~3방울 첨가한 용액에서 15분간 침지한 후 멸균수로 3회 세척하였다.
표면살균이 끝난 종근은 5 ㎜ 두께로 절단하여 병원균에 감염되지 않은 건강한 종근 박편을 육안으로 선별하였다. 직경 90 ㎜의 페트리디쉬에 멸균된 여과지를 깔고 사이토카인류의 생장조절제인 벤질아데닌(benzyladenin) 5 ㎎/ℓ이 포함된 멸균수 5 ㎖을 첨가한 후, 상기 선별된 종근 박편을 4~5개씩 놓고 24±1℃, 16시간/8시간(명/암), 35-60 μmole/m2/s PPFD 광조건으로 배양하여 신초를 유도하였다. 1주일 후, 종근 박편의 표피에서 신초를 분리하였다.
그 결과, 종근을 절단하지 않은 경우에는 종근 1개당 1~3개의 신초를 획득할 수 있는 반면, 절단한 종근을 박편배양한 경우에는 박편 1개당 5~10개의 신초를 획득할 수 있었다(도 1).
실시예 2. 신초의 기내배양 및 우량 클론 선발
MS(murashigae and skoog, pH 5.8) 배지에 2 ㎖의 PPMTM(Plant Preservation MixtureTM) 용액, 1 ㎎/ℓ의 벤질아데닌, 3%(w/v)의 수크로즈, 2.4 g/ℓ의 젤라이트를 첨가하여 신초배양배지를 제조하였다. 종근 박편에서 분리한 신초를 상기 신초배양배지에 치상하고, 24±1℃, 16시간/8시간(명/암), 35-60 μmole/m2/s PPFD 광조건으로 배양하였다. 4주 후, 새로운 신초가 발생하는 것을 확인하였으며, 신초에 클론 번호를 붙여 생장이 우수하고 증식이 활발한 클론 10개를 1차 선발하여 상기 신초배양배지에서 4주 동안 추가 배양하여 신초의 증식을 유도한 후, 증식율 및 DNA 함량을 측정하였다. 증식율은 증식 후 개체수를 증식 전 개체수로 나누어 산출하였고, DNA 함량은 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용하여 측정하였다. DNA 함량 측정을 위하여 CyStain PI Absolute P(Partec, UK)로 핵을 나출시켜 DNA를 형광염색한 뒤 CytoFLEX(Beckman Caulter, US)로 분석하였다. 내부표준물질로는 DNA 함량이 밝혀진 담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)를 사용하였다. 각 샘플 당 최소 5,000개 이상의 세포를 분석하였으며 동일 소프트웨어를 통해 통계처리한 후, DNA 함량에 따라 DNA 함량이 높은 그룹(HD), 중간그룹(MD) 및 낮은 그룹(LD)으로 나누었다.
그 결과, 1차 선발된 신초 10개의 증식율은 평균 약 2.7배였고, 증식율이 높은 클론이 DNA 함량도 높은 것을 확인하였으며, 증식율 및 DNA 함량이 가장 높은 1, 5 및 6번 클론을 우량 클론으로 최종 선발하였다(도 2).
실시예 3. 근경 형성 유도
천궁에서 약용으로 사용되는 부위는 지하부인 근경(rhizome)인데, 이 근경은 기내배양 상태에서 특별한 처리없이는 형성되지 않는다. 기내배양 상태에서 근경을 형성한 무균묘는 일반묘에 비해 순화율이 향상되고, 바로 순화시킬 수 없을 경우, 근경을 수확하여 저온저장(2~4℃)하였다가 필요할 때 식재할 수 있다. 본 발명에서는 수크로즈(sucrose) 및 앱시스산(abscisic acid)을 이용하여 기내배양된 신초에서 근경 형성을 유도하였다.
우량 클론으로 최종 선발된 1, 5 및 6번 클론을 3, 5, 7 및 9%(w/v) 수크로즈가 각각 포함된 MS 배지와 5%(w/v) 수크로즈가 포함된 MS 배지에 0.5 ㎎/ℓ, 1 ㎎/ℓ 및 2 ㎎/ℓ 앱시스산을 각각 추가로 첨가한 배지에서 6주 동안 24±1℃에서 배양하며 근경 형성을 유도하였다. 이 때, 명배양 및 암배양 각각의 상태에서 동일한 조건으로 실험을 수행하였고, 하기 식에 따라 근경 형성율(%)을 분석하였다.
근경 형성율(%)=(근경이 형성된 개체수/총 배양한 개체수)×100
그 결과, 5%(w/v) 수크로즈가 포함된 배지에서 명배양하거나 5%(w/v) 수크로즈 및 0.5 ㎎/ℓ 앱시스산이 포함된 배지에서 암배양할 때, 신초의 근경 형성이 가장 효과적으로 유도되는 것을 알 수 있었다(도 3).
실시예 4. 순화 유도
일반적으로 기내배양된 식물은 90%의 상대습도에서 자라다가 토양이 채워진 비닐 화분에 식재되어 4~8주간 외부환경(토양, 공중습도 등)에 적응하는 순화과정을 거치는데, 대부분의 식물이 외부환경 적응에 실패하여 50~60%의 순화율을 나타낸다. 이에, 본 발명은 토양을 사용하지 않고, 수분이 충분한 그로우폼(grow foam, code #: K-5730; Smithers-Oasis Korea)에서 우량 클론묘를 4주간 순화하는 방법을 사용하였다. 그로우폼에 우량 클론묘를 식재하기 하루 전, 기내배양 용기의 뚜껑을 1/2 정도 열어서 외부 공기에 적응시켰다. 이후, 우량 클론묘를 꺼내어 뿌리에 묻은 배지를 흐르는 물로 조심스럽게 제거하고 핀셋으로 1개체씩 미리 물을 적셔 놓은 그로우폼에 큐브당 1개체씩 식재하였다. 우량 클론묘를 식재한 후, 시들음을 방지하기 위하여 곧바로 투명 플라스틱 뚜껑을 덮고 명배양실에서 2일에 한번씩 물을 교체하며 1차 순화를 실시하였다. 2주 후, 뚜껑을 벗기고 일반 환경에서 배양하여 정상적인 광합성을 유도하며 4주간 2차 순화를 실시한 후, 각 개체의 생체중(mg), 엽수(개), 엽장(mm), 엽면적(㎠)을 측정하였다.
그 결과, 그로우폼을 이용하여 순화과정을 거친 천궁 우량 클론묘는 100% 순화에 성공하여 생장을 유지하는 것을 확인하였으며, 생체중은 약 380~550 mg, 엽수는 약 6.5~10개, 엽장은 약 45~50 mm, 엽면적은 약 3~3.7 ㎠으로 확인하였다(도 4).
Claims (10)
- 삭제
- (a) 표면살균한 천궁 종근을 1~10 ㎜ 두께로 절단하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 절단한 종근 박편을 배양하여 신초를 유도하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 유도된 신초를 박편에서 분리하고 기내(in vitro)에서 신초배양배지에 치상하여 3~5주간 배양한 후, 우량 신초를 선발하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 선발된 우량 신초를 3~7%(w/v) 수크로즈를 포함하거나 또는 3~7%(w/v) 수크로즈 및 0.3~1.5 ㎎/ℓ 앱시스산을 포함하는 근경형성배지에 치상하고 5~7주간 배양하여 근경이 형성된 클론묘를 생장시키는 단계;를 포함하는 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법. - 제2항에 있어서, 상기 (b) 단계의 박편배양은 4~6 ㎎/ℓ 벤질아데닌(benzyladenin)을 첨가한 멸균수에서 장일조건으로 5~9일간 이루어지는 것을 특징으로 하는 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계의 신초배양배지는 0.5~1.5 ㎎/ℓ 벤질아데닌 및 2~4%(w/v) 수크로즈를 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계의 우량 신초 선발은 증식율 및 DNA 함량 분석을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법.
- 삭제
- 제2항에 있어서, 상기 (d) 단계의 근경이 형성된 클론묘를 인공배지에 식재하고 3~5주간 수경재배하여 순화시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법.
- 제2항에 있어서,
(a) 표면살균한 천궁 종근을 1~10 ㎜ 두께로 절단하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 절단한 종근 박편을 4~6 ㎎/ℓ 벤질아데닌(benzyladenin)을 첨가한 멸균수에서 장일조건으로 5~9일간 배양하여 신초를 유도하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 유도된 신초를 박편에서 분리하고 기내(in vitro)에서 0.5~1.5 ㎎/ℓ 벤질아데닌 및 2~4%(w/v) 수크로즈를 포함하는 신초배양배지에 치상하여 3~5주간 배양한 후, 증식율 및 DNA 함량 분석을 통해 우량 신초를 선발하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 선발된 우량 신초를 3~7%(w/v) 수크로즈를 포함하거나 또는 3~7%(w/v) 수크로즈 및 0.3~1.5 ㎎/ℓ 앱시스산을 포함하는 근경형성배지에 치상하고 5~7주간 배양하여 근경이 형성된 클론묘를 생장시키는 단계;를 포함하는 천궁의 우량 클론묘를 대량생산하는 방법. - 삭제
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