KR101899140B1

KR101899140B1 - 두릅나무의 대량생산을 위한 배양방법

Info

Publication number: KR101899140B1
Application number: KR1020160051949A
Authority: KR
Inventors: 허윤선; 이정관; 박상임; 남상영
Original assignee: 충청북도 (관리부서:충청북도 농업기술원)
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2018-09-14
Also published as: KR20170122945A

Abstract

본 발명은 두릅나무의 대량생산을 위한 조직배양 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 두릅나무 신초 부위(유엽, 엽병) 및 뿌리 부위를 배양하여 캘러스를 유도하고 증식시킨 후, 체세포 배를 형성하여 유목(어린 식물체)로 분화시켰으며, 이를 기외 순환하여, 유목으로부터 성목을 생산하는 단계, 및 각 단계에서의 최적 배양배지 조건을 확립하여 '해뜰날3호'의 두릅나무 묘목을 재배한 결과, 본 발명의 조직배양 묘목(배양묘)은 근삽묘와 비교하여 신초 수가 많고, 생존율이 높았으며, 또한 배양묘와 근삽묘의 정식 1년 차 새순(두릅 순) 특성을 조사한 결과, 배양묘의 새순 직경 및 무게가 증가함을 확인하여, 본 발명의 배양방법을 통해, 기존의 근삽묘보다 품질이 우수하고, 생존율이 높은 두릅나무 '해뜰날3호'의 배양묘를 재배하는 데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

두릅나무의 대량생산을 위한 배양방법{Method of plant culture for mass propagation of Aralia elata Seem}

본 발명은 두릅나무(Aralia elata Seem)의 대량생산을 위한 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 두릅나무의 신초 부위(어린 잎, 잎자루) 또는 뿌리 부위를 이용한 조직배양시 최적의 배양 배지 조건을 확립하여, 두릅나무 신품종인 "해뜰날 3호"를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 빠른 경제성장을 동반한 웰빙(Wellbeing)과 힐링(Healing)의 트렌드로 인해, 생리활성 및 약용성분이 많은 친환경 임산물에 대한 관심이 높아져 실제 소비로 이어지는 추세이다. 특히, 비타민 A와 C, 칼슘, 섬유질 함량이 높고, 기능성 성분인 Oleanolic acid, α-terilne, saponin 등이 풍부하여 예로부터 '산채의 제왕'이라 불리는 두릅 순의 소비가 증가하고 있으며, 이에 국내 두릅 생산량은 연간 2,600톤, 생산액은 220억 원에 이르고 있다.

두릅나무(Aralia elata Seem)는 오갈피나무과에 속하는 낙엽관목으로서 우리나라뿐만 아니라 일본, 중국 등에 널리 분포되어 있다. 재래종 나무두릅을 보통 참두릅이라 부르며, 이와 유사형태의 나물로는 땅두릅 또는 땃두릅으로 불리는 독활(獨活)이 있는데 맛과 향 등 품질 면에서 나무두릅이 월등히 높다고 알려져 있다. 두릅은 두릅나무의 어린 순을 일컫는데 독특한 향과 쌉쌀한 맛을 지녀 데침, 튀김, 산적나물, 샐러드, 무침, 염장 조림 등에 이용되고 있으며, 봄철 고급 산채류로 각광받고 있어 매년 재배면적이 증가하고 있다. 또한, 두릅에는 다양한 기능성 성분이 함유되어 있어 해열, 강장, 건위, 이뇨, 진통, 수렴, 거담 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 나무의 뿌리나 줄기 껍질은 총목피, 총근피라 하여 약용으로도 이용되어 왔다.

기존 두릅나무보다 품질이 뛰어난 신품종을 개발하기 위하여 많은 연구자들이 노력을 하였고, 그 중 ㈜해뜰날에서 육성한 두릅나무인 신품종 '해뜰날 3호'는 2011년 9월 국립산림품종관리센터에 품종보호등록(출원번호: 2011-11)된 이후 전국적으로 보급되고 있으며, 이의 특징은 다음과 같다:

① 정아(頂芽, 머리순)에서 자란 두릅 순의 직경은 2～3.5㎝, 길이는 20～25㎝로 굵고 커서 상품성이 높음;

② 두릅 순에 가시가 거의 없고 부드러워 식감이 우수함;

③ 일반 두릅보다 개아(開芽) 시기가 1주 정도 빠르고 생산량이 많아 경제성 우수함; 및

④ 내한성이 강하여 월동기 고사 피해발생 적음.

두릅나무는 일반적으로 뿌리 삽목(근삽)으로 번식하는데 뿌리 삽수(종근)는 반드시 병해가 없는 건전한 것을 사용해야만 입고역병 등의 병해 발생을 줄일 수 있다. 입고역병 등은 대부분 뿌리 삽수로 감염되는 병원균이 원인이며, 특히 병원균이 감염된 상태의 뿌리 삽수를 절단하여 삽목하는 경우 피해가 심각하므로 반드시 병해가 없는 무병의 나무 뿌리를 선택하여 번식시켜야 한다. 근삽은 보통 3월 중순~4월 초순 사이에 실시하는데, 뿌리 삽수 채취 시기가 초봄의 1∼2개월로 한정되어 있고, 뿌리 삽수 채취를 위한 다량의 묘목이 필요하며, 뿌리 절단으로 입고역병 발생이 쉬워지므로 근삽 방법만으로는 우량의 두릅나무 묘목을 단기간 내 대량 생산하기는 어려운 실정이다. 따라서 관행적인 기존의 묘목 번식방법을 개선할 수 있는 효율적인 묘목 증식 기술이 필요한 실정이다.

식물의 눈, 잎, 줄기, 뿌리 등의 조직을 인공적인 기내 환경에서 배양하여 온전한 식물체로 생산하는 기술을 “조직배양”이라고 하는데, 온도 및 습도가 조절되는 배양실 안에서 유리병이나 시험관 등의 배양용기 내에 식물체가 자랄 수 있는 양분을 넣고 오염이 없는 무균상태에서 식물체를 키우는 기술을 말한다. 이러한 조직배양 기술은 계절에 상관없이 연중 묘목 생산이 가능하여, 적정한 배양조건이 확립되면 기내 식물체를 일시에 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다.

배양기관 중, 잎절편(엽편)이나 뿌리 조직을 이용하여 신초 형성 및 식물체 재분화를 유도하는 배양 방법은 식물이 가지고 있는 분화능력인 전형성능(totipotency, 全形成能)을 이용하는 것으로, 단세포 혹은 식물 조직 일부분으로부터 완전한 식물체가 재생되는 능력을 말한다. 모든 세포가 전형성능을 지니고 있지만 세포조직의 분화 정도, 채취 부위, 배지의 조성, 배양 환경 등에 따라 발현되는 결과는 현저히 차이가 나므로, 작물의 종류 또는 품종의 종류에 따른 배양 조건의 최적화가 필요하다.

일반적으로 잎절편(엽편)이나 뿌리 조직으로로부터 신초 재분화(shoot regeneration)를 유도하려면 미분화된 부정형의 세포덩어리인 캘러스(callus)를 형성한 후, 신초가 형성되는 과정을 거치게 되므로, 배양 초기에 왕성한 캘러스 형성 능력 또는 직접적인 신초 분화 능력을 유도하는 배양 조건을 찾는 것이 가장 중요하다. 캘러스(callus)란 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리로 식물에 상처가 났을 때 상처 주변 조직의 세포분열이 왕성해지면서 증식된 세포덩어리이다. 배양체 조직 절편의 상태나 배양 환경에 따라 캘러스의 형성 및 생장이 다르게 나타나며 적정 식물호르몬(식물생장조절제) 등이 포함된 영양 배지에서 배양하면 온전한 식물체로 분화 가능하다.

국내에서는 땅두릅, 나무두릅, 가시가 없는 민두릅나무 등의 조직배양 연구가 이루어진 바 있으나, 선행 연구와 동일한 조건으로 신품종 “해뜰날 3호”를 배양한 결과, 배양체로부터 어린 식물체로 분화하기까지 소요되는 기간이 길고(1년 이상) 배양체의 갈변현상이 심하게 발생하여 증식효율이 저조한(20% 미만) 문제점이 있었다.

따라서 우량 신품종 두릅나무 “해뜰날3호”의 저비용/고효율 묘목 대량 생산을 위하여 일시에 다량의 균일한 배양체를 획득하고 증식속도를 높여 배양기간을 단축하는 새로운 조직배양 기술의 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자들은 체세포 배(somatic embryo)로부터 식물체를 분화시키는 배양방법을 기초로하여, 두릅나무 "해뜰날3호"의 신초 부위(유엽, 엽병) 및 뿌리 부위를 배양하여 캘러스(부정형의 세포덩어리)를 유도하고 증식시키고, 체세포 배(종자의 배와 같이 기관을 분화하는 체세포)를 형성하여 유목(어린 식물체)으로 분화시킨 후, 이를 기외 순화하여, 두릅나무 묘목을 대량으로 증식하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 두릅나무 체세포 배(somatic embryo) 배양방법을 이용하여 두릅나무 신품종 “해뜰날3호”의 대량생산을 위한 기내 유식물체 형성을 최적화할 수 있는 적정 배양방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 두릅나무의 신초 부위 또는 뿌리 부위를 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 캘러스를 증식시켜 체세포 배를 형성하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 체세포 배로부터 유목(어린 식물체)을 분화시키는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 유목을 기외 순화시켜 성목을 생산하는 단계를 포함하는 두릅나무 신품종 "해뜰날3호"의 대량증식을 위한 배양방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 배양방법으로 제조된 두릅나무 신품종 “해뜰날3호”의 배양묘를 제공한다.

본 발명에서 두릅나무 신초 부위(유엽, 엽병) 및 뿌리 부위를 배양하여 캘러스(부정형의 세포덩어리)를 유도하고 증식시킨 후, 체세포 배(종자의 배와 같이 기관을 분화하는 체세포)의 형성을 통해 어린 식물체로 분화시켰으며, 이를 기외 순화시켜, 유목으로부터 성목을 생산하여, '해뜰날3호'의 두릅나무 묘목을 제조한 결과, 본 발명의 조직배양 묘목의 신초 수는 주당 22.8개로 근삽묘 대비 2배 증가하였으며 생존율 또한 14% 증가하였고, 또한 정식 1년차 새순(두릅순) 특성을 조사한 결과, 새순의 길이는 거의 유사하였으나 근삽묘 대비 조직배양묘의 새순 직경이 12%, 무게는 9% 정도 증가함을 확인하여, 본 발명의 배양방법은 두릅나무 신품종 '해뜰날3호'의 배양묘를 재배하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

관련하여, 본 발명의 두릅나무 '해뜰날3호' 품종의 대량생산을 위한 배양방법은 농가 보급 위한 연중 묘목생산 시스템 확립, 우량묘목 자급화로 수입 묘목 대체 및 로열티 절감, 국산 건강 먹거리에 대한 다양한 소비자 요구 능동 대처 등을 가능하게 하는 효과가 있다.

도 1은 재래종(좌)과 신품종 “해뜰날3호”(우)의 두릅 순의 비교를 나타낸 도이다.
도 2는 배양 부위별 캘러스 및 체세포 배의 비교를 나타낸 도이다.
도 3은 유식물체의 배양 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 기외 순화 2개월 째에 유목의 모습이다.
도 5는 기외 순화 4개월, 5개월, 및 6개월의 유목의 모습이다.
도 6은 근삽묘와 본 발명의 배양묘의 정식 1년차 새순(두릅 순)의 비교를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

상기 단계 1)의 신초 부위를 이용한 배양은 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 0.5 내지 1.5㎎/L, 6-Benzylaminopurine (BAP) 0.1 내지 0.3㎎/L, 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 0.5 내지 1.5㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.5 내지 1.5g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 50 내지 150㎎/L를 포함하는 배지에서 실시하는 것이 바람직하고, 암 상태에서 6 내지 10주간 실시하는 것이 바람직하고, 8주인 것이 보다 바람직하다.

상기 단계 1)의 뿌리 부위를 이용한 배양은 6-Benzylaminopurine (BAP) 0.5 내지 1.5㎎/L, Naphthalene acetic acid (NAA) 0.1 내지 0.3㎎/L, 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 0.5 내지 1.5㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.5 내지 1.5g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 50 내지 150㎎/L를 포함하는 배지에서 실시하는 것이 바람직하고, 암 상태에서 6 내지 10주간 실시하는 것이 바람직하고, 8주인 것이 보다 바람직하다.

배지에 첨가되는 아스코르빈산은 비타민 C로써 식물 조직배양 기본배지에 첨가하여 사용하는 경우 배양체에서 생기는 페놀 화합물(phenolic compound)의 발생을 억제하여 배양 식물체의 갈변(browning) 또는 흑변(blackening)현상을 감소시키고 건전한 배양묘의 생산효율을 높이는 효과를 나타낸다. L-글루타민은 유기 질소원(organic nitrogen source)으로써 세포분열에 필요한 에너지원 역할을 하여 캘러스 및 체세포 배 생장과 증식에 도움을 줄 수 있다. 미오이노시톨은 비타민 B복합체의 구성성분인 이노시톨형 성분으로 생체의 막 구성 성분이기도 하여 세포벽 생합성이나 다당류의 생합성에 사용되는 성분이며, 식물 조직배양에서는 생장촉진물질로써 사용되고 있어 식물의 캘러스 배양뿐만 아니라 배배양, 생장점배양 등에서도 활용되고 있다.

따라서 상기 배지에 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조정제(식물호르몬)인 옥신(Auxin) 계통의 2,4-D, NAA 및 시토키닌(Cytokinin) 계통의 BAP 뿐만 아니라 아스코르빈산, L-글루타민, 미오이노시톨을 첨가하는 경우 두릅나무의 캘러스 유도에 유리하였다.

상기 단계 2)의 체세포 배 형성은 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 0.5 내지 1.5㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.25 내지 0.75g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 50 내지 150㎎/L를 포함하는 배지에서 실시하는 것이 바람직하고, 암 상태에서 3 내지 5주간 실시하는 것이 바람직하고, 4주인 것이 보다 바람직하다.

상기 배지에 식물세포의 분열, 증식 및 생장을 촉진시키는 식물생장조정제(식물호르몬)는 첨가하지 않고 아스코르빈산, L-글루타민, 미오이노시톨을 첨가하여 두릅나무의 캘러스로부터 체세포 배 형성율을 증가시키고 체세포 배 증식 및 생장을 가능케 하였다.

배발생 능력을 지닌 캘러스를 계속 유지해야 배발생 단계를 거쳐 어린 식물체가 정상적으로 분화할 수 있기 때문에, 체세포 배의 증식은 배발생 캘러스의 유지를 위하여 매우 중요하다. 두릅나무 캘러스의 색깔은 연초록색, 노란색, 연한 노란색, 갈색, 흰색 등인데, 체세포 배 형성율이 높은 배발생 캘러스는 주로 연한 노란색 또는 노란색을 띠며 부스러지기 쉽다. 따라서 이러한 연한 노란색 또는 노란색의 배발생 캘러스를 따로 분리하여 체세포 배 유도 배지에 증식해야 한다.

또한, 상기 단계 3)의 분화는 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 0.5 내지 1.5㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.25 내지 0.75g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 50 내지 150㎎/L를 포함하는 배지에서 실시하는 것이 바람직하고, 명 상태에서 6 내지 10주간 실시하는 것이 바람직하고, 8주인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 두릅나무 신초 부위(유엽, 엽병) 및 뿌리 부위를 배양하여 캘러스를 유도하고 증식시킨 후, 체세포 배의 형성을 통해 어린 식물체로 분화시켰으며, 이를 기외 순화시켜, 유목으로부터 성목을 생산하여, '해뜰날3호'의 두릅나무 묘목을 제조한 결과, 본 발명의 조직배양 묘목의 신초 수는 주당 22.8개로 근삽묘 대비 2배 증가하였으며 생존율 또한 14% 증가하였고, 또한 정식 1년차 새순(두릅순) 특성을 조사한 결과, 새순의 길이는 거의 유사하였으나 근삽묘 대비 조직배양묘의 새순 직경이 12%, 무게는 9% 정도 증가함을 확인하였다(표 10 및 표 12, 도 6 참조).

따라서, 본 발명의 배양방법은 두릅나무 신품종 '해뜰날3호'의 배양묘를 재배하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 신초 어린 잎( 유엽 , 幼葉 ) 및 잎자루( 엽병 , 葉柄 ) 조직으로부터 캘러스 유도 배양

두릅나무의 어린 잎 및 잎자루 조직으로부터 캘러스를 유도하기 위하여, 하기와 같이 실시하였다.

구체적으로, 4월에 두릅나무 신품종 “해뜰날3호”의 묘목의 신초로부터 어린 잎(유엽)과 잎자루(엽병) 부위를 채취한 후, 실험실에서 흐르는 물에 2분간 표면 세척하였다. 그런 다음, 클린벤치(무균작업대)에서 70% 에탄올이 담긴 멸균 유리병(외경 81㎜, 높이 132㎜)에 30 초간 어린 잎과 잎자루 조직을 침지하여 표면을 소독하고 2% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액이 담긴 멸균 유리병에서 10분 동안 침지하여 1회 소독한 후 멸균수가 담긴 유리병에서 5분씩 3회 세척하였다.

그 후, 세척 및 소독이 완료된 유엽 및 엽병 조직을 캘러스 형성 유도용 배지로써, Murashige & Skoog Medium (MS 배지, Including Modified Vitamins, M0245, Duchefa)에 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 수크로오스 (Sucrose) 20g/L, 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 1㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 1g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 100 ㎎/L, 겔라이트 (Gelrite) 3g/L, 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 1㎎/L, 6-Benzylaminopurine (BAP) 0.2㎎/L 및 PPM(Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology) 1㎖/L를 첨가하여 제조한 후, 배지의 pH를 5.8로 조정하였고, 고압멸균(121℃, 1.2 kgf·cm-2 pressure, 15분) 한 후 사용하였다.

그런 다음, 상기 배지 100 ㎖이 들어있는 식물 배양용 페트리디쉬(plant culture dish, 외경 100㎜, 높이 40㎜)에 치상한 후, 광을 차단한 암상태에서 8주간 배양하였다. 유엽을 배지에 치상할 때에는 잎의 중앙맥인 중심맥 (main vein, midrib, 엽신의 중앙 기부에서 끝을 향해 있는 커다란 맥. 주된 잎맥으로 보통 가장 굵은 맥을 말함)을 포함하여 가로와 세로의 길이가 각각 1㎝ 정도 되게 잎의 가장자리를 메스로 잘라낸 후 잎의 윗면이 배지에 닿도록 하여 치상하였다. 엽병 조직은 상처가 없는 부위를 골라 길이가 1㎝ 되게 메스로 잘라낸 후 배지에 치상하였다.

성 분 명	함 량	비 고
NH₄NO₃	1650.00 ㎎/L
MgSO₄	180.54 ㎎/L
KNO₃	1900.00 ㎎/L
KH₂PO₄	170.00 ㎎/L
CaCl₂	332.02 ㎎/L
CoCl₂6H₂O	0.025 ㎎/L
ZnSO₄7H₂O	8.60 ㎎/L
Na₂MoO₄2H₂O	0.25 ㎎/L
MnSO₄H₂O	16.90 ㎎/L
H₃BO₃	6.20 ㎎/L
KI	0.83 ㎎/L
FeNaEDTA	36.70 ㎎/L
CuSO₄5H₂O	0.025 ㎎/L
Glycine	2.00 ㎎/L
Myo-Inositol	200.00 ㎎/L	배지포함 100 ㎎/L + 추가 100 ㎎/L
Thiamine HCl	1.00 ㎎/L
Nicotinic acid	0.50 ㎎/L
Pyridoxine HCl	0.50 ㎎/L
Ascorbic acid	1.00 ㎎/L
2,4-D	1.00 ㎎/L
BAP	0.20 ㎎/L
PPM	1 ㎖/L
L-glutamine	1.00 g/L
Sucrose	20.00 g/L
Gelrite	3.00 g/L
배지의 pH	5.8

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 배양 8주 후 어린 잎(유엽) 및 잎자루(엽병)에서 유래된 캘러스 형성율은 각각 평균 63.2% 및 71.5% 이었고, 식물체로 분화할 수 있는 능력을 갖는 체세포 배 형성 전 단계인 배발생 캘러스의 유도율은 각각 69.7% 및 73.3%임을 확인하였다(표 2).

배 양 부 위	캘러스 형성율 (%)	배발생 캘러스 유도율 (%)
유 엽	63.2±2.9^z	69.7±3.9
엽 병	71.5±4.0	73.3±4.5

^zEach value represents the mean±SE.

< 실시예 2> 뿌리 조직으로부터 캘러스 유도 배양

두릅나무의 뿌리 조직으로부터 캘리스를 유도하기 위하여, 하기와 같이 수행하였다.

구체적으로, 4월에 두릅나무 신품종 “해뜰날3호”의 묘목의 뿌리 부위를 채취한 후, 실험실에서 흐르는 물에 2분간 표면 세척하였다. 그런 다음, 클린벤치(무균작업대)에서 70% 에탄올이 담긴 멸균 유리병(외경 81㎜, 높이 132㎜)에 30 초간 뿌리 조직을 침지하여 표면을 소독하고 2% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액이 담긴 멸균 유리병에서 10분 동안 침지하여 1회 소독한 후 멸균수가 담긴 유리병에서 5분씩 3회 세척하였다.

그 후, 세척 및 소독이 완료된 뿌리 조직을 1㎝ 정도로 절단한 후 뿌리로부터 캘러스를 형성시키는 배지로써, Murashige & Skoog Medium (MS 배지, Including Modified Vitamins, M0245, Duchefa)에 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 수크로오스 (Sucrose) 20g/L, 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 1㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 1g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 100 ㎎/L, 겔라이트 (Gelrite) 3g/L, 6-Benzylaminopurine (BAP) 1㎎/L, Naphthalene acetic acid (NAA) 0.2㎎/L 및 PPM (Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology) 1㎖/L를 첨가하여 제조하였고, 배지의 pH를 5.8로 조정하여 고압멸균(121℃, 1.2 kgf·cm^-2 pressure, 15분) 한 후 사용하였다.

상기 배지 100 ㎖이 들어있는 식물 배양용 페트리디쉬 (plant culture dish, 외경 100㎜, 높이 40㎜)에 치상한 후 광을 차단한 암상태에서 8주간 배양하였다.

성 분 명	함 량	비 고
NH₄NO₃	1650.00 ㎎/L
MgSO₄	180.54 ㎎/L
KNO₃	1900.00 ㎎/L
KH₂PO₄	170.00 ㎎/L
CaCl₂	332.02 ㎎/L
CoCl₂6H₂O	0.025 ㎎/L
ZnSO₄7H₂O	8.60 ㎎/L
Na₂MoO₄2H₂O	0.25 ㎎/L
MnSO₄H₂O	16.90 ㎎/L
H₃BO₃	6.20 ㎎/L
KI	0.83 ㎎/L
FeNaEDTA	36.70 ㎎/L
CuSO₄5H₂O	0.025 ㎎/L
Glycine	2.00 ㎎/L
Myo-Inositol	200.00 ㎎/L	배지포함 100 ㎎/L + 추가 100 ㎎/L
Thiamine HCl	1.00 ㎎/L
Nicotinic acid	0.50 ㎎/L
Pyridoxine HCl	0.50 ㎎/L
Ascorbic acid	1.00 ㎎/L
BAP	1.00 ㎎/L
NAA	0.20 ㎎/L
PPM	1 ㎖/L
L-glutamine	1.00 g/L
Sucrose	20.00 g/L
Gelrite	3.00 g/L
배지의 pH	5.8

그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 배양 8주 후 뿌리에서 유래된 캘러스 형성율은 61.9%, 배발생 캘러스 유도율은 68.4% 임을 확인하였다(표 4).

배 양 부 위	캘러스 형성율 (%)	배발생 캘러스 유도율 (%)
뿌 리	61.9±3.6^z	68.4±3.2

^zEach value represents the mean±SE.

< 실시예 3> 신초 어린 잎 및 잎자루, 및 뿌리 유래 캘러스로부터 체세포 배 유도 배양

상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>의 방법으로 기내에서 배양 중인 신초의 유엽, 엽병, 및 뿌리 조직으로부터 유래된 캘러스로부터 체세포 배를 유도하기 위하여 하기 표 5의 조성으로 제조된 배지를 이용하였다.

구체적으로, 캘러스로부터 체세포 배를 형성시키는 배지조성으로 Murashige & Skoog Medium (MS 배지, Including Modified Vitamins, M0245, Duchefa)에 표 5에 나타난 바와 같이, 수크로오스 (Sucrose) 20g/L, 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 1㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.5g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 100 ㎎/L, 겔라이트 (Gelrite) 3g/L를 첨가하여 제조하였고, 배지의 pH를 5.8로 조정하여 고압멸균(121℃, 1.2 kgf·cm^-2 pressure, 15분) 한 후 사용하였다.

그런 다음, 신초의 유엽, 엽병, 및 뿌리 유래 캘러스를 상기 배지 100 ㎖이 들어있는 식물 배양용 페트리디쉬 (plant culture dish, 외경 100㎜, 높이 40㎜)에 치상한 후 광을 차단한 암상태에서 다시 4주간 배양하였다.

성 분 명	함 량	비 고
NH₄NO₃	1650.00 ㎎/L
MgSO₄	180.54 ㎎/L
KNO₃	1900.00 ㎎/L
KH₂PO₄	170.00 ㎎/L
CaCl₂	332.02 ㎎/L
CoCl₂6H₂O	0.025 ㎎/L
ZnSO₄7H₂O	8.60 ㎎/L
Na₂MoO₄2H₂O	0.25 ㎎/L
MnSO₄H₂O	16.90 ㎎/L
H₃BO₃	6.20 ㎎/L
KI	0.83 ㎎/L
FeNaEDTA	36.70 ㎎/L
CuSO₄5H₂O	0.025 ㎎/L
Glycine	2.00 ㎎/L
Myo-Inositol	200.00 ㎎/L	배지포함 100 ㎎/L + 추가 100 ㎎/L
Thiamine HCl	1.00 ㎎/L
Nicotinic acid	0.50 ㎎/L
Pyridoxine HCl	0.50 ㎎/L
Ascorbic acid	1.00 ㎎/L
L-glutamine	0.50 g/L
Sucrose	20.00 g/L
Gelrite	3.00 g/L
배지의 pH	5.8

그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 유엽, 엽병, 및 뿌리 유래의 캘러스로부터 체세포 배의 형성율은 각각 77.5%, 85.4%, 및 71.1%임을 확인하였다(표 6).

배 양 부 위	체세포 배 형성·증식율 (%)
유엽	77.5±4.5^z
엽병	85.4±4.3
뿌리	71.1±3.9

^zEach value represents the mean±SE.

< 실시예 4> 체세포 배의 어린 식물체( 유식물체 , 幼植物體 ) 로의 재분화

상기 <실시예 3>의 4주간 배양한 체세포 배를 발아시켜 어린 식물체로 재분화시키기 위해서 하기 표 7의 조성의 배지를 사용하였다.

구체적으로, 체세포 배로부터 어린 식물체를 형성시키는 배지조성으로 1/2농도의 Murashige & Skoog Medium (MS 배지, Including Modified Vitamins, M0245, Duchefa)에 표 7에 나타난 바와 같이, 수크로오스 (Sucrose) 20g/L, 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 1㎎/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 100 ㎎/L, 겔라이트 (Gelrite) 3g/L를 첨가하여 제조하였고, 배지의 pH를 5.8로 조정하여 고압멸균(121℃, 1.2 kgf·cm^-2 pressure, 15분) 한 후 사용하였다.

성 분 명	함 량	비 고
NH₄NO₃	825.00 ㎎/L
MgSO₄	90.27 ㎎/L
KNO₃	950.00 ㎎/L
KH₂PO₄	85.00 ㎎/L
CaCl₂	166.01 ㎎/L
CoCl₂6H₂O	0.0125 ㎎/L
ZnSO₄7H₂O	4.30 ㎎/L
Na₂MoO₄2H₂O	0.125 ㎎/L
MnSO₄H₂O	8.45 ㎎/L
H₃BO₃	3.10 ㎎/L
KI	0.415 ㎎/L
FeNaEDTA	18.35 ㎎/L
CuSO₄5H₂O	0.0125 ㎎/L
Glycine	1.00 ㎎/L
Myo-Inositol	150.00 ㎎/L	배지포함 50 ㎎/L + 추가 100 ㎎/L
Thiamine HCl	0.50 ㎎/L
Nicotinic acid	0.25 ㎎/L
Pyridoxine HCl	0.25 ㎎/L
Ascorbic acid	1.00 ㎎/L
Sucrose	20.00 g/L
Gelrite	3.00 g/L
배지의 pH	5.8

4주간 빛이 차단된 암환경에서 배양 중인 체세포 배를 상기 배지 100 ㎖이 들어있는 식물 배양용 유리병(plant culture vessle, 외경 10㎜, 높이 130㎜)에 치상한 후 명상태에서 다시 8주간 배양하였다.

그 결과, 표 8 및 도 2에 나타난 바와 같이, 유식물체(유목) 형성율은 평균 87.9% 이었고, 분화된 유식물체 초장의 길이는 33.8㎜, 뿌리의 길이는 12.7㎜ 임을 확인하였다(표 8 및 도 2).

배 양 부 위	유식물체 형성율 (%)	유식물체 생육특성
배 양 부 위	유식물체 형성율 (%)	Shoot length (㎜)	Root length (㎜)
유 엽	87.5±2.8^z	35.3±3.1	12.8±1.0
엽 병	91.0±3.9	34.5±2.7	13.0±1.4
뿌 리	85.3±3.8	31.7±3.0	12.3±1.2

^zEach value represents the mean±SE.

< 실시예 5> 기외 순화

배양병에서 배양 중인 유식물체는 기내에서 기외로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖출 수 있다. 따라서, 상기 <실시예 4>의 배양병에서 유식물체를 꺼낸 후, 유식물체에 배지가 남아있지 않도록 부드럽게 깨끗이 물로 씻어낸 다음, 원예용 상토:펄라이트가 2:1(v:v)로 혼합된 상토가 담긴 화분(내부 직경 110 mm, 높이 113 mm)에 상기 유식물체를 심었다. 그 후, 햇빛의 40%가 차광되며 최고 25℃, 최저 18℃로 유지되는 온실 또는 순화실에서 순화시키면서 키웠고, 식물체의 순화율을 높이기 위하여, 공중습도가 80% 정도 유지되게 조절하였다. 그런 다음, 기외순화 4주 후부터 공중습도를 천천히 낮춰주며 키웠고, 기외순화 4주 후부터는 유식물체의 상태를 확인하면서 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다. 기외순화 2개월~8개월 후의 식물체 생육특성 조사 결과는 표 9, 도 3, 도 4에 나타내었다.

기외 순화 기 간	식물체 높이 (㎝)	식물체 직경 (㎜)	신초			생존율 (%)
기외 순화 기 간	식물체 높이 (㎝)	식물체 직경 (㎜)	길이 (㎝)	직경 (㎜)	개수 (개/tree)	생존율 (%)
2개월	4.2±0.3^z	1.9±0.1	2.5±0.2	1.0±0.1	3.2±0.3	88.9±4.3
4개월	9.7±1.0	3.1±0.2	6.8±0.5	1.5±0.1	5.0±0.4	92.5±3.8
5개월	22.1±2.3	4.0±0.2	11.3±1.1	1.9±0.1	5.2±0.5	95.3±4.0
6개월	41.6±3.8	6.8±0.4	15.6±1.4	2.3±0.2	5.3±0.5	94.6±4.9

^zEach value represents the mean±SE.

< 실험예 1> 생육특성의 확인

순화가 완료된 유식물체를 노지 포장에 정식한 후(포기사이 60㎝, 골 사이 1m 간격으로 묘목 정식) 6개월 정도 재배하여 두릅나무 “해뜰날3호” 조직배양묘의 생육특성 결과를 확인한 결과, 표 10에 나타난 바와 같이, 관행 번식묘인 근삽묘와 비교했을 때 나무의 높이나 직경은 큰 차이가 없었고, 조직배양 묘목의 신초 수는 주당 22.8개로 근삽묘 대비 2배 증가하였으며 생존율 또한 14% 증가하였고, 또한 정식 1년차 새순(두릅순) 특성을 조사한 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, 새순의 길이는 거의 유사하였으나 근삽묘 대비 조직배양묘의 새순 직경이 12%, 무게는 9% 정도 증가함을 확인하였다.

구 분	나무높이 (㎝)	나무직경 (㎜)	신초			생존율 (%)
구 분	나무높이 (㎝)	나무직경 (㎜)	길이 (㎝)	직경 (㎜)	개수 (개/tree)	생존율 (%)
근삽묘(대비)	77.5±4.4^z	22.2±2.4	28.5±2.0	3.7±0.3	11.3±1.4	80.3±3.2
조직배양묘	78.8±4.1	23.7±2.6	30.3±2.4	3.8±0.3	22.8±2.6	91.7±3.8

^zEach value represents the mean±SE.

구 분	길이 (㎝)	직경 (㎜)	무게 (g)	색	가시 유무
근삽묘(대비)	14.8±1.1^z	13.3±1.5	13.5±1.2	Green	유
조직배양묘	15.2±1.2	14.9±1.6	14.7±1.3	Green	유

^zEach value represents the mean±SE.

따라서, 본 발명의 배양방법을 통해, 기존의 근삽묘 보다 신초수 및 생존율이 증가하고, 크기가 큰 새순을 갖는 두릅나무 '해뜰날3호'의 배양묘를 재배할 수 있다.

Claims

1) 두릅나무의 신초 부위 또는 뿌리 부위를 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 캘러스를 증식시켜 체세포 배를 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 체세포 배로부터 유목(어린 식물체)을 분화시키는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 유목을 기외 순화시켜 성목을 생산하는 단계를 포함하는 두릅나무 신품종 "해뜰날3호"의 대량증식을 위한 배양방법이되,

상기 단계 1)의 신초 부위를 이용한 캘러스 유도 단계는 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 0.5 내지 1.5㎎/L, 6-Benzylaminopurine (BAP) 0.1 내지 0.3㎎/L, 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 0.5 내지 1.5㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.5 내지 1.5g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 50 내지 150㎎/L를 포함하는 배지에서 실시하고; 및

상기 단계 2)의 체세포 배 형성은 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 0.5 내지 1.5㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.25 내지 0.75g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 50 내지 150㎎/L를 포함하는 배지에서 실시하는 것을 특징으로 하는 배양방법.

삭제

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 신초 부위를 이용한 배양은 암 상태에서 6 내지 10주간 실시하는 것을 특징으로 하는 배양방법.

1) 두릅나무의 뿌리 부위를 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 캘러스를 증식시켜 체세포 배를 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 체세포 배로부터 유목(어린 식물체)을 분화시키는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 유목을 기외 순화시켜 성목을 생산하는 단계를 포함하는 두릅나무 신품종 "해뜰날3호"의 대량증식을 위한 배양방법이되,

상기 단계 1)의 뿌리 부위를 이용한 캘러스 유도 배양은 , 6-Benzylaminopurine (BAP) 0.5 내지 1.5㎎/L, Naphthalene acetic acid (NAA) 0.1 내지 0.3㎎/L, 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 0.5 내지 1.5㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.5 내지 1.5g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 50 내지 150㎎/L를 포함하는 배지에서 실시하는 것을 특징으로 하는 배양방법.

제 4항에 있어서, 상기 단계 1)의 뿌리 부위를 이용한 배양은 암 상태에서 6 내지 10주간 실시하는 것을 특징으로 하는 배양방법.

제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 체세포 배 형성은 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 0.5 내지 1.5㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.25 내지 0.75g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 50 내지 150㎎/L를 포함하는 배지에서 실시하는 것을 특징으로 하는 배양방법.

제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 체세포 배 형성은 암 상태에서 3 내지 5주간 실시하는 것을 특징으로 하는 배양방법.

제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 단계 3)의 분화는 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 0.5 내지 1.5㎎/L, L-글루타민 (L-glutamine) 0.25 내지 0.75g/L, 미오이노시톨 (Myo-inositol) 50 내지 150㎎/L를 포함하는 배지에서 실시하는 것을 특징으로 하는 배양방법.

제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 단계 3)의 분화는 명 상태에서 6 내지 10주간 실시하는 것을 특징으로 하는 배양방법.

삭제