KR20150026554A

KR20150026554A - 조직배양에 의한 양벚나무(Ｐｒｕｎｕｓａｖｉｕｍ) 클론의 번식기술 개발

Info

Publication number: KR20150026554A
Application number: KR20130105555A
Authority: KR
Inventors: 문흥규; 박소영; 한무석; 김태수
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2013-09-03
Filing date: 2013-09-03
Publication date: 2015-03-11

Abstract

본 발명은 독일 서부산림연구소에서 도입한 양벚나무(Prunus avium) 10클론(Apollo, Concordia, Europa, Fama, Hektor, Hermes, Neptun, Odyssous, Pegasus, Tiberis)의 효율적인 기내중식, 발근유도, 토양이식 순화 및 포지이식 기술을 개발하는데 있으며, 적정배지 및 생장조절제 선택, 적정한 순화용 상토의 선정 등을 목적으로 수행되었다. 본 발명은 양벚나무 클론의 효율적인 미세번식(micropropagation) 기술을 제공하고자 양벚나무 10클론의 줄기증식, 발근유도에 미치는 적정배지 및 생장조절제의 선택, 토양이식 순화에 미치는 상토조건의 구명, 폿트묘 육성, 포지이식의 단계로 구성된다. 본 발명은 양벚나무의 무성번식은 물론 아직까지 개발된 바 없는 국내산 벚나무류의 클론묘 육성에 적용 가능한 유용한 번식방법이 될 수 있다.

Description

조직배양에 의한 양벚나무(Ｐｒｕｎｕｓａｖｉｕｍ) 클론의 번식기술 개발{Development of a micropropagation technique in Prunus avium clones}

본 발명은 조직배양 기술을 이용한 양벚나무 클론의 미세번식(micropropagation) 기술로, 보다 상세하게는 신초줄기의 정아(apical bud) alc 액아(axillary bud)를 절편(explant)으로 기내배양의 방법으로 줄기증식, 발근, 순화묘 육성의 방법으로 묘목을 생산하는 무성번식(vegetative propagation) 방법에 관한 것이다.

독일산 양벚나무 클론은 독일 서부 산림연구소의 마이어 딩켈박사(A. Meier-Dinkel)에 의해 30여년 전부터 생장과 통직성에 기초한 육종과 차대검정으로 육성된 것들이다. 2011년 6월 국립산림과학원에서는 그 가운데 생장과 통직성이 뛰어난 10클론(Apollo, Concordia, Europa, Fama, Hektor, Hermes, Neptun, Odyssous, Pegasus, Tiberis)을 도입하여 조직배양에 의한 대량생산 기술을 개발하여 왔다. 하지만 양벚나무는 식물병해충의 문제로 국내로 반입이 금지된 수입금지 식물중 하나로 지정되어 있어 지난 2년간 식물검역원(수입허가 관리번호 2011-24)의 엄격한 통제 하에 제한된 실험실, 첨단온실 및 격리 포지에서 주기적인 점검 및 모니터링을 받아 왔으며 2013년 5월 병해충의 위험 문제가 없다는 검역완료 통보를 받았다. 본 발명은 이상 도입한 양벚나무 10클론의 기내 미세번식(micropropagation) 기술 개발에 관한 것이다.

국내의 벚나무류에 대한 번식기술 연구는 왕벚나무를 대상으로 집중적으로 이루어져 왔다. 김찬수 등(1993)은 제주 왕벚나무(Prunus yedoensis)의 영양아를 재료로 대량증식에 미치는 배지, 생장조절물질, 암처리의 효과를 보고하였으며, 고정군 등(1997)은 왕벚나무의 접합자 배(zygotic embryo)로부터 체세포배형성을 보고했다. 정은주 등(2000, 2001)은 왕벚나무 기내배양 적정화를 위한 동아의 채취시기, 배지조건, 생장조절제의 영향을 보고했다. 최근 김장수와 김진수(2007)은 왕벚나무 성숙목의 녹지 삽목발근에 미치는 오옥신 및 fog 처리 효과를 조사하였다.

외국에서의 벚나무류 기내배양 연구는 1990년대 초반부터 많은 연구가 진행되어 왔다. March 등(1993)은 양벚나무의 미숙배로부터 체세포배발생을 통한 식물체 형성을 보고하였고, Righetiti 등(1996)은 양벚나무의 기내배양 시 줄기생장에 미치는 이산화탄소와 산소의 비율을 조사하여 이산화탄소 포화조건으로 배양하는 경우 biomass가 증가됨을 보고하였다. Hammatt와 Grant(1998)은 세로티나 벚나무(Prunus serotina E.)와 양벚나무(Prunus avium)의 기내배양체를 재료로 잎조직에서 줄기재생에 미치는 배지 및 생장조절제, 유전자형의 효과를 비교하였다. Reidiboym-Talleux 등(1999)은 양벚나무의 배발생 조직에 maltose를 처리하여 체세포배 유도를 관찰하였다. Maltose 농도에 따라서 배발생 line 별 반응이 다르게 나타났으며, maltose와 ABA의 혼용처리 결과도 배발생 line에 따라 반응이 달랐다. 체세포배의 저온처리로 반투명을 띠는 체세포배로부터 35.2%의 식물체를 재생하였다. Bhagwat와 Lane(2004)는 양벚나무 품종 Lapins와 Sweetheart의 기내식물 잎조작에서 중기재생에 미치는 생장조절제, 절편의 형태, 치상방향, 상처처리 효과를 검토하였다. 최적의 조건은 WPM 배지에 잎절편의 중심맥을 가로질러 자르고, 잎 이면이 배지에 접촉되며, TDZ와 NAA의 혼용처리로 가장양호한 결과를 얻었다. Matt와 Jehle(2005)는 양벚나무 기내 절간조직의 잎조직에서 부정아 유도를 시험하였다. 배지는 DKW/WPM(1:1) 혼용배지와 QL (Quoirin/Lepoivre medium)배지에서 양호하였으며 암처리는 효과가 없었다. TDZ와 IBA의 혼용처리가 효과적이었으며 유전자형에 따른 차이가 컸다. 절편은 절간조직이 잎 절편보다 부정아 형성에 효과적이었다. Kitin 등(2005)은 MS 배지에 다양한 농도의 BA를 처리하여 보통의 줄기와 다발성 줄기(fasciated shoot)를 얻었으며 줄기형성에 미치는 여러 가지 요인을 조사하였다. Durkovic(2006)은 양벚나무의 성숙목을 대상으로 기내 줄기형성에 미치는 생장조절제 요인을 검토하여 BA와 TDZ 혼용 처리로 가장 많은 줄기를 얻을 수 있었다. BA + NAA, BA + IBA 처리간 차이는 없었으나 줄기의 생장은 BA 농도에 크게 좌우되었다. 유도된 줄기는 IBA 처리로 73% 까지 발근이 되었고 순화 후 토양에서 정상 생장되었다. Feeney 등(2007)은 양벚나무 3가지 품종을 재료로 4 종류의 절편에서 캘러스 유도 후 줄기를 재생하였다. 품종과 절편에 따라 캘러스 유도빈도가 다르게 나타났으며, MS 배지에 3 BA와 1 phloroglucinol 혼용처리로 캘러스 형성빈도를 3배 이상 증가시킬 수 있었다. 캘러스는 BArk 처리된 배지에서 1년 반이상 장기간 유지되었고 WPM 배지에서 BA 처리로 100% 줄기유도가 가능하였다. Sarropoulou 등(2013)은 양벚나무 교잡종 기내식물의 발근에 미치는 IBA 및 L-arginine의 효과를 조사하였다. 최근 Cheong(2012)은 벚나무 속 수종의 개량 및 보존에 대한 생물공학적 연구의 리뷰를 통해 기내번식, 체세포배형성, 형질전환 등의 연구를 종합적으로 리뷰하였다.

이상의 선행연구에서 제시된 것처럼 양벚나무(Prunus avium)sms 원예학적인 이용의 중요성으로 인해 다양한 생물공학적 연구가 진행되어 왔다고 볼 수 있다. 그러나 목재이용을 목적으로한 통직성과 생장성에 기초한 선발 클론을 대상으로 양벚나무의 클론증식에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 이에 본 발명에서는 독일 연방 서부산림연구소에서 선발된 양벚나무 10 클론(Apollo, Concordia, Europa, Fama, Hektor, Hermes, Neptun, Odyssous, Pegasus, Tiberis)을 도입하여 효율적인 번식기술 개발을 통해 묘목 대량생산 및 국내 적응성 시험을 실시코자 시도되었다.

[참고문헌]

김찬수, 고정군, 조리명. 1993. 왕벚나무(Prunus yedoensis M.)의 영양아를 이용한 식물체 대량증식에 미치는 배지, 식물생장조절물질 및 암처리의 효과. 식물조직배양학회지 20(4): 213-219

고정군 외 5인. 1997. 한라산 자생 왕벚나무 접합자배 유래의 캘러스로부터 체세포배 형성과 식물체 재분화. 식물조직배양학회지 24(6): 345-349

정은주, 김찬수, 이재선. 2000. 제주 자생 왕벚나무 (Prunus yedoensis M.) 동아의 채취시기와 배지의 조건에 따른 기관유도. 한국임학회지 89(4): 522-526

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김장수, 김진수. 2007. 왕벚나무 성숙목의 녹지삽목에서 Auxin 및 Fog 처리효과. 한국임학회지 96(6): 676-683

Bhagwat B. nd WD Lane. 2004. In vitro shoot regeneration from leaves of sweet cherry (Prunus avium) ‘Lapins’ and ‘Sweetheart’. Plant Cell Tiss Org Cult 78: 173-181.

Cheong EJ. 2012. Biotechnological approaches for improvement and conservation of Prunus species. Plant Biotechnology Rep. 6: 17-28

Durkovic J. 2006. Rapid micropropagation of mature wild cherry. Biologia Plantarum 50(4): 733-736

Feeney M. et al. 2007. Shoot regeneration from organogenic callus of sweet cherry (Prunus avium L.). Plant Cell Tiss Org Cult 90: 201-214

Hammatt N and NJ Grant. 1998. Shoot regeneration from leaves of Prunus serotina EhrH. (black cherry) and P. avium L. (wild cherry). Plant Cell Rep 17: 526-530

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Matt A., JA Jehle. 2005. In vitro regeneration from leaves and internode sections of sweet cherry cultivars (Prunus avium L.). Plant Cell Rep 24: 468-476

Righetti B et al. 1996. Growth and tissue senescence in Prunus avium shoots grown in vitro at different CO₂/O₂ ratios. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 32: 290-294

Reidiboym-Talleux L. et al. 1999. Improvement of somatic embryogenesis in wild cherry (Prunus avium). Effect of maltose and ABA supplements. Plant Cell Tiss Org Cult 55: 199-209

Sarropoulou V. et al. 2013. Effects of exogenous L-arginine on in vitro rooting, chlorophyll, carbohydrate, and proline concentrations in the sweet cherry rootstock M x M 14 (Prunus avium L. x Prunus mahaleb L.). Plant Biotechnology Rep. Published online 26 May 2013.

국내에서 벚나무류의 왕벚나무의 조직배양 기술 등 부분적으로 이루어져 왔다. 양벚나무(Prunus avium)는 병해충의 문제로 인해 식물검역원에서 수입금지 품목으로 지정되어 있으며 아직까지 국내에서의 증식기술은 시도되지 못했다. 국립산림과학원에서는 2011년 6월 독일 서부산림연구소의 마이어 딩켈박사(A. Meier-Dinkel)로부터 생장과 통직성이 우수한 양벚나무 10클론(Apollo, Concordia, Europa, Fama, Hektor, Hermes, Neptun, Odyssous, Pegasus, Tiberis)을 도입하였으며, 도입 시기부터 국립식물검역원의 엄격한 통제하에 실험실 및 온실에서 병해충의 모니터링을 받아왔다. 2013년 5월 식물검역원으로부터 검역상의 문제가 없으며, 야외 식재가 가능하다는 통보를 받았으며, 그간 기내배양을 통한 증식기술을 확립하기에 이르렀다. 본 발명은 독일 서부산림연구소에서 도입한 양벚나무 선발개체 10클론의 효율적인 기내번식 및 온실순화 기술을 개발하여 차후 실용화를 위한 방안을 제시하고자 하였다.

본 발명은 독일 서부산림연구소에서 도입한 양벚나무 10클론의 효율적인 기내중식, 발근 및 토양이식 순화 기술을 개발하는데 있으며, 적정배지 및 생장조절제 선택, 적정한 순화용 상토의 선정을 목적으로 도입한 양벚나무 10클론의 효율적인 미세번식(micropropagation) 기술을 제공하고자 하였다.

본 발명에 의한 번식방법은 국내에서는 개발된 바 없는 독일산 양벚나무 클론의 효율적인 미세번식 기술 개발을 제시하는데 있으며, 국내에 자생하는 유사한 벚나무류의 증식은 물론 유용 활엽수종의 기내번식 기초자료로 활용이 가능하다.

도 1은 조직배양실에서 기내 증식중인 양벚나무의 줄기생장 모습이다.
도 2는 기내 발근된 줄기의 뿌리 상태를 보여준다.
도 3은 발근된 개체를 인공상토에 이식하여 1주된 묘목의 생장이다.
도 4는 인공상토에 이식하여 2주된 묘목의 생장 상태이다.
도 5는 토양에서 순화된 묘목을 온실에서 폿트묘오 키우는 모습이다.
도 6은 폿트로 이식 후 2개월된 묘목의 생장을 보여준다.
도 7은 포지에 이식하여 1년된 묘목의 생장을 보여준다.

본 발명은 독일에서 도입한 양벚나무(Prunus avium) 클론을 재료로 기내배양을 통하여 줄기를 증식하는 단계; 증식된 줄기를 기내발근 시키는 단계; 발근묘를 인공상토에 이식하여 순화시키는 단계; 순화묘를 폿트에 이식하여 성장시키는 단계; 30cm 내외로 자란 묘목을 포지에 이식하여 생장시키는 양벚나무의 미세번식(micropropagation)에 관한 것이다.

본 발명에서, 양벚나무 클론은 독일 서부산림연구소의 마이어 딩켈박사(A. Meier-Dinkel)로부터 도입한 10클론(Apollo, Concordia, Europa, Fama, Hektor, Hermes, Neptun, Odyssous, Pegasus, Tiberis)이었으며, 기내증식을 위해 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지에 싸이토키닌으로 BA, 오옥신으로 IBA를 혼용 처리하였다. 기내발근 유도는 염류를 줄인 1/2MS 혹은 1/3MS 배지에 오옥신으로 1.0mg/L IBA를 처리하였다. 발근묘의 토양이식은 원예용 상토를 단독 혹은 혼합하여 사용하였고, 이식 후 공중습도를 90% 이상 높게 유지하며 순화하였다. 순화된 어린 묘목은 동일한 상토가 담긴 큰 폿트(19x21cm)로 옮겨 생장을 도모하였다. 약 30cm 내외로 자란 묘목을 포지로 옮겨 야외 생장 및 적응 시험을 실시하였다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 미세번식(micropropagation)의 방법으로 양벚나무를 증식시켜 묘목을 생산하는 최적의 조건은 다음과 같다. 이하의 발명에서 배양용기는 유리병(7.3x13.3cm)에 60ml의 배지를 분주하여 사용하였고, 배지는 pH 5.7로 조정 후 고압멸균기에서 121℃, 15기압 하에서 30분간 살균 후 고형화 시켜 사용하였다. 절편(explant)은 배양병 당 5개를 치상하였다. 배양환경은 온도 26±2℃, 1일 16시간 조명, 조도는 냉백색 형광등 하에서 60μM m^-2s^-1 로 1일 16시간 조명, 8시간 암배양 조건으로 배양하면서 약 3~4주의 계대배양 주기로 배양하였다.

① 정아 혹은 액아로부터의 줄기증식은 MS 배지에 0.5mg/L BA, 0.1mg/L IBA를 처리하고, 탄소원으로는 3%의 수크로즈(sucrose), 경화제로는 0.6% 아가(agar)를 사용한다.

② 기내 발근배지는 염류를 줄인 1/2MS 혹은 1/3MS 배지에 IBA 1.0mg/L, sucrose 2%, agar 0.6%를 사용한다.

발근묘의 토양이식용 상토는 시판되는 인공 혼합상토로 피트모쓰(peatmoss), 펄라이트(perlite), 버미큘라이트(vermiculrite)를 1:1:1 등량 용적비로 혼합하여 사용하거나 원예용 상토 TKS2를 사용한다. 4주 후 순화된 묘목은 동일한 상토가 담긴 플라스틱 폿트(pot, 크기 19x21cm)로 옮겨 생장시킨다.

④ 묘고가 30cm 내외로 자라면 봄철에 포지에 이식하여 야외생장 및 적응을 실시한다.

실시예 1 (줄기증식)

MS 기본배지(Murashige and Skoog, 1962)에 싸이토키닌으로 BA(6-benzilamino purine) 0.5mg/L, 오옥신으로 IBA 0.1mg/L 처리, 탄소원으로 3% sucrose, 경화제로 0.6% agar를 사용하여 유리병(폭 7.2cm, 높이 13cm)에 약 60ml의 배지를 분주하여 배양병 당 4~5개의 절편을 넣어 배양한다. 표 1은 20주간 증식시험된 실시 예를 보여준다.

클론에 따른 앙벚나무 증식 결과
Clones	치상점수	4주	8주	12주	16주	20주
Apollo	2	12	87	240	378	546
Concordia	2	12	75	258	414	516
Europa	2	8	54	104	140	224
Fama	2	6	39	112	240	385
Hektor	2	7	34	65	92	175
Hermes	2	7	32	115	230	441
Neptune	2	5	24	60	165	385
Odyssous	2	6	35	85	100	132
Pegasus	2	10	77	229	342	406
Tiberis	2	9	60	218	300	420
총 줄기점수	20	82	517	1486	2401	3,630

배지 : MS + 0.5mg/L BA, 0.1mg/L IBA, 3% sucrose, 0.6% agar

실시예 2 (기내발근)

증식중인 줄기 중에서 길이가 3cm 이상 자라고 잎이 정상적인 것을 취하여 기내발근을 유도하였다. 발근배지는 1/2MS 혹은 1/3MS 배지에 IBA 1.0mg/L, sucrose 2%, agar 0.6%를 사용하였다. 발근유도는 줄기 마디는 1~2개, 잎은 2~3개가 부착되도록 하고 배지에 수직으로 치상하였다. 표 2는 6주간의 발근 시험된 실시 예를 보여준다.

기내증식된 줄기의 클론에 따른 발근유도
Clones	치상수	1주	2주	3주	4주	5주	6주	총발근개체수	발근율 (%)
Apollo	24	0	0	0	3	2	2	7	29.2
Concordia	24	2	3	4	3	8	1	21	87.5
Europa	24	4	5	1	2	5	2	19	79.2
Fama	24	0	1	1	2	1	0	5	20.8
Hektor	24	5	3	2	1	1	7	19	79.2
Hermes	24	0	0	1	3	9	4	17	70.8
Neptune	24	2	3	3	1	3	2	14	58.3
Odyssous	24	0	1	3	3	8	4	19	79.2
Pegasus	24	0	0	1	1	11	6	19	79.2
Tiberis	24	2	1	4	5	6	4	22	91.7
Total	240	15	17	20	24	54	32	162	67.5

배지 1/2MS 혹은 1/2MS + 1.0mg/L IBA, 2% sucrose, 0.6% agar

실시예 3 (토양이식 순화)

기내 발근된 개체는 유리병에서 뿌리가 부러지지 않도록 조심스럽게 꺼내어 흐르는 물에 아가(agar)를 제거시킨 다음 준비된 상토에 이식한다. 이식후 충분히 관수하고 공중습도를 90% 이상 높게 유지하였다. 인공 혼합상토로 피트모쓰(peatmoss), 펄라이트(perlite), 버미큘라이트(vermiculrite)를 1:1:1 등량 용적비로 혼합하여 사용하거나 원예용 상토 TKS2를 사용하였다.

실시예 4 (폿트묘 육성)

실시 예 3에서 4주 후 순화된 묘목은 동일한 상토가 담긴 플라스틱 폿트(pot, 크기 19x21cm)로 옮겨 생장시킨다. 표 3은 폿트묘로 육성된 클론묘의 이식생존율 실시 예를 보여준다.

순화묘의 클론묘의 pot 이식 생존율
Clones	이식본수	2주 후	6주 후
Apollo	162	139 (86%)	71 (44%)
Concordia	32	18 (56%)	17 (53%)
Europa	67	60 (90%)	51 (76%)
Fama	0	0 (%)	0 (0%)
Hektor	9	8 (89%)	8 (89%)
Hermes	10	8 (80%)	5 (50%)
Neptune	43	42 (98%)	42 (98%)
Odyssous	130	104 (80%)	97 (75%)
Pegasus	15	11 (73%)	11 (73%)
Tiberis	16	14 (88%)	10 (63%)

상토 : 피트모스, 펄라이트, 버미큘라이트(1:1:1 v/v/v)

실시예 5 (포지이식 생장)

실시예 4에서 묘고가 30cm 내외로 자라면 야외 포지에 이식시킬 단계가 된다. 봄철(4월 중하순)에 포지에 이식하여 야외생장 및 적응을 도모한다. 표 4 및 표 5는 포지에 이식하여 1년 차 생존율 및 묘고생장의 실시 예를 보여준다.

양벚나무 클론묘의 포지이식 1년차 생존율

클론명	식재본수	생존본수	생존율%
Hermes	149	143	96
Apollo	105	102	97
Neptune	54	53	98
Tiberis	31	26	84
Concordia	26	24	92
Europa	20	19	95
Odyssous	16	16	100
Pegasus	17	12	71
Hektor	14	14	100
Fama	2	1	50
산벚나무	42	41	98

양벚나무 클론묘의 포지이식 1년차 묘고생장

클론명	평균묘고cm	표준편차
Hermes	110.1	29.7
Apollo	102.4	19.9
Neptune	119.5	32.3
Tiberis	102.9	28.8
Concordia	94.4	26.5
Europa	89.3	22.4
Odyssous	60.9	27.8
Pegasus	87.7	22.4
Hektor	101.2	11.5
Fama	33.5	0.0
비교구	111.5	25.9

본 발명에 사용한 양벚나무 클론은 생장과 통직성을 기초로 선발한 우수한 클론묘이기 때문에 식재 시 다른 양벚나무와 비교하여 우수한 생장 및 생산성을 기대할 수 있으며, 국내의 벚나무류 선발개체의 클론 개발을 위한 유용한 증식기술로 적용 가능한 방법이 된다.

Claims

(a). 양벚나무의 미세번식(micropropagation)으로서 독일 서부산림연구소에서 도입한 10클론(Apollo, Concordia, Europa, Fama, Hektor, Hermes, Neptun, Odyssous, Pegasus, Tiberis)을 재료로 기내증식 시키는 방법 및 ;
(b). 상기 클론의 기내발근묘를 이용하여 토양이식 순화를 통해 묘목을 육성하는 양벚나무의 무성번식 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 정단 정아 및 액아지를 절편으로 MS (Murashige and Skoog, 1962)배지에 0.5mg/L BA, 0.1mg/L IBA, 3% sucrose, 0.6% agar를 각각 처리하여 줄기를 증식시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 기내발근 유도는 정아가 있는 절편으로 1/2MS 혹은 1/3MS 배지에 IBA 1.0mg/L, sucrose 2%, agar 0.6% 처리하여 발근시키는 방법.
제1항에 있어서, 발근된 개체를 인공 혼합상토(피트모스, 펄라이트, 버미큘라이트 1:1:1, vlvlv) 혹은 원예용 상토 TKS2에 이식시키고 온도 25±2℃, 습도 90% 이상 유지되는 순화실에서 순화시키는 방법.
제4항에 있어서, 3~4주 경과 후 순화된 묘목을 동일한 상토가 담긴 플라스틱 폿트로 옮겨 생장시키는 방법.
제5항에 있어서, 묘고 30cm 내외로 자란 묘목을 봄철(4월 중하순)에 포지에 이식하여 야외생장 및 적응을 도모하는 것을 특징으로 하는 양벚나무의 양벚나무의 미세번식(micropropagation) 방법.