CN105325299A - 一种大樱桃砧木吉塞拉组培方法及培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大樱桃砧木吉塞拉组培方法及培养基，该培养方法包括外植体的采取、丛生芽的诱导、分化苗的增殖培养、分化苗的生根培养以及组培苗的大田移栽。该培养基包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，本发明方法提高了大樱桃砧木吉塞拉6号的繁殖系数，降低了外植体的污染率、提高了愈伤组织分化率和移栽成活率等。本发明所述诱导培养基、增殖培养基和生根培养基配制方法能缩短培养组培苗周期，不产生变异，苗子整齐度高；快速增殖，提高繁殖系数；生根率高，根和苗之间几乎没有愈伤，均是正常根，三种培养基配合能大大提高驯化成活率，降低组培苗的成本。
Description
技术领域
本发明属于果树培育农业生物技术领域，尤其涉及一种大樱桃砧木吉
塞拉组培方法及培养基。
背景技术
大樱桃是我国北方落叶果树中继中国樱桃之后果实成熟最早的果树树种。中医药学认为，大樱桃具有调中补气，祛风湿的功能。樱桃被誉为“水果中的钻石”，含铁量较高，含有丰富的蛋白质，维生素A、B、C，还有钾、钙、磷、铁等矿物质以及多种维生素。对大樱桃来说砧木的选择直接影响果实的质量和产量，吉塞拉6号砧木和大樱桃亲和力强，对土壤适应性广，抗根癌病，耐多种病毒病和细菌性溃疡病，结果早，丰产性好。因此大樱桃砧木吉塞拉6号的需求急剧增加。目前，吉塞拉6号砧木的繁殖方式以组织培养快繁为主，其它组培室因培养条件培养方法和培养基配方的不合理，造成繁殖系数低、移栽成活率低下、成本高的缺点，导致吉塞拉6号砧木无论从数量、质量和价格上都不能满足市场需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大樱桃砧木吉塞拉组培方法，旨在解决大樱桃砧木吉塞拉外植体选择、外植体采集时间、外植体消毒方法、接种、培养室培养、炼苗方面的技术难点问题；同时提供一种大樱桃砧木吉塞拉培养基，旨在解决大樱桃砧木吉塞拉传统技术的外植体污染率高、分化率低、增殖系数低、移栽成活率低、成本高等问题，
本发明是这样实现的，一种大樱桃砧木吉塞拉培养基，大樱桃砧木吉塞拉培养基设置为大樱桃砧木吉塞拉6号培养基，该大樱桃砧木吉塞拉培养基包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；
所述诱导培养基包括：1L培养基中含有MS基础培养基各工作液原料、6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L；
所述增殖培养基包括：1L培养基中含有MS基础培养基各工作液原料、6-苄氨基嘌呤0.5mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L；
所述生根培养基包括：1L培养基中含有1/2MS基础培养基各工作液原料、吲哚丁酸0.6mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L。
进一步，所述MS培养基的工作液包括：大量元素、微量元素、肌醇、有机溶液和铁盐；
所述大量元素包括硝酸铵NH2NO3、硝酸钾KNO3、氯化钙CaCl2·2H2O、硫酸镁MgSO4·7H2O和磷酸二氢钾KH2PO4；
所述微量元素包括碘化钾KI、硼酸H3BO3、硫酸锰MnSO4·4H2O、硫酸锌ZnSO4·7H2O、钼酸钠Na2MoO4·2H2O、硫酸铜CuSO4·5H2O和氯化钴CoCl2·6H2O；
所述有机溶液包括烟酸、盐酸吡哆醇和甘氨酸；
所述铁盐包括FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O。
进一步，所述MS培养基的工作液浓度为：硝酸铵NH2NO31650mg/L、硝酸钾KNO31900mg/L、氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L、硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L、磷酸二氢钾KH2PO4170mg/L；
碘化钾KI0.83mg/L、硼酸H3BO36.2mg/L、硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L、钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、硫酸铜CuSO4·5H2O0.0025mg/L和氯化钴CoCl2·6H2O0.0025mg/L；
肌醇：100mg/L；
烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L；
FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L。
进一步，所述诱导培养基pH值5.8-6.0,增殖培养基pH值5.8-6.0,生根培养基pH值5.8-6.0。
本发明另一目的在于提供一种利用大樱桃砧木吉塞拉培养基的大樱桃砧木吉塞拉组培方法，该大樱桃砧木吉塞拉设置为大樱桃砧木吉塞拉6号，该大樱桃砧木吉塞拉组培方法包括：
步骤一，在植物早春发芽时，采集健壮的无病虫害大樱桃砧木吉塞拉6号的嫩叶、生长点、腋芽，作为组织培养的外植体，将采集到的外植体用洗衣粉水清洗干净，再放在流水下冲洗30min，在超净工作台上于培养皿中用75%酒精消毒10-60s，再用无菌水冲洗3-5遍，之后用质量百分比为0.1%的升汞消毒3-8min，无菌水冲洗3-5遍；
步骤二，将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，送入培养室进行无菌培养，培养基为MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂10000-15000mg/L；经诱导分化后，得到丛生芽，将丛生芽转移到增殖培养基中进行增殖培养，得到组培苗，增殖培养基为MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂10000-15000mg/L；
步骤三，将分花苗接种在生根培养基中进行生根培养，生根培养基为1/2MS+IBA0.6mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂10000-15000mg/L，暗培养10-12d，再光照培养3周，得到扎根的组培苗；
步骤四，将扎根后的组培苗炼苗3d，移栽到蛭石为基质的栽培盘中在温室内锻炼，当组培苗移栽成活后40-60d，移栽到大田中。
本发明提供的一种大樱桃砧木吉塞拉组培方法及培养基相对于现有技术具有的优点和进步在于：
本发明方法提高了大樱桃砧木吉塞拉6号的繁殖系数，弥补了传统组织培养技术的一些不足，如降低了外植体的污染率、提高了诱导丛生芽及继代增殖的繁殖系数，移栽成活率也大大提高。外植体采集、消毒效果、超净工作台转接效果、无菌培养室培养效果、生根诱导效果、生根苗移栽效果、幼苗扩大繁殖速度等均优于以往大樱桃砧木吉塞拉6号的组培快繁技术，所建立的规模化、工厂化育苗体系稳定，生产周期短，加快大樱桃砧木吉塞拉6号的繁殖速度，打破繁殖的季节、种性的限制。本发明的组培配方是大樱桃砧木吉塞拉6号大量扩大繁殖的最佳组合配方，可以快速大量繁殖砧木幼苗，满足市场需求。
附图说明
图1是本发明实施例提供的大樱桃砧木吉塞拉组培方法流程图。
图2是本发明实施例提供的大樱桃砧木吉塞拉培养基分类示意图。
图中：1、大樱桃砧木吉塞拉培养基；2、诱导培养基；3、增殖培养基；4、生根培养基。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述：
如图1所示一种大樱桃砧木吉塞拉组培方法，该大樱桃砧木吉塞拉设置为大樱桃砧木吉塞拉6号，大樱桃砧木吉塞拉组培方法包括：
S101，在植物早春发芽时，采集健壮的无病虫害大樱桃砧木吉塞拉6号的嫩叶、生长点、腋芽，作为组织培养的外植体，将采集到的外植体用洗衣粉水清洗干净，再放在流水下冲洗30min，在超净工作台上于培养皿中用75%酒精消毒10-60s，再用无菌水冲洗3-5遍，之后用质量百分比为0.1%的升汞消毒3-8min，无菌水冲洗3-5遍；
S102，将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，送入培养室进行无菌培养，培养基为MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂10000-15000mg/L；经诱导分化后，得到丛生芽，将丛生芽转移到增殖培养基中进行增殖培养，得到组培苗，增殖培养基为MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂10000-15000mg/L；
S103，将分花苗接种在生根培养基中进行生根培养，生根培养基为1/2MS+IBA0.6mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂10000-15000mg/L，暗培养10-12d，再光照培养3周，得到扎根的组培苗；
S104，将扎根后的组培苗炼苗3d，移栽到蛭石为基质的栽培盘中在温室内锻炼，当组培苗移栽成活后40-60d，移栽到大田中。
如图2：一种大樱桃砧木吉塞拉培养基，大樱桃砧木吉塞拉培养基设置为大樱桃砧木吉塞拉6号培养基，该大樱桃砧木吉塞拉培养基包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；
所述诱导培养基包括：1L培养基中含有MS基础培养基各工作液原料、6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L；
所述增殖培养基包括：1L培养基中含有MS基础培养基各工作液原料、6-苄氨基嘌呤0.5mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L；
所述生根培养基包括：1L培养基中含有1/2MS基础培养基各工作液原料、吲哚丁酸0.6mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L。
所述MS培养基的工作液包括：大量元素、微量元素、肌醇、有机溶液和铁盐；
所述大量元素包括硝酸铵NH2NO3、硝酸钾KNO3、氯化钙CaCl2·2H2O、硫酸镁MgSO4·7H2O和磷酸二氢钾KH2PO4；
所述微量元素包括碘化钾KI、硼酸H3BO3、硫酸锰MnSO4·4H2O、硫酸锌ZnSO4·7H2O、钼酸钠Na2MoO4·2H2O、硫酸铜CuSO4·5H2O和氯化钴CoCl2·6H2O；
所述有机溶液包括烟酸、盐酸吡哆醇和甘氨酸；
所述铁盐包括FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O。
所述MS培养基的工作液浓度为：硝酸铵NH2NO31650mg/L、硝酸钾KNO31900mg/L、氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L、硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L、磷酸二氢钾KH2PO4170mg/L；
碘化钾KI0.83mg/L、硼酸H3BO36.2mg/L、硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L、钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、硫酸铜CuSO4·5H2O0.0025mg/L和氯化钴CoCl2·6H2O0.0025mg/L；
肌醇：100mg/L；
烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L；
FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L。
所述诱导培养基pH值5.8-6.0,增殖培养基pH值5.8-6.0,生根培养基pH值5.8-6.0。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述：
实施例1MS培养基的配制：
工作液浓度含（单位mg/L）：
大量元素：硝酸铵NH2NO31650、硝酸钾KNO31900、氯化钙CaCl2·2H2O440、硫酸镁MgSO4·7H2O370、磷酸二氢钾KH2PO4170
微量元素：碘化钾KI0.83、硼酸H3BO36.2、硫酸锰MnSO4.4H2O22.3、硫酸锌ZnSO4.7H2O8.6、钼酸钠Na2MoO4.2H2O0.25、硫酸铜CuSO4.5H2O0.0025、氯化钴CoCl2.6H2O0.0025
肌醇：100
有机溶液：烟酸0.5、盐酸吡哆醇0.5、盐酸硫胺素0.5、甘氨酸2.0
铁盐：FeSO4·7H2O27.8、Na2-EDTA·2H2O37.3。
将大量元素放大至10倍浓度配制成母液1L备用，微量元素、肌醇溶液、有机溶液、铁盐溶液分别放大至100倍浓度配制成母液1L备用。
大量元素母液配制：称取上述大量元素原料含量的10倍药品，各自溶解，然后混合均匀，容量瓶定容1L。
微量元素母液配制：称取上述微量元素原料含量的100倍药品，各自溶解，然后混合均匀，容量瓶定容1L。
肌醇母液配制：称取上述肌醇溶液原料含量的100倍药品，溶解，然后混合均匀，容量瓶定容1L。
有机母液配制：称取上述有机溶液原料含量的100倍药品，各自溶解，然后混合均匀，容量瓶定容1L。
铁盐母液配制：称取上述铁盐溶液原料含量的100倍药品，各自溶解，然后混合均匀，容量瓶定容1L。
量取上述大量元素母液100ml的量，其它各母液各10ml的量，混合均匀，稀释，容量瓶定容至1L即得MS。
实施例2大樱桃砧木吉塞拉6号组培用诱导培养基
将实施例1制备的各母液量取大量元素母液100ml的量，其它各母液各10ml的量，加入6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L；PH值5.8-6.0。将上述原料混合均匀，稀释至1L，煮沸，使得琼脂粉溶解即得。
实施例3大樱桃砧木吉塞拉6号组培用增殖培养基
将实施例1制备的各母液量取大量元素母液100ml的量，其它各母液各10ml的量，加入6-苄氨基嘌呤0.5mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L；PH值5.8-6.0。将上述原料混合均匀，稀释至1L，煮沸，使得琼脂粉溶解即得。
实施例4大樱桃砧木吉塞拉6号组培用生根培养基
将实施例1制备的各母液量取大量元素母液50ml的量，其它各母液各5ml的量，加入吲哚丁酸0.6mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L；PH值5.8-6.0。将上述原料混合均匀，稀释至1L，煮沸，使得琼脂粉溶解即得。
实施例5
1）、选择植物早春发芽时连续3天无雨后，采集健壮的无病虫害大樱桃砧木吉塞拉6号的嫩叶、生长点、腋芽，作为组织培养的外植体，将采集到的外植体用洗衣粉水清洗干净，再放在流水下冲洗30min，在超净工作台上于培养皿中用75%酒精消毒10-60s，再用无菌水冲洗3-5遍，之后用0.1%（质量百分比）升汞消毒3-8min，无菌水冲洗3-5遍；
2）、将消毒后的外植体接种到诱导培养基（实施例2）上，送入培养室进行无菌培养，培养室的条件为温度：25±1℃，光照强度：1500Lx-2000Lx，光照时间：12hr/d。在此过程中观察外植体分化和诱导情况，筛选出最佳的外植体种类和培养基配方，将分化丛生芽多的外植体块转接到增殖培养基（实施例3）上，经过30d培养即可增殖3-5倍，得到分花苗；
3）、将生长健壮、旺盛的分花苗转接在生根培养基（实施例4）上诱导生根，诱导生根先暗培养10-12d，然后光培养3周，得到生根幼苗，即可以准备移栽了；
4）、将生根幼苗先进行炼苗，然后移栽。把生根后的组培苗移出培养瓶，借助毛刷洗净根部的培养基，放在盛满水的小盒中，借助橡皮筋固定小苗，水面高度以不超过根部为宜，置于炼苗室炼苗3-5d，上覆透明塑料薄膜，然后移栽到以蛭石为基质的育苗盘中，移栽成活率达到95%左右。
移栽过程中注意几点：移栽前覆盖拱棚、透明塑料薄膜，拱棚内用百菌清消毒，育苗盘也要消毒；借助镊子将小苗根部上的土捏实，让根和基质充分接触；育苗盘移栽上组培苗后放在拱棚中，喷水，使得拱棚内湿度100%，一个星期后慢慢通风，炼苗，然后去掉透明塑料薄膜。去掉透明塑料薄膜后喷稀释500倍MS营养液（不含蔗糖和琼脂的），以后每周喷施一次。以上几点均可提高移栽苗的成活率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种大樱桃砧木吉塞拉培养基，其特征在于，该大樱桃砧木吉塞拉培养基采用大樱桃砧木吉塞拉6号培养基；包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；
所述诱导培养基包括：1L培养基中含有MS基础培养基各工作液原料、6-苄氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L；
所述增殖培养基包括：1L培养基中含有MS基础培养基各工作液原料、6-苄氨基嘌呤0.5mg/L、吲哚丁酸0.1mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L；
所述生根培养基包括：1L培养基中含有1/2MS基础培养基各工作液原料、吲哚丁酸0.6mg/L、蔗糖30000mg/L、琼脂10000-15000mg/L。
2.如权利要求1所述的大樱桃砧木吉塞拉培养基，其特征在于，所述MS培养基的工作液包括：大量元素、微量元素、肌醇、有机溶液和铁盐；
所述大量元素包括硝酸铵NH2NO3、硝酸钾KNO3、氯化钙CaCl2·2H2O、硫酸镁MgSO4·7H2O和磷酸二氢钾KH2PO4；
所述微量元素包括碘化钾KI、硼酸H3BO3、硫酸锰MnSO4·4H2O、硫酸锌ZnSO4·7H2O、钼酸钠Na2MoO4·2H2O、硫酸铜CuSO4·5H2O和氯化钴CoCl2·6H2O；
所述有机溶液包括烟酸、盐酸吡哆醇和甘氨酸；
所述铁盐包括FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O。
3.如权利要求1所述的大樱桃砧木吉塞拉培养基，其特征在于，所述MS培养基的工作液浓度为：硝酸铵NH2NO31650mg/L、硝酸钾KNO31900mg/L、氯化钙CaCl2·2H2O440mg/L、硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L、磷酸二氢钾KH2PO4170mg/L；
碘化钾KI0.83mg/L、硼酸H3BO36.2mg/L、硫酸锰MnSO4·4H2O22.3mg/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O8.6mg/L、钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、硫酸铜CuSO4·5H2O0.0025mg/L和氯化钴CoCl2·6H2O0.0025mg/L；
肌醇：100mg/L；
烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L；
FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L。
4.如权利要求1所述的大樱桃砧木吉塞拉培养基，其特征在于，所述诱导培养基pH值5.8-6.0，增殖培养基pH值5.8-6.0，生根培养基pH值5.8-6.0。
5.一种利用权利要求1所述的大樱桃砧木吉塞拉培养基的组培方法，其特征在于，该组培方法包括：
步骤一，在植物早春发芽时，采集健壮的无病虫害大樱桃砧木吉塞拉6号的嫩叶、生长点、腋芽，作为组织培养的外植体，将采集到的外植体用洗衣粉水清洗干净，再放在流水下冲洗30min，在超净工作台上于培养皿中用75%酒精消毒10-60s，再用无菌水冲洗3-5遍，之后用质量百分比为0.1%的升汞消毒3-8min，无菌水冲洗3-5遍；
步骤二，将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，送入培养室进行无菌培养，培养基为MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂10000-15000mg/L；经诱导分化后，得到丛生芽，将丛生芽转移到增殖培养基中进行增殖培养，得到组培苗，增殖培养基为MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂10000-15000mg/L；
步骤三，将分花苗接种在生根培养基中进行生根培养，生根培养基为1/2MS+IBA0.6mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂10000-15000mg/L，暗培养10-12d，再光照培养3周，得到扎根的组培苗；
步骤四，将扎根后的组培苗炼苗3d，移栽到蛭石为基质的栽培盘中在温室内锻炼，当组培苗移栽成活后40-60d，移栽到大田中。
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