CN102283120B - 一种霍山石斛种苗繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种霍山石斛种苗的繁殖方法，本方法包括外植体的获取、无菌播种、原球茎诱导、人工授粉、壮苗培养及试管苗移栽各步骤。选取生长健壮的开花的霍山石斛株作为母株，通过人工授粉获得果实，再从成熟的果实中取出种子，用种子萌发培养基培养，使种子萌发成原球茎并进一步形成小苗，再将小苗用试管开花培养基培养，开花后在无菌条件下进行人工授粉，从成熟的果实中取出种子进行无菌播种，使种子长成小植株，形成可出瓶种植的种苗，进一步将种苗出瓶移栽，即可。本发明操作简单，成本低廉，缩短霍山石斛果实的成熟期，高效、无病虫害，能终年生产霍山石斛种子，成苗的移栽成活率可达96%以上，为霍山石斛种苗的繁殖开辟了一条新的途径。

Description

一种霍山石斛种苗繁殖方法

技术领域

   本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及通过试管开花、人工授粉结果来达到霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng)种苗高效繁殖的方法。 

背景技术

霍山石斛(Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng)是我国濒临灭绝的珍稀物种，被誉为“中华仙草”之首，是霍山县独有的、拥有原产地地理标志的名贵中药材，具有极高的药用保健价值，具有生津益明、清热养阴、消炎止痛、清音明目功能及抗癌、抗衰老、抗辐射和增强免疫力等功效，尤其石斛多糖具有极高的保健和医疗作用。但由于其生境狭窄，繁殖困难，植株数量极少，因此人工种植霍山石斛具有广阔的前景，但缺乏优质种苗是霍山石斛种植业的瓶颈之一。虽然国内早有关于霍山石斛种苗生产的专利和文献报道，但是却没有见到利用试管开花授粉结果的方法来繁殖霍山石斛的。

发明内容

本发明的目的在于提出一种能高效率地繁殖霍山石斛种苗的方法。选取生长健壮的霍山石斛开花株，通过人工授粉得到果实，然后将果实中的种子播种在种子萌发培养基上进行培养，在种子萌发成原球茎并进一步分化成小苗后，再将小苗用试管开花培养基培养，待所培养的植株开花后在无菌条件下进行人工授粉，在人工培养基上培养的果实成熟后，再进行无菌播种，待种子萌发后长成小植株，最后将小植株在壮苗培养基上培养成可出瓶种植的种苗，种苗出瓶成活率可达96%以上，从而实现了本发明的目的。

     本发明采用的技术方案如下：

一种霍山石斛种苗繁殖方法，其特征在于，包括以下的工艺步骤：

(1) 外植体获取：在人工种植的霍山石斛开花时，选取生长健壮的母株进行人工授粉，并将人工授粉而来的成熟果实作为外植体；

(2) 原球茎诱导：将外植体依次用酒精浸泡28-32 秒，质量分数0.2%的升汞溶液消毒25-35 分钟，无菌水漂洗4-5次后切开，将胚接种到种子萌发培养基KnP1上萌发成原球茎， 并进一步分化成小苗；

(3) 人工授粉：将步骤（2）分化出的小苗转移到试管开花培养基KnP2上培养，待开花后，选取生长健壮的开花株在无菌条件下进行人工授粉； 

(4)无菌播种：果实成熟后切开进行无菌播种，种子萌发形成原球茎，并进一步形成完整的小植株；

(5)壮苗培养:将小植株转移到玻璃瓶壮苗培养基KnP3上培养，形成成苗； 

(6) 试管苗出瓶移栽：将栽有成苗的玻璃瓶转移到自然光下炼苗8-12 天，光照度1500～2000lx, 光照9-12小时/天,然后将成苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在用木屑的基质中栽培，保持适当通风和足够的湿度，1000株成活960-970株,移栽的成活率均可达96-97%。

上述步骤中培养基组分及含量配比如下：

种子萌发培养基KnP1：

MgSO4 .7H2O    　　　　　 230-260 mg/L

KH2PO4            　　　　230-260 mg/L

Ca(NO3)2. 4H2O            950-1050 mg/L

(NH4)₂SO4       　　　  　450-550 mg/L

铁盐　FeSO4 . 7H2O 　　　 27.5-30.0 mg/L

Na₂-EDTA   　　　         37.1- 37.5 mg/L

ZnSO4. 7H2O      　　　　 0.330-0.332 mg/L

CuSO4.  5H2O     　　　　 0.035-0.045 mg/L

H3BO3             　　　　0.055-0.057 mg/L

Na_２MoO_４.2H2O           　 0.035-0.039 mg/L

甘氨酸           　　　　 1.8-2.2 mg/L

烟酸             　　　　   0.3-0.5 mg/L

VB1              　　　　   0.8-1.2 mg/L

VB6              　　　　   0.4-0.6 mg/L

香蕉             　　　　   145-155g/L

蔗糖              　　　　  180-220g/L 

琼脂                        5.0-7.0 g/L；

试管开花培养基KnP2:

KnP1培养基

6-BA        1.0 mg/L

NAA         0.1 mg/L；

壮苗培养基KnP3：

MS或B5培养基 

6-BA        0.4-0.6 mg/L

NAA         0.8-1.2 mg/L；

上述步骤中所有的培养基pH 5.1～5.4，培养温度（26±2）℃。

所述的一种霍山石斛种苗繁殖方法，其特征在于：步骤(1)所述的果实成熟期为120～140天，步骤（2）所述的种子萌发温度为25～28℃，步骤(3)所述的小苗的高度为2.5～3.5cm,所述的果实成熟期为60～70天，步骤(3)所述的开花期为55～63天，步骤(5)所述的成苗高3～5cm，每丛有2～3个小苗。

与现有技术相比本发明的方法的优点： 

1、缩短了霍山石斛果实的成熟期，自然状态下，霍山石斛的果实成熟其为120～140天，而本发明方法将霍山石斛的果实的成熟期缩短到为60～70天；

2、本发明方法繁殖霍山石斛具有高效且无病虫害的特点，能终年生产霍山石斛种子；

3、成活率高，成苗的移栽成活率可达96%以上，从而为霍山石斛种苗的繁殖开辟了一条新的途径；

4、本发明方法操作简单，成本低廉。

具体实施方法

    以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

1、外植体获取：开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后120天果实成熟，将果实作为外植体用于播种；

2、原球茎诱导：播种时，将外植体依次用体积分数75%的酒精浸泡30 秒，质量分数0.2%的升汞溶液中消毒30 分钟，无菌水漂洗5次，然后切开果实，将粉末状胚接种到种子萌发培养基KnP1上，10天后种子萌发，形成原球茎，70天后形成小苗；

3.  人工授粉：将2.5～3.5cm高的小苗100株转瓶到试管开花培养基KnP2上，58天时21株开花,开花率可达21％，选取试管内生长健壮的植株进行试管内人工授粉；

4.  无菌播种：人工授粉后70天果实成熟，采下果实，切开果实进行无菌播种，7天左右种子萌发形成原球茎，80天时能形成完整的小植株,每个果实形成完整的小植株的数量在4万株以上；

5. 壮苗培养：将无菌播种获得的密集的小植株分开后转移到壮苗培养基KnP3上培养， 80天形成株高3～4cm，每丛有2～3个苗；

6.  试管苗移栽：将成苗转移到自然光下炼苗10 天，光照度1500～2000lx, 光照11小时/天,然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在用木屑的基质中栽培，保持适当通风和足够的湿度，1000株成活960株,移栽的成活率均可达96%。

在上述实验中所用的培养基均为pH 5.1～5.4，培养温度（26±2）℃。

实施例2:

1. 外植体制备：开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后130天果实成熟，将果实作为外植体用于播种；

2. 原球茎诱导：播种时，将外植体依次用体积分数75%的酒精浸泡30 秒，质量分数0.2%的升汞溶液中消毒30 分钟，无菌水漂洗5次，然后切开果实，用接种针将黄白色粉末状胚接种到种子萌发培养基KnP1上，10天后种子萌发，形成原球茎，为了在生产过程中获得更多的种苗，将原球茎形成芽和类原球茎的混合组织，在继代增殖培养基KnP1上继代增殖，40天后增殖4倍，形成的类原球茎继续进行增殖，得到带根的小苗, 每个果实所得的种苗数量在4万株以上；

3. 人工授粉：将2.5～3.5cm高带根的小苗100转瓶到试管开花培养基KnP2上，62天时22株开花,开花率可达22％，选取试管内生长健壮的植株进行试管内人工授粉；

4. 无菌播种：人工授粉后60天果实成熟，采下果实，果实无需消毒，切开果实进行无菌播种，7天左右种子萌发形成原球茎，80天时能形成完整的小植株, 每个果实的数量在4万株以上；

5. 壮苗培养：将无菌播种获得的密集的小植株分开后转移到壮苗培养基KnP3上培养， 70天形成株高3～4cm，每丛有2～3个芽的成苗；

6. 试管苗移栽：将成苗转移到自然光下炼苗8 天，光照度1500～2000lx, 光照10小时/天,然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在用木屑的基质中栽培，保持适当通风和足够的湿度，1000株成活968株,移栽的成活率均可达96.8%。

在上述实验中所用的培养基均为pH 5.1～5.4，培养温度（28±2）℃。

实施例3：

1. 外植体制备：开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后140天果实成熟，将果实作为外植体用于播种；

2. 原球茎诱导：播种时，将外植体依次用体积分数75%的酒精浸泡30 秒，质量分数0.2%的升汞溶液中消毒30 分钟，无菌水漂洗5次，然后切开果实，用接种针将黄白色粉末状胚接种到种子萌发培养基KnP1上，10天后种子萌发，形成原球茎，为了在生产过程中获得更多的种苗，将原球茎形成芽和类原球茎的混合组织，在继代增殖培养基KnP1上继代增殖，40天后增殖4倍，形成的类原球茎继续进行增殖，得到带根的小苗, 每个果实的数量在4万株以上；

3. 人工授粉：将2.5～3.5cm高的小苗100株转瓶到试管开花培养基KnP2上，60天时35株开花，开花率可达35％，选取试管内生长健壮的植株进行试管内人工授粉；

4. 无菌播种：人工授粉后60天果实成熟，采下果实，切开果实进行无菌播种，7天左右种子萌发形成原球茎，80天时能形成完整的小植株，每个果的数量在4万株以上；

5. 壮苗培养：将无菌播种获得的密集的小植株分开后转移到壮苗培养基KnP3上培养， 60天形成株高3～5cm，每丛有2～3个芽的成苗；

6. 试管苗移栽：将成苗转移到自然光下炼苗12 天，光照度1500～2000lx, 光照12小时/天,然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在用木屑的基质中栽培，保持适当通风和足够的湿度，1000株成活970株，移栽的成活率均可达97%。

在上述实验中所用的培养基均为pH 5.1～5.4，培养温度（26±2）℃。

Claims (2)

1.一种霍山石斛种苗繁殖方法，其特征在于，包括以下的工艺步骤：

(1) 外植体获取：在人工种植的霍山石斛开花时，选取生长健壮的母株进行人工授粉，并将人工授粉而来的成熟果实作为外植体；

(2) 原球茎诱导：将外植体依次用酒精浸泡28-32 秒，质量分数0.2%的升汞溶液消毒25-35 分钟，无菌水漂洗4-5次后切开，将胚接种到种子萌发培养基KnP1上萌发成原球茎， 并进一步分化成小苗；

(3) 人工授粉：将步骤（2）分化出的小苗转移到试管开花培养基KnP2上培养，待开花后，选取生长健壮的开花株在无菌条件下进行人工授粉； 

(4)无菌播种：果实成熟后切开进行无菌播种，种子萌发形成原球茎，并进一步形成完整的小植株；

(5)壮苗培养:将小植株转移到玻璃瓶壮苗培养基KnP3上培养，形成成苗； 

(6) 玻璃瓶苗出瓶移栽：将栽有成苗的玻璃瓶转移到自然光下炼苗8-12 天，光照度1500～2000lx, 光照9-12小时/天,然后将成苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在木屑的基质中栽培，保持适当通风和足够的湿度；

上述步骤中培养基组分及含量配比如下：

种子萌发培养基KnP1：

试管开花培养基KnP2:

KnP1培养基

6-BA        1.0 mg/L

NAA         0.1 mg/L；

壮苗培养基KnP3：

MS或B5培养基 

6-BA        0.4-0.6 mg/L

NAA         0.8-1.2 mg/L；

上述步骤中所有的培养基pH 5.1～5.4，培养温度（26±2）℃。

2.根据权利要求1所述的一种霍山石斛种苗繁殖方法，其特征在于：种子萌发温度为25～28℃；步骤(3)所述的小苗的高度为2.5～3.5cm；果实成熟期为60～70天；开花期为55～63天；步骤(5)所述的成苗高3～5cm，每丛有2～3个小苗。