CN109169285B - 一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，包括如下步骤：A)未成熟种子的获得：将洗干净的辣椒青果切成两半，取出未成熟种子接种；B)未成熟种子萌芽培养：将未成熟种子接种于种子萌芽培养基中培养；C)初代培养：将包含生长点的下胚轴接种于初代培养基中至长出不定芽；D)继代培养：将不定芽块转接至继代培养基中使腋芽伸长；E)生根培养：将腋芽伸长后的外植体接种生根培养基中培养；F)组培苗炼苗和移栽。本发明中未成熟种子培养采用开放式培养的方法，无需在超净工作台上进行接种，操作简单、方便，不受场地的限制。该方法结合辣椒种苗扩繁可短时间内能获得大量植株，显著缩短了辣椒种质资源创制与新品种选育周期。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别地，涉及一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)在全球是仅次于豆类和番茄的第三大蔬菜作物，适应性强，栽培区域广泛，营养丰富，深受人们的喜爱。据农业部大宗蔬菜产业技术体系统计，我国现有辣椒种植面积为150-200万公顷，居蔬菜首位。辣椒原产中南美洲，喜温、喜光而不耐寒，且生育周期长，在我国一般一年仅能种植两茬，创新品种选育所需周期长。因此，缩短育种时间，提高育种效率越来越受到辣椒育种家们的重视。
辣椒种苗生产一直采用种子繁育方式。近年来劳动力严重匮乏，种子繁育所需制种成本一直在上涨中。特别是一些具有特殊性状的辣椒品种(高辣椒素品种、高红色素品种)，本身繁种困难，即使大面积扩繁，传统繁种方式仍无法获得足够的种子。
有鉴于此，针对现有的问题予以研究改良，提供一种未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，旨在通过该技术，达到简化辣椒育种流程、缩短育种时间、提高育种效率，丰富辣椒育种基因库，创制更多具有价值的新种质新材料的目的。
发明内容
本发明目的在于提供一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，以解决现有技术中辣椒育种流程多、育种周期长、效率低的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，包括如下步骤：
A)未成熟种子的获得：田间取辣椒青果，放入自封袋中，封紧袋口，室温下放置2-5天，取出冲洗干净，用酒精的棉球擦拭果皮2-3次，再将果实切成两半，将未成熟种子取出，接种；
B)未成熟种子萌芽培养：将未成熟种子接种于种子萌芽培养基中培养；所述种子萌芽培养基为0.5-1.0g/L的硝酸铵+1.0-2.0g/L的硝酸钾+0.05-0.1g/L的磷酸二氢钾+0.1-0.7mg/L的赤霉素+20g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉+0.1-0.5g/L的链霉素，pH值为5.8；
C)初代培养：选择子叶刚张开的幼苗，切取包含生长点的下胚轴，接种于初代培养基中培养至下胚轴基部分化出大量不定芽；所述初代培养基为改良后的MS培养基+0.5-5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1-2.0mg/L的吲哚-3-乙酸+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉+0.02-0.08g/L多维元素片，pH值为5.8；
D)继代培养：将不定芽切成2-3块，转接至继代培养基中使腋芽伸长；所述继代培养基为MS培养基+0.1-0.5mg/L的赤霉素+0.5-5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1-2.0mg/L的吲哚-3-乙酸+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉+0.01-0.07g/L的牛血清蛋白，pH值为5.8；
E)生根培养：选择苗高4cm以上、具有3-5个腋芽的外植体，接种生根培养基中培养；所述生根培养基为1/2MS培养基+15g/L的白砂糖+6g/L的琼脂粉，pH值为5.8；
F)组培苗炼苗和移栽：选择苗高6cm以上、具有6-8个腋芽、已生根且根系发达的组培苗进行炼苗和移栽。
进一步的，所述种子萌芽培养基包括0.7g/L的硝酸铵，1.5g/L的硝酸钾，0.07g/L的磷酸二氢钾，0.5mg/L的赤霉素。
进一步的，所述种子萌芽培养基还包括0.5g/L的链霉素。
进一步的，所述初代培养基包括3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤，1.5mg/L的吲哚-3-乙酸。
进一步的，所述初代培养基包括0.04g/L多维元素片。
进一步的，所述继代培养基包括0.05g/L的牛血清蛋白。
进一步的，在所述步骤B)中的培养的条件为：所述幼胚未萌芽之前的培养温度为28.0±0.5℃，黑暗培养；所述幼胚萌芽后培养温度为25.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天；培养时间在7-8天。
进一步的，在所述步骤C)和所述步骤D)中的培养的条件均为：光照时温度为30.0±0.5℃，黑暗时温度为20.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天；其中，所述步骤C)中的初代培养时间17-20天；所述步骤D)中的继代培养1次时间20-25天。
进一步的，在所述步骤E)中，所述炼苗时温度为25.0±0.5℃，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天，炼苗时间为7-10天，湿度控制在85％以上。
进一步的，所述辣椒资源选自6421、17mx5、15s77或XJ16中的一种。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，通过在种子萌芽培养基中添加一定浓度的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾替代1/2MS培养基，节约了实验成本，并减少了实验步骤，并添加一定浓度的链霉素，简化接种流程；在初代培养基中添加一定浓度多维元素片，并对MS培养基进行相应的改良，既能缩短不定芽产生时间，又能显著提高不定芽诱导率，不定芽诱导率可达98.79％；通过继代培养基中添加一定浓度的牛血清蛋白，可大大增加不定芽伸长率和苗分化率，降低外愈伤组织的褐化率，同时茎秆更健壮，生长速度更快。该方法在短期内可获得大量辣椒植株，大大简化了辣椒育种流程，提高了育种效率。
(2)本发明提供的一种未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法可使辣椒一年种植四茬。以湖南-海南两地种植辣椒为例，9月底在海南播种辣椒种子，11月初人工授粉，12月初可获得青果，12月中旬未成熟种子可以萌芽并获得幼苗；12月底将幼苗移栽至湖南地区温室中，3个月后可获得组培幼苗；第二年3月底将幼苗又移栽至温室中，3个月后又可获得组培幼苗；6月底再次将幼苗移栽至温室中，9月底可获得组培幼苗，炼苗种植于海南三亚基地。与目前辣椒育种一年两茬(湖南一茬，海南一茬)种植相比，该方法可使辣椒一年多种两茬，显著缩短了辣椒种质资源创制与新品种选育周期。此外，本发明中未成熟种子培养采用开放式培养的方法，无需在超净工作台上进行接种，操作简单、方便，不受场地的限制。
(3)本发明提供的一种未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法可短时间内获得大量植株。1个下胚轴可获得不定芽5-8个，繁殖系数平均可达7.67(即幼胚经过初代和继代培养后1粒种子可获得7株以上的组培苗)，与一粒种子一株苗相比，本发明提供的方法仅需取3-5个青果即可在短时间内获得的大量植株。
(4)本发明利用植物组织培养技术，提供了一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，无需等到辣椒种子成熟即可快速获得大量幼苗，该发明大大缩短辣椒生育期，提高辣椒种质创新和新品种选育效率，对推动辣椒产业发展具有重要意义。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1：
本发明提供一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，包括如下步骤：
(A)未成熟种子的获得：取田间授粉后25-30天后的辣椒6421青果，放入自封袋中，封紧袋口，室温下放置3天，取出，流水下冲洗干净，用75％酒精的棉球擦拭果皮2-3次。再用解剖刀纵向将果实切成两半，最后用镊子将未成熟种子轻轻取出，用于接种。
(B)未成熟种子萌芽培养：在超净工作台上将未成熟种子接种于种子萌芽培养基中培养至长出幼苗。所述种子萌芽培养基配方为1/2MS培养基(见表1)+0.5mg/L的赤霉素+20g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉，pH值为5.8。培养条件为幼胚未萌芽之前的培养温度为28.0±0.5℃，黑暗培养；幼胚萌芽后培养温度为25.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天。
(C)初代培养：选择子叶刚张开的幼苗，在超净工作台上用解剖刀去除子叶，切取包含生长点的下胚轴，接种于初代培养基中培养至下胚轴基部分化出大量不定芽。初代培养基配方为MS培养基(见表2)+3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+1.5mg/L的吲哚-3-乙酸+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉，pH值5.8。培养条件为光照时温度30.0±0.5℃，黑暗时温度20.0±0.5℃，光照强度3000lx，光照时间为16小时/天。
(D)继代培养：在超净工作台上切取不定芽块，将其切成2-3块，转接至继代培养基中使腋芽伸长。继代培养基配方为MS培养基(见表2)+0.5mg/L的赤霉素+3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+1.5mg/L的吲哚-3-乙酸+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉，pH值为5.8。培养条件为光照时温度30.0±0.5℃，黑暗时温度20.0±0.5℃，光照强度3000lx，光照时间为16小时/天。
(E)生根培养：选择苗高4cm以上、具有3-5个腋芽的外植体，接种生根培养基中培养。生根培养基配方为1/2MS培养基(见表1)+15g/L的白砂糖+6g/L的琼脂粉，pH值为5.8。培养条件为光照时温度30.0±0.5℃，黑暗时温度20.0±0.5℃，光照强度3000lx，光照时间为16小时/天。
(F)组培苗炼苗和移栽：选择苗高6cm以上、具有6-8个腋芽、已生根且根系发达的组培苗，在光照培养室开瓶培养2天后取出，流水下小心洗净组培苗根部培养基，再移至装有由草炭、蛭石和珍珠岩(体积比为3:1:2)混合基质组成的营养钵中，浇足清水，25℃下炼苗8天，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天，湿度应控制在85％以上。待小植株生长势变旺可移入大田中。
表1 1/2MS培养基成分单位(mg/L)
表2MS培养基成分单位(mg/L)
| 大量元素 | 浓度 | 微量元素 | 浓度 | 有机物质 | 浓度 | 铁盐 | 浓度 |
| NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> | 1650 | KI | 0.83 | 肌醇 | 100 | FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 27.8 |
| KNO<sub>3</sub> | 1900 | H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> | 6.2 | 烟酸 | 0.5 | Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O | 37.3 |
| CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O | 440 | MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O | 22.3 | 盐酸吡哆醇 | 0.5 | ||
| MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 370 | ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 8.6 | 盐酸硫胺素 | 0.1 | ||
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 170 | Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 0.25 | 甘氨酸 | 2.0 | ||
| CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 0.025 | ||||||
| CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 0.025 |
表3改良后的MS培养基成分单位(mg/L)
| 大量元素 | 浓度 | 微量元素 | 浓度 | 有机物质 | 浓度 | 铁盐 | 浓度 |
| NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> | 825 | KI | 0.5 | 肌醇 | 100 | FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 20 |
| KNO<sub>3</sub> | 950 | H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> | 6.2 | 烟酸 | 0.5 | Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O | 37.3 |
| CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O | 220 | MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O | 22.3 | ||||
| MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 185 | ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 8.6 | ||||
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 85 | Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 0.25 | ||||
| CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 0.025 |
实施例2：
在超净工作台上将未成熟种子接种于种子萌芽培养基中培养至长出幼苗。培养基配方为0.7g/L的硝酸铵+1.5g/L的硝酸钾+0.07g/L的磷酸二氢钾+0.5mg/L的赤霉素+20g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉，其他操作及条件同实施例1。接种7天后观察发现，实施例2与实施例1中种子萌芽率均达大于95％，说明此无机盐代替1/2MS培养基培养种子是可行的，该法节约了实验成本，并减少了实验步骤。
实施例3：
将辣椒未成熟种子接种于额外添加了0.5g/L的链霉素的培养基中，且实验不在超净工作台上进行，其他操作及条件同实施例2。接种3天后观察发现往培养基中添加低浓度的链霉素与在超净工作台中接种效果等同，实施例3与实施例2中种子染菌率均小于1％；接种7天后观察种子萌发率发现添加链霉素不影响种子的萌发，实施例3与实施例2中种子萌发率均大于95％，说明采用添加链霉素的方法可以简化接种流程。
实施例4：将辣椒子叶外植体分别接种于添加了0.02g/L多维元素片的初代培养基中，其他操作及条件同实施例3。
实施例5：将辣椒子叶外植体分别接种于添加了0.04g/L多维元素片的初代培养基中，其他操作及条件同实施例3。
实施例6：将辣椒子叶外植体分别接种于添加了0.06g/L多维元素片的初代培养基中，其他操作及条件同实施例3。
实施例7：将辣椒子叶外植体分别接种于添加了0.04g/L多维元素片和改良MS培养基的初代培养基中，其他操作及条件同实施例5。
接种后不时观察外植体生长情况，观察外植体生长情况，结果见表3。
表4不同成分的初代培养基中辣椒不定芽诱导情况
注：表中同列数字后大写字母表示P<0.01水平差异，小写字母表示P<0.05水平差异。
由表4可以看出，添加多维生素片既能缩短不定芽产生时间，又能显著提高不定芽诱导率。初代培养基中添加0.04g/L的多维生素片和添加0.06g/L的多维生素片效果等同，考虑到成本因素，以添加多维生素片0.04g/L为最适添加量。改良后MS培养基中外植体不定芽诱导率显著高于未改良MS培养基中不定芽诱导率。与实施例5相比，实施例7中不定芽诱导率增幅达9.32％。与实施例3相比，实施例7中不定芽诱导率增幅达22.67％。
实施例8：将初代培养后产生的不定芽块分别接种至添加了0.01g/L的牛血清蛋白的继代培养基中，其他操作及条件同实施例3。
实施例9：将初代培养后产生的不定芽块分别接种至添加了0.05g/L的牛血清蛋白的继代培养基中，其他操作及条件同实施例3。
实施例10：将初代培养后产生的不定芽块分别接种至添加了0.07g/L的牛血清蛋白的继代培养基中，其他操作及条件同实施例3。
表5添加不同浓度牛血清蛋白的继代培养基中辣椒不定芽伸长和苗分化情况
| 组别 | 牛血清蛋白(g/L) | 不定芽伸长率(％) | 苗分化率(％) |
| 实施例3 | 0 | 23.21±1.24Dd | 23.21±1.24Dd |
| 实施例8 | 0.01 | 34.72±2.21Cc | 34.72±2.21Cc |
| 实施例9 | 0.05 | 50.53±2.89Aa | 50.53±2.89Aa |
| 实施例10 | 0.07 | 42.28±2.18Bb | 42.28±2.18Bb |
注：表中同列数字后大写字母表示P<0.01水平差异，小写字母表示P<0.05水平差异。
从植株生长状态来看，添加了牛血清蛋白的培养基中组培不定芽分枝更多，茎秆更健壮，生长势更好，生长速度更快，愈伤组织褐化率低。从不定芽伸长和苗分化率来看，培养基中添加牛血清蛋白后，不定芽伸长率和苗分化率随着牛血清蛋白浓度的增加呈先上升后降低的趋势。牛血清蛋白浓度为0.05g/L时，不定芽伸长率和苗分化率均可达50.53％，为实施例3中不定芽伸长率和苗分化率的2.17倍(如表5所示)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A)未成熟种子的获得：田间取辣椒青果，放入自封袋中，封紧袋口，室温下放置2-5天，取出冲洗干净，用酒精的棉球擦拭果皮2-3次，再将果实切成两半，将未成熟种子取出，接种；
B)未成熟种子萌芽培养：将未成熟种子接种于种子萌芽培养基中培养；所述种子萌芽培养基为0.5-1.0g/L的硝酸铵+1.0-2.0g/L的硝酸钾+0.05-0.1g/L的磷酸二氢钾+0.1-0.7mg/L的赤霉素+20g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉+0.1-0.5g/L的链霉素，pH值为5.8；
C)初代培养：选择子叶刚张开的幼苗，切取包含生长点的下胚轴，接种于初代培养基中培养至下胚轴基部分化出大量不定芽；所述初代培养基为改良后的MS培养基+0.5-5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1-2.0mg/L的吲哚-3-乙酸+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉+0.02-0.08g/L多维元素片，pH值为5.8；
D)继代培养：将不定芽切成2-3块，转接至继代培养基中使腋芽伸长；所述继代培养基为MS培养基+0.1-0.5mg/L的赤霉素+0.5-5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.1-2.0mg/L的吲哚-3-乙酸+30g/L的蔗糖+6g/L的琼脂粉+0.01-0.07g/L的牛血清蛋白，pH值为5.8；
E)生根培养：选择苗高4cm以上、具有3-5个腋芽的外植体，接种生根培养基中培养；所述生根培养基为1/2MS培养基+15g/L的白砂糖+6g/L的琼脂粉，pH值为5.8；
F)组培苗炼苗和移栽：选择苗高6cm以上、具有6-8个腋芽、已生根且根系发达的组培苗进行炼苗和移栽。
2.根据权利要求1所述的一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，其特征在于，所述种子萌芽培养基包括0.7g/L的硝酸铵，1.5g/L的硝酸钾，0.07g/L的磷酸二氢钾，0.5mg/L的赤霉素。
3.根据权利要求1所述的一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，其特征在于，所述种子萌芽培养基还包括0.5g/L的链霉素。
4.根据权利要求1所述的一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，其特征在于，所述初代培养基包括3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤，1.5mg/L的吲哚-3-乙酸。
5.根据权利要求1所述的一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，其特征在于，所述初代培养基包括0.04g/L多维元素片。
6.根据权利要求1所述的一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，其特征在于，所述继代培养基包括0.05g/L的牛血清蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，其特征在于，在所述步骤B)中的培养的条件为：所述幼胚未萌芽之前的培养温度为28.0±0.5℃，黑暗培养；所述幼胚萌芽后培养温度为25.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天；培养时间在7-8天。
8.根据权利要求1所述的一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，其特征在于，在所述步骤C)和所述步骤D)中的培养的条件均为：光照时温度为30.0±0.5℃，黑暗时温度为20.0±0.5℃，光照强度为3000lx，光照时间为16小时/天；其中，所述步骤C)中的初代培养时间17-20天；所述步骤D)中的继代培养1次时间20-25天。
9.根据权利要求1所述的一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法，其特征在于，在所述步骤E)中，所述炼苗时温度为25.0±0.5℃，光照强度为2000lx，光照时间为16小时/天，炼苗时间为7-10天，湿度控制在85％以上。
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| CN109169285A (zh) | 2019-01-11 |
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