CN107155879B - 一种黑松无菌快速繁殖方法 - Google Patents
一种黑松无菌快速繁殖方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107155879B CN107155879B CN201710276683.7A CN201710276683A CN107155879B CN 107155879 B CN107155879 B CN 107155879B CN 201710276683 A CN201710276683 A CN 201710276683A CN 107155879 B CN107155879 B CN 107155879B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- callus
- culture medium
- medium
- black pine
- pine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明涉及一种黑松无菌快速繁殖方法,步骤如下:(1)于春季取黑松针叶基部片段为外植体;(2)接种于MS培养基+6‑BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L上诱导产生愈伤组织;(3)将愈伤组织接种于1/2MS培养基+NAA 0.05mg/L+PSK 0.001mg/L上实现其大量增殖;(4)将愈伤组织接种于1/4MS培养基+NAA 0.01mg/L+PSK 0.002mg/L上诱导不定芽分化;(5)将单芽切下接种于1/2MS培养基+NAA0.25mg/L+IBA0.25mg/L上诱导生根;(6)将生根的小绿苗经炼苗后移栽于配方为1/4细沙土+1/4蛭石+1/2腐殖土的基质中进一步生长。本发明在短时间内将愈伤组织大量增殖,再将愈伤组织分化形成再生苗,可实现优良黑松个体的保种和大量繁殖。
Description
技术领域
本发明所属植物组织培养研究领域,本发明涉及一种黑松无菌快速繁殖方法。
背景技术
黑松(Pinus thunbergii)原产日本,于上世纪20年代引种中国,因具有耐干旱瘠薄、抗海 风海煞、抗松干蚧和松毛虫等病虫害、树型优美等特点,成为了我国东部沿海沿防林建设中 不可取代的优势种,北起大连、旅顺南至台湾沿海地区及内陆部分地区均有栽培。初引种之 时,黑松具有生长速度较快、抗病虫能力强的特点,但是近些年的调查数据表明,黑松在生 活力、生长速度、抗逆性、林木品质、观赏价值上都有不同程度的下降,特别是抗病性严重 下降,容易感染黑松枝枯病和线虫病。目前黑松苗木的培育以种子繁殖为主,种子市场管理 混乱,导致黑松种子纯度严重下降和品质的退化,所以市场上的黑松苗木品质也在逐年退化。 因此,筛选野生优良个体,并对其进行保种繁殖成为了黑松育种的一个重要方法,组织培养 工作者试图对个别抗病植株进行室内无菌繁殖方法研究,以期在室内短期内获取无毒无菌幼 苗。目前黑松再生苗有成功诱导都以合子胚为外植体,由合子胚直接诱导不定芽的产生或诱 导胚性愈伤组织再形成体细胞胚,进而发育形成无菌苗,未见有通过愈伤组织增殖再经茎芽 分化形成再生苗的技术报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种黑松无菌快速繁殖方法,采用黑松针叶为外植体有效地获得愈 伤组织,并在短时间内使愈伤组织大量增殖,后进一步分化形成无菌苗,炼苗、移栽实现快 速繁殖。本发明的具体步骤如下:
1)外植体的选取:于春季采集树龄在7年以下幼年黑松顶端的幼嫩松枝,将其上的松针连鞘 拔下,清洗后在超净工作台内进行消毒处理,得到无菌的松针;
2)愈伤组织的诱导培养:在无菌条件下将无菌松针的基部切下1cm长的片段,接种于诱导 培养基中,于25℃、黑暗条件下进行培养。其中,所述诱导培养基配方如下:以MS培养基 为基本培养基,并添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、6-BA2mg/L+NAA0.05mg/L。培养15d后 针叶基片段部开始产生愈伤组织,3周后诱导率为47.2%;
3)愈伤组织的增殖:将诱导出的愈伤组织转接于增殖培养基上,于25℃、光照强度为1500Lux 条件下进行培养,使愈伤组织活力增强并大量增殖。其中,所述增殖培养基是以1/2MS为基 本培养基,pH=6.4,并添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、水解酪蛋白1000mg/L、NAA0.05mg/L+PSK0.001mg/L。愈伤组织可2周扩增1倍;
4)不定芽的分化培养:将增殖后的愈伤组织转接于分化培养基上,于25℃、光照强度为 2500Lux条件下进行培养,促使愈伤组织分化为不定芽。所述分化培养基是以1/4MS为基本 培养基,pH=6.4,并添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、水解酪蛋白500mg/L、NAA0.01mg/L+PSK0.002mg/L。4周分化率为88.2%;
5)生根培养:将芽高大于1.5cm的不定芽切下,转入生根培养基,于25℃、光照强度为2500Lux 条件下进行培养,诱导不定芽生根。所述分化培养基是以1/2MS培养基为基本培养基,pH=6.4, 并添加蔗糖30g/L、NAA0.25mg/L+IBA0.25mg/L时,30天生根率为71.8%。
6)炼苗和移栽:当种苗扩繁到一定数量后,选取2.5cm以上的小植株进行炼苗移栽,60天 后小植株成活率可达到90%以上。
本发明的优点在于:提供了一套完整的黑松无菌快速繁殖技术,从针叶诱导出活力强的 愈伤组织、在短时间内可将愈伤组织大量增殖(两周倍增),再由愈伤组织分化成绿苗,经炼 苗和移栽后成为种苗。从愈伤组织诱导至成苗仅需4个月,由于愈伤组织可实现两周倍增, 因此该技术大大加快了黑松育苗速度。本发明为黑松优良个体的保种和扩繁提供了一条新的 可行方法,可为黑松进一步人工规模化繁殖和栽培黑松提供优质种苗。
具体实施方式
一种黑松的无菌快速繁殖方法,通过以下步骤来进行:
1、外植体的选取
于春季采集树龄在7年以下的黑松顶端幼嫩松枝,将其上的松针拔下,流水冲洗后在超 净工作台内进行消毒处理,75%酒精消毒30秒,无菌水洗涤2-3次,再用20%过氧化氢消毒 17-18分钟,期间不时进行摇晃,无菌水洗涤2-3次,得到无菌的松针;
2、愈伤组织的诱导培养
在无菌条件下将无菌松针的基部切下1cm长的片段,接种于诱导培养基中,于25℃、黑 暗条件下进行培养。采用两因素设计法对诱导培养基进行激素用量的筛选:以MS培养基为 基本培养基,pH=6.4,并添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L和不同浓度配比的激素组合,其中, 生长素选用NAA,其浓度为0mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L,细胞分裂素选用6-BA, 其浓度为0mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L,两种激素浓度两两组合,共16个处理,每个处理 接种30个松针片断,重复3次,筛选确定影响黑松愈伤组织诱导率和愈伤组织质量的激素最 佳浓度配比。3周后统计愈伤组织诱导率,愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的接种松针数/未污 染的接种松针数×100%;
表1不同激素组合条件下愈伤组织的诱导率(%)
***:表示愈伤组织颜色活力最强,**:表示愈伤组织颜色活力强,**:表示愈伤组织颜色活力弱
培养15d后针叶基部开始产生愈伤组织,3周后,不同激素组合愈伤组织诱导率如表1 所示。虽然黑松基部切段诱导率在6-BA 2mg/L+NAA0.1mg/L时最高,为60.7%,但愈伤组 织易于褐化,而6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L激素组合诱导出的愈伤组织颜色鲜绿,松散,活力最强,且愈伤组织诱导率也较高(47.2%),因此采用该愈伤组织作为增殖对象;
3、愈伤组织的增殖
将活力最佳的愈伤组织转接于增殖培养基上,于25℃、光照强度为1500Lux条件下进行 培养,使愈伤组织活力增强并大量增殖。采用单因素设计法对增殖培养基进行以下三方面的 筛选:基本培养基、水解酪蛋白浓度和激素浓度。每个处理接种5瓶,每瓶接愈伤组织1g左 右,以确定最佳增殖培养基配方。接种3周后测愈伤组织生长量并记录其颜色状态,统计其 增殖率,增殖率=(21天时愈伤组织的质量-初始接种质量)/初始接种质量×100%;
3.1基本培养基筛选
选用四种基本培养基:MS、1/2MS、GD、B5培养基无机元素+1/2MS培养基有机物, pH=6.4,并添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、NAA0.05mg/L+6-BA2mg/L。21天后增殖率最大 者为1/2MS(94.5%),因此,以下增殖实验均采用1/2MS为基本培养基;
3.2水解酪蛋白筛选
以1/2MS为基本培养基,选用水解酪蛋白四个梯度:0mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L,pH=6.4,并添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、NAA0.05mg/L+6-BA2mg/L;21天后 增殖率最大者为1000mg/L者(113.7%),因此,以下增殖实验均添加水解酪蛋白1000mg/L;
3.3激素筛选
以1/2MS为基本培养基,选用激素五个组合梯度:NAA0.05mg/L+PSK0.001mg/L、NAA0.05mg/L+PSK0.002mg/L、NAA0.05mg/L+PSK0.003mg/L、NAA0.05mg/L+PSK0.004mg/L 和NAA0.05mg/L+PSK0.005mg/L,pH=6.4,并以NAA0.05mg/L+6-BA2mg/L为对照,培养基 中还添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、水解酪蛋白1000mg/L。21天后增殖率最大者为NAA0.05mg/L+PSK0.001mg/L者(153.4%),且结果与其它组具有显著性差异;
因此,最佳增殖培养基配方为:以1/2MS为基本培养基,pH=6.4,并添加了蔗糖30g/L、 琼脂6.5g/L、水解酪蛋白1000mg/L、NAA0.05mg/L+PSK0.001mg/L,此时愈伤组织2周增殖 1倍;
4、不定芽的分化培养
将增殖后的愈伤组织挑取颜色鲜绿、生长旺盛者,转接于分化培养基上,于25℃、光照 强度为2500Lux条件下进行培养,促使愈伤组织分化为不定芽。分别采用单因素设计法和两 因素设计法对增殖培养基进行以下两方面的筛选:基本培养基和激素浓度。每个处理接10瓶, 每瓶中接黄豆粒大的愈伤组织5块,4周后统计不定芽分化率,不定芽分化率=分化的不定芽 数/接种的愈伤组织块数×100%;
4.1激素的筛选
以1/2MS培养基为基本培养基,pH=6.4,并添加了蔗糖30g/L、水解酪蛋白500mg/L、 琼脂6.5g/L,选用激素NAA(0mg/L和0.01mg/L)和PSK(0.001mg/L、0.002mg/L、0.005mg/L), 两种激素浓度两两组合,共形成6个处理。4周后不定芽分化率最高者为 NAA0.01mg/L+PSK0.002mg/L,分化率为68.3%;
4.2基本培养基筛选
选用四种基本培养基:MS、1/2MS、GD、1/4MS,pH=6.4,并添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、水解酪蛋白500mg/L、NAA0.01mg/L+PSK0.002mg/L。4周后分化率最大者为1/4MS(88.2%),因此,最佳分化培养基配方为:以1/4MS为基本培养基,pH=6.4,并添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、水解酪蛋白500mg/L、NAA0.01mg/L+PSK0.002mg/L;
5、生根培养
将芽高大于1.5cm的不定芽从基部切下,转入生根培养基,于25℃、光照强度为2500Lux 条件下进行培养,诱导不定芽生根。所述分化培养基是以1/2MS培养基为基本培养基,pH=6.4, 并添加蔗糖30g/L、激素设九个梯度:NAA0.5mg/L、NAA 1.0mg/L、NAA2.0mg/L、IBA0.5mg/L、 IBA1.0mg/L、IBA2.0mg/L、NAA0.25mg/L+IBA0.25mg/L、NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L、 NAA1.0mg/L+IBA1.0mg/L,30天后统计生根率,生根率=生根的不定芽数/转接的不定芽数× 100%;统计结果显示,培养基中激素为NAA0.25mg/L+IBA0.25mg/L时,生根率最高,为71.8%。
6、炼苗和移栽
将生根的小绿苗继续培养20天,当根长至1.5cm以上时,进行炼苗移栽。先将培养瓶打 开,在培养室适应2天后转移到温室中炼苗,轻轻地将小苗取出,用清水洗掉残留培养基, 移栽至穴盘中,穴盘内装有育苗基质,其配方为:1/4细沙土+1/4蛭石+1/2腐殖土,基质用0.3-0.5%KMnO4消毒。期间要保持温室内湿度70%、光照为自然光的70%,温度为25±2℃, 20天后进行常规管理,60天后成活率为大于90%。
Claims (1)
1.一种黑松的无菌快速繁殖方法,其特征在于包括以下步骤:
1)外植体的选取:于春季采集树龄在7年以下的黑松顶端幼嫩松枝,将其上的松针拔下,流水冲洗后在超净工作台内进行消毒处理,75%酒精消毒30秒,无菌水洗涤2-3次,再用20%过氧化氢消毒17-18分钟,期间不断进行摇晃,无菌水洗涤2-3次,得到无菌的松针;
2)愈伤组织的诱导培养:在无菌条件下将无菌松针的基部切下1cm长的片段,接种于诱导培养基中,于25℃、黑暗条件下进行培养;其中,所述诱导培养基配方如下:以MS培养基为基本培养基,仅添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、6-BA2mg/L、NAA0.05mg/L;
3)愈伤组织的增殖:将诱导出的愈伤组织转接于增殖培养基上,于25℃、光照强度为1500Lux条件下进行培养,使愈伤组织活力增强并大量增殖;其中,所述增殖培养基是以1/2MS为基本培养基,pH=6.4,仅添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、水解酪蛋白1000mg/L、NAA0.05mg/L、PSK0.001mg/L;
4)不定芽的分化培养:将增殖后的愈伤组织转接于分化培养基上,于25℃、光照强度为2500Lux条件下进行培养,促使愈伤组织分化为不定芽;所述分化培养基是以1/4MS为基本培养基,pH=6.4,仅添加了蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L、水解酪蛋白500mg/L、NAA0.01mg/L、PSK0.002mg/L;
5)生根培养:将芽高大于1.5cm的不定芽切下,转入生根培养基,于25℃、光照强度为2500Lux条件下进行培养,诱导不定芽生根;所述生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基,仅添加蔗糖30g/L、NAA0.25mg/L、IBA0.25mg/L;
6)炼苗和移栽:当种苗扩繁到一定数量后,选取2.5cm以上的小植株进行炼苗、移栽,移栽育苗基质配方为:1/4细沙土+1/4蛭石+1/2腐殖土;60天后小植株成活率能达到90%以上。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710276683.7A CN107155879B (zh) | 2017-04-25 | 2017-04-25 | 一种黑松无菌快速繁殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710276683.7A CN107155879B (zh) | 2017-04-25 | 2017-04-25 | 一种黑松无菌快速繁殖方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107155879A CN107155879A (zh) | 2017-09-15 |
CN107155879B true CN107155879B (zh) | 2019-03-08 |
Family
ID=59812376
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710276683.7A Expired - Fee Related CN107155879B (zh) | 2017-04-25 | 2017-04-25 | 一种黑松无菌快速繁殖方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107155879B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113711918B (zh) * | 2021-09-16 | 2022-05-13 | 安徽农业大学 | 一种黄山松的组培快繁方法 |
CN115316248A (zh) * | 2022-08-16 | 2022-11-11 | 青岛农业大学 | 一种黑松水培苗的培育方法及其应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102577956A (zh) * | 2012-02-21 | 2012-07-18 | 南京林业大学 | 一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法 |
CN102599064B (zh) * | 2012-04-11 | 2013-12-04 | 成都大学 | 一种以叶原基为外植体的金钱松愈伤组织培养方法 |
CN104770297B (zh) * | 2015-04-08 | 2017-01-18 | 成都大学 | 一种以金钱松叶片为外植体的金钱松植株再生方法 |
-
2017
- 2017-04-25 CN CN201710276683.7A patent/CN107155879B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107155879A (zh) | 2017-09-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101946703B (zh) | 以叶片为外植体的月季再生植株的方法 | |
CN109220793B (zh) | 一种蝴蝶兰新品种的选育方法 | |
CN102845313A (zh) | 狗枣猕猴桃的离体快速繁殖方法 | |
CN104885948B (zh) | 一种油茶子叶节直接再生植株的方法 | |
CN111264383B (zh) | 一种同步选育和保存姜花属杂交新品系及种质的方法 | |
CN107278891B (zh) | 一种杏梅组织培养快速繁殖方法 | |
CN107027627B (zh) | 一种多花黄精幼胚培养的微块茎繁殖方法 | |
ERCAN et al. | Androgenic responses of different pepper (Capsicum annuum L.) cultivars | |
CN107155879B (zh) | 一种黑松无菌快速繁殖方法 | |
CN104938335B (zh) | 利用油茶下胚轴获得再生植株的方法 | |
Badrelden | Establishment of in Direct Propagation of Mandarin (Citrus reticulata L) using tissue culture | |
CN101946704B (zh) | 以未成熟种子为外植体的月季再生植株的方法 | |
CN111134019B (zh) | 一种齿叶冬青体细胞胚胎直接发生和植株再生的方法 | |
CN106165648B (zh) | 一种紫荆组培培养基及培养方法 | |
CN116076368B (zh) | 一种雏菊无菌苗快速繁殖的方法 | |
AbdAlla et al. | In vitro propagation of Blackberry (Rubus fruticosus L.) | |
CN105104200B (zh) | 一种合柱金莲木的组织培养快速繁殖方法 | |
CN113317206B (zh) | 一种用于墨脱百合组培快繁的培养基组合、组培快繁方法及应用 | |
CN1586164A (zh) | 万带兰的无菌播种和组织培养技术 | |
CN109169285B (zh) | 一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法 | |
CN109526748B (zh) | 一种白鹤芋花序组织培养方法 | |
Ambajo et al. | Micropropagation of Launaea cornuta-an important indigenous vegetable and medicinal plant | |
CN108056023B (zh) | 无种质基因型限制高频体胚再生培养方法 | |
CN106900559B (zh) | 一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法 | |
CN101375670B (zh) | 五唇兰的无菌播种和组织培养方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190308 Termination date: 20200425 |