CN105104200B - 一种合柱金莲木的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种合柱金莲木的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：(1)取合柱金莲木种子作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS诱导培养基中诱导发芽得到无菌试管苗；(3)将所述无菌试管苗置于MS增殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽；(4)将所述丛生芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株；(5)将所述健壮植株置于1/2MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；(6)取完整的带根苗进行炼苗后移植于苗床生长一个月，再移栽至大田。采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量合柱金莲木的优质种苗，有效解决了合柱金莲木的规模化育苗问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种合柱金莲木的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
合柱金莲木，拉丁学名为Sauvagesia rhodoleuca(Diels)M.C.E.，又名辛木，属金莲木科(Ochnaceae)落叶小灌木，为我国特有的单种属植物。合柱金莲木以根茎入药，具有止痒杀虫等功效。由于合柱金莲木形态特征与南美洲产的Wallacea属植物很接近，因此，它的存在对于进一步研究本科植物的区系、地理分布及其发生与演化等具有重要的科学意义。
合柱金莲木主要分布于广西金秀、龙胜、融水、德保和广东的封开、连山、怀集等地。常生长在海拔200-1000m的中、低山区，呈片状生于密林或疏林下。由于森林砍伐，生境破坏和挖取根茎入药，致使植株日趋减少，有面临绝灭的危险，因此于1999年被列入《国家重点保护野生植物名录(第1批)》中，为国家一级重点保护野生植物。在自然条件下，合柱金莲木主要依靠种子进行繁育，但种子微小，且果实成熟后即开裂散落的特性常造成种子产量低，生产上难以实现大面积栽培。
发明内容
本发明的目的是提供一种合柱金莲木的组织培养快速繁殖方法，能够有效快速地提高合柱金莲木种苗的繁殖速度和质量，实现合柱金莲木优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种合柱金莲木组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选取合柱金莲木种子作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，所述无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天，种子发芽后获得无菌试管苗，所述MS培养基中添加1.5mg/L灵发素LFS、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，所述MS繁殖培养基中添加1.0-2.0mg/L灵发素LFS、0.5-1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3-0.5mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖、4.5g/L的琼脂和1g/L的活性炭，培养基的pH值为5.8；
(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，所述MS壮苗培养基中添加1.0mg/L灵发素LFS、1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖、4.5g/L的琼脂和1g/L的活性炭，培养基的pH值为5.8；
(5)健壮植株生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养25天得到带根的完整植株，所述1/2MS生根培养基中添加0.1-1.0mg/L灵发素LFS、0.5-2.0mg/L的吲哚丁酸IBA、0.1-0.3mg/L的ABT 1号生根粉、30g/L蔗糖、4.5g/L的琼脂和1g/L的活性炭，培养基的pH值为5.8；
(6)炼苗与移栽：步骤(5)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到细河沙：泥炭土＝1:2的苗床中，在苗床中生长一个月后移栽大田，移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-25℃，相对湿度75-90％，遮阳率为60-80％。
本发明的突出优点在于：
(1)采用生物技术对合柱金莲木进行组织培养快速繁殖，保持了原有品种的优良性状，在短时间内培育出大量可供大田栽培的合柱金莲木幼苗，具有繁育速度快、种苗质量均一，且不受时间、空间和季节限制等突出优点，缩短了种苗繁育周期，提高了种苗质量和种苗繁殖系数，适用于工厂化生产，从而满足生产上的需要。
(2)在MS诱导培养基中添加灵发素、6-苄基腺嘌呤和萘乙酸，能够诱导不定芽萌发；在MS增殖培养基中添加灵发素、6-苄基腺嘌呤和激动素可促进不定芽的分化和生长；在MS壮苗培养基中添加灵发素、萘乙酸和吲哚乙酸可促进苗壮和芽的再次增殖；在1/2MS生根培养基中添加灵发素、吲哚丁酸和ABT 1号生根粉可获得完整的带根苗，经炼苗后可直接移栽至苗床中。
(3)采用本发明所述的培养方法得到的丛生芽增殖系数高达16倍，经过扩繁、壮苗和生根培养，组培苗生根率达78.87％以上，移栽苗床后成活率在91.7％以上。本发明提供的合柱金莲木的组织培养方法能够快速、便捷、高效地繁殖出大量适合移栽的优良合柱金莲木种苗，满足生产上的需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
本发明所述的合柱金莲木组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选取合柱金莲木种子作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，所述无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天，种子发芽后获得无菌试管苗。所述MS培养基中添加1.5mg/L灵发素LFS、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽。所述MS繁殖培养基中添加如表1所示的不同浓度的灵发素LFS、6-苄基腺嘌呤6-BA和激动素KT、30g/L蔗糖、4.5g/L的琼脂和1g/L的活性炭，培养基的pH值为5.8。数据分析发现，灵发素和激动素对合柱金莲木丛生芽的增殖系数具有显著影响，根据芽增殖系数确定的最适培养基激素浓度为1.5mg/L的灵发素LFS、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA和0.5mg/L的激动素KT，此时芽增殖系数高达16.25，如实施例5所示。
表1不同激素对合柱金莲木组织培养快速繁殖效果的影响
注：表1中K1/3为水平1的3次指标值的平均；K2/3为水平2的3次指标值的平均；K3/3为水平3的3次指标值的平均；
R表示灵发素LFS，6-苄基腺嘌呤6-BA和激动素KT在各自取值范围内的极差。
(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，所MS壮苗培养基中添加1.0mg/L灵发素LFS、1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖、4.5g/L的琼脂和1g/L的活性炭，培养基的pH值为5.8；
(5)健壮植株生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养25天得到带根的完整植株，所述1/2MS生根培养基中添加如表2所示的不同浓度的灵发素LFS、吲哚丁酸IBA、ABT 1号生根粉、30g/L蔗糖、4.5g/L的琼脂和1g/L的活性炭，培养基的pH值为5.8；观察发现，灵发素和吲哚丁酸对合柱金莲木组培苗的生根率具有显著影响，根据生根率确定的最适培养基激素浓度为0.1mg/L的灵发素LFS、1.0mg/L的吲哚丁酸IBA和0.2mg/L的ABT 1号生根粉，此时生根率高达95.62，如实施例2所示。
表2不同激素对合柱金莲木组织培养快速繁殖效果的影响
注：
表2中K1/3为水平1的3次指标值的平均；K2/3为水平2的3次指标值的平均；K3/3为水平3的3次指标值的平均；
R表示灵发素LFS，吲哚丁酸IBA和1号生根粉ABT在各自取值范围内的极差。
(6)炼苗与移栽：步骤(5)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到细河沙：泥炭土＝1:2的苗床中，在苗床中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-25℃，相对湿度75-90％，遮阳率为60-80％，成活率为91.7％。
Claims (1)
1.一种合柱金莲木组织培养快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：选取合柱金莲木种子作为外植体，依次用2％洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，所述无菌水为经高压灭菌的蒸馏水；
(2)种子萌发获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天，种子发芽后获得无菌试管苗，所述MS培养基中添加1.5mg/L灵发素LFS、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽，所述MS繁殖培养基中添加1.0-2.0mg/L灵发素LFS、0.5-1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3-0.5mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖、4.5g/L的琼脂和1g/L的活性炭，培养基的pH值为5.8；
(4)丛生芽壮苗培养：将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天得到健壮植株，所述MS壮苗培养基中添加1.0mg/L灵发素LFS、1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖、4.5g/L的琼脂和1g/L的活性炭，培养基的pH值为5.8；
(5)健壮植株生根培养：将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养25天得到带根的完整植株，所述1/2MS生根培养基中添加0.1-1.0mg/L灵发素LFS、0.5-2.0mg/L的吲哚丁酸IBA、0.1-0.3mg/L的ABT 1号生根粉、30g/L蔗糖、4.5g/L的琼脂和1g/L的活性炭，培养基的pH值为5.8；
(6)炼苗与移栽：步骤(5)获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到细河沙：泥炭土＝1:2的苗床中，在苗床中生长一个月后移栽大田，移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-25℃，相对湿度75-90％，遮阳率为60-80％。
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