CN103493737B - 一种促进米斛原球茎芽发生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进米斛原球茎芽发生的方法。该方法首先通过低温联合弱光诱导米斛种胚萌动形成米斛原球茎，然后通过光照联合L-鸟氨酸诱导米斛原球茎增殖形成大量的米斛类原球茎，最后通过低温联合L-鸟氨酸诱导米斛类原球茎萌芽形成米斛原球茎芽。本发明与通过米斛种胚诱导无菌试管苗再获得米斛类原球茎相比，生产周期从7～9个月缩短至3～4个月；不仅避免了外源激素通过原球茎芽富集到米斛植株中而危害人体健康，而且米斛原球茎芽产量高，每克类原球茎可以诱导生成150～200棵米斛原球茎芽。本发明工艺简单、经济可行，本发明获得的米斛原球茎芽既可作为米斛类药品及保健品研发的直接原料；又可作为种苗进行人工栽培。

Description

一种促进米斛原球茎芽发生的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种促进米斛原球茎芽发生的方法。

技术背景

米斛是霍山石斛的俗称，是我国特有的一种传统而名贵的中草药。赵学敏在他所著的《本草纲目拾遗》中引用范瑶初云：“霍山属六安州，其地所产石斛，名米心石斛。以其形如累米，多节，类竹鞭，干之成团，他产者不能米心，亦不成团也。”《神农本草经》中记载米斛具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、清音明目功效。现代药理研究表明，米斛含有多糖等功能因子，具有增强机体免疫力、降血糖、白内障等生理功能。因此，米斛倍受药品、保健品、化妆品等领域的青睐，目前市场价格为400元/克左右，因而又有软黄金的美称。

米斛生长在悬崖峭壁崖的石缝隙间和参天古树上，生长极其缓慢，自身繁殖能力低下，加之药农的过度采集和生态环境的日趋恶化，野生米斛资源极其匮乏。为保护米斛野生种质资源、可持续利用米斛资源，人们加强了米斛的组织培养和人工繁殖研究，取得了一定的突破。比如，公开号为CN102835317A的发明提供了一种硒化霍山石斛培养物（即富硒的米斛愈伤组织）及其生产方法，公开号为CN102246697A的发明提供了一种霍山石斛体细胞胚发生的方法，公开号为CN102283120A的发明提供了一种霍山石斛种苗繁殖方法，这些发明都是首先通过米斛的成熟果实诱导获得无菌试管苗，再通过无菌试管苗诱导获取体细胞胚，或者通过体细胞胚进一步分化成种苗或植株。这些方法存在以下不足：（1）无菌试管苗的诱导至少需要6个月，不仅生产周期长，而且要求果实里的种胚成熟度高；（2）体细胞胚进一步分化成种苗或植株时添加了外源激素，这使米斛存在外源激素残留的隐患。可见，如何安全、高效地进行进行米斛的人工繁殖仍是限制可持续利用米斛资源的瓶颈。

低温是自然环境中种胚萌动、胚芽萌发的重要诱导子之一。低温刺激会引发植物细胞产生一系列复杂的生物化学反应，包括合成赤霉素、细胞生长素、细胞分裂素等内源性激素，这些内源性植物激素能够调节细胞中α-淀粉酶、果胶甲酯酶等酶的合成和运输，从而打破细胞只增殖不分化的生长状态，促进种胚的萌发，提高种胚的萌发能力。L-鸟氨酸是存在于生物体多种组织和细胞中的非蛋白质氨基酸，具有诱导内源性生长激素分泌，促进细胞增殖、促进蛋白质合成及糖与脂肪的分解代谢、提高免疫功能、抗癌等生物活性，在生物体的生长代谢中起重要的调节作用。在欧洲，L-鸟氨酸已作为膳食药物销售，日本则将L-鸟氨酸作为食品调料看待。植物种胚是植物繁殖的起始器官。一个种胚在适宜条件下萌动、膨大，形成一个原球茎；原球茎在人工控制条件下增殖，获得的增殖物叫类原球茎，一个原球茎增殖扩培后可以得到许多类原球茎；类原球茎具有细胞全能性，在适宜条件下既可以分化为植株，也可以萌发长出芽体，因为这芽体来源于种胚，所以称之胚芽或原球茎芽。植物胚芽不仅含有比植株更高的功能营养，如豌豆芽能降血糖、大麦芽能治消化不良，而且可以发育成完整植株。可见，通过低温、L-鸟氨酸等诱导子的应用，将为濒危植物资源的保护与利用提供新途径，这方面的技术目前尚未见报道。

发明内容

为了解决现有米斛资源难以满足市场需要，人工栽培中存在种苗缺乏、种苗诱导需要外源激素，种苗诱导时间长等问题。

本发明首先通过低温诱导子联合弱光诱导米斛种胚萌动形成米斛原球茎，再通过光照联合L-鸟氨酸诱导米斛原球茎增殖形成大量的米斛类原球茎，然后通过低温联合L-鸟氨酸诱导米斛类原球茎萌芽形成米斛原球茎芽，实现米斛原球茎芽的发生，不仅可以为米斛类药品及保健品的研发提供生料，而且可以为米斛的人工栽培生产提供种苗资源。

一种促进米斛原球茎芽发生的方法的具体操作步骤如下：

（1）米斛原球茎的诱导；取成熟的米斛果实，首先用1 g/100mL的升汞水溶液进行表面消毒30 min，接着用无菌蒸馏水冲洗3～5次，然后切开果实，取出种胚，再将种胚接种在固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1000～1500 Lx、每天光照12小时的条件下培养20～25天，得到绿色的米斛原球茎；

（2）米斛原球茎的增殖；将绿色的米斛原球茎接种于含有L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度2000～2500 Lx、每天光照12小时的条件下培养30～35天，得到米斛类原球茎；

（3）米斛类原球茎的适应性培养；选择颜色深绿、直径为5～8 mm的米斛类原球茎，接种于含有L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、黑暗条件下培养3～5天，得到米斛类原球茎适应性培养物；

（4）米斛原球茎芽的诱导；将米斛类原球茎适应性培养物置于温度2±1 ℃、黑暗的环境中24小时，得到类原球茎低温处理物；将类原球茎低温处理物接种于含有L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1000～1500 Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养25～30天，得到原球茎芽A；将原球茎芽A置于温度2±1 ℃、黑暗的环境中24小时，得到原球茎芽A低温处理物；将原球茎芽A低温处理物接种于含有L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1000～1500 Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养25～30天，即可得到米斛原球茎芽；所得米斛原球茎芽每棵鲜重80-200mg；直立的茎高20-35mm，茎粗1-3mm；茎上轮生有2-5片锥形叶，叶长3-10mm，叶径最宽处2-3mm，叶片绿色且表面光滑；茎底部有1-4条乳白色须根，根长1-5mm。

步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）中所述的含有L-鸟氨酸的固体MS培养基为每升培养基中含1.0～1.2 g L-鸟氨酸的固体MS培养基。

步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）中所述接种的接种量均为每45～50 mL含有L-鸟氨酸的固体MS培养基中接种5～10 g被培养物。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果体现在以下方面：

（1）本发明先通过低温诱导子联合弱光诱导米斛种胚萌动形成米斛原球茎，再通过米斛原球茎增殖得到米斛类原球茎，与通过米斛种胚诱导无菌试管苗再获得米斛类原球茎相比，生产周期从7～9个月缩短至3～4个月；

（2）本发明通过低温诱导子联合L-鸟氨酸诱导米斛类原球茎萌芽生成米斛原球茎胚芽，不仅避免了外源激素通过原球茎芽富集到米斛植株中而危害人体健康，而且米斛原球茎芽产量高，每克类原球茎可以诱导生成150～200棵米斛原球茎芽；

（3）本发明工艺简单、经济可行，通过本发明获得的米斛原球茎芽既可作为米斛类药品及保健品研发的直接原料；又可作为种苗进行人工栽培，为米斛的人工栽培生产提供种苗资源。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，对本发明作进一步地说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但这些示例性的实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。

以下实施例所用原料的来源说明如下：成熟的米斛果实购买于霍山县长冲中药材开发有限公司；L-鸟氨酸购买于南京泽朗医药科技有限公司；配制培养基所用化学试剂为国产分析纯。

实施例1：

一种促进米斛原球茎芽发生的方法包括以下操作步骤：

步骤1、米斛原球茎的诱导

取成熟的米斛果实，首先用1 g/100mL的升汞水溶液进行表面消毒30 min，接着用无菌蒸馏水冲洗3次，然后切开果实，取出种胚，再将种胚接种在固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1500 Lx、每天光照12小时的条件下培养20天，得到绿色的米斛原球茎；

步骤2、米斛原球茎的增殖

将绿色的米斛原球茎5g接种于45 mL新鲜的含有45 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度2500 Lx、每天光照12小时的条件下培养30天，得到米斛类原球茎；

步骤3、米斛类原球茎的适应性培养；

选择颜色深绿、直径为5 mm的米斛类原球茎5g，接种于45 mL含有45 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、黑暗条件下培养5 天，得到米斛类原球茎适应性培养物；

步骤4、米斛原球茎芽的诱导

取米斛类原球茎适应性培养物，置于温度2±1 ℃、黑暗的环境中24小时，得到类原球茎低温处理物；取类原球茎低温处理物，接种于45 mL含有45 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1500 Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养30天，得到原球茎芽A；再取原球茎芽A，置于温度2±1 ℃、黑暗的环境中24小时，得到原球茎芽A低温处理物；将原球茎芽A低温处理物，接种于45 mL含有45 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1500 Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养30天，得到米斛原球茎芽1016棵；所得米斛原球茎芽每棵鲜重150-200mg；直立的茎高25-35mm，茎粗2-3mm；茎上轮生有2-5片锥形叶，叶长5-10mm，叶径最宽处2-3mm，叶片绿色且表面光滑；茎底部有2-4条乳白色须根，根长2-5mm。

实施例2：

一种促进米斛原球茎芽发生的方法包括以下操作步骤：

步骤1、米斛原球茎的诱导

取成熟的米斛果实，首先用1 g/100mL的升汞水溶液进行表面消毒30 min，接着用无菌蒸馏水冲洗5次，然后切开果实，取出种胚，再将种胚接种在固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1000 Lx、每天光照12小时的条件下培养25天，得到绿色的米斛原球茎；

步骤2、米斛原球茎的增殖

将绿色的米斛原球茎10g接种于50 mL新鲜的含有60 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度2000 Lx、每天光照12小时的条件下培养35天，得到米斛类原球茎；

步骤3、米斛类原球茎的适应性培养

选择颜色深绿、直径为8 mm的米斛类原球茎10g，接种于50 mL含有60 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、黑暗条件下培养3 天，得到米斛类原球茎适应性培养物；

步骤4、米斛原球茎芽的诱导

取米斛类原球茎适应性培养物，置于温度2±1 ℃、黑暗的环境中24小时，得到类原球茎低温处理物；将类原球茎低温处理物接种于50 mL含有60 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1000 Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养25天，得到原球茎芽A；再取原球茎芽A，置于温度2±1 ℃、黑暗的环境中24小时，得到原球茎芽A低温处理物；取原球茎芽A低温处理物，接种于50 mL含有60 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1000 Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养25天，得到米斛原球茎芽1513棵；所得米斛原球茎芽每棵鲜重80-200mg；直立的茎高20-30mm，茎粗1-2mm；茎上轮生有2-3片锥形叶，叶长3-6mm，叶径最宽处2-3mm，叶片绿色且表面光滑；茎底部有1-3条乳白色须根，根长1-3mm。

实施例3：

一种促进米斛原球茎芽发生的方法包括以下操作步骤：

步骤1、米斛原球茎的诱导

取成熟的米斛果实，首先用1g/100mL的升汞水溶液进行表面消毒30 min，接着用无菌蒸馏水冲洗4次，然后切开果实，取出种胚，再将种胚接种在固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1200 Lx、每天光照12小时的条件下培养23天，得到绿色的米斛原球茎；

步骤2、米斛原球茎的增殖

将绿色的米斛原球茎8g接种于50 mL新鲜的含有55 mg L-鸟氨酸固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度2300 Lx、每天光照12小时的条件下培养35天，得到米斛类原球茎；

步骤3、米斛类原球茎的适应性培养

选择颜色深绿、直径为6 mm的米斛类原球茎8g，接种于50 mL含有55 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、黑暗条件下培养4 天，得到米斛类原球茎适应性培养物；

步骤4、米斛原球茎芽的诱导

取米斛类原球茎适应性培养物，置于温度2±1 ℃、黑暗的环境中24小时，得到类原球茎低温处理物；将类原球茎低温处理物，接种于50 mL含有55 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1200 Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养28天，得到原球茎芽A；再取原球茎芽A，置于温度2±1 ℃、黑暗的环境中24小时，得到原球茎芽A低温处理物；将原球茎芽A低温处理物，接种于50 mL含有55 mg L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2 ℃、光照强度1200 Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养28天，得到米斛原球茎芽1348棵；所得米斛原球茎芽每棵鲜重110-160mg；直立的茎高22-31mm，茎粗1-3mm；茎上轮生有2-5片锥形叶，叶长3-10mm，叶径最宽处2-3mm，叶片绿色且表面光滑；茎底部有2-4条乳白色须根，根长2-5mm。

Claims (3)

1.一种促进米斛原球茎芽发生的方法，其特征在于：首先通过低温联合弱光诱导米斛种胚萌动形成米斛原球茎，然后通过光照联合L-鸟氨酸诱导米斛原球茎增殖形成大量的米斛类原球茎，最后通过低温联合L-鸟氨酸诱导米斛类原球茎萌芽形成米斛原球茎芽；

具体的操作步骤如下：

(1)米斛原球茎的诱导：取成熟的米斛果实，首先用1g/100mL的升汞水溶液进行表面消毒30min，接着用无菌蒸馏水冲洗3～5次，然后切开果实，取出种胚，再将种胚接种在固体MS培养基上，在温度21±2℃、光照强度1000～1500Lx、每天光照12小时的条件下培养20～25天，得到绿色的米斛原球茎；

(2)米斛原球茎的增殖：将绿色的米斛原球茎接种于仅含有L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2℃、光照强度2000～2500Lx、每天光照12小时的条件下培养30～35天，得到米斛类原球茎；

(3)米斛类原球茎的适应性培养：选择颜色深绿、直径为5～8mm的米斛类原球茎，接种于仅含有L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2℃、黑暗条件下培养3～5天，得到米斛类原球茎适应性培养物；

(4)米斛原球茎芽的诱导：将米斛类原球茎适应性培养物置于温度2±1℃、黑暗的环境中24小时，得到类原球茎低温处理物；将类原球茎低温处理物接种于仅含有L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2℃、光照强度1000～1500Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养25～30天，得到原球茎芽A；将原球茎芽A置于温度2±1℃、黑暗的环境中24小时，得到原球茎芽A低温处理物；将原球茎芽A低温处理物接种于仅含有L-鸟氨酸的固体MS培养基上，在温度21±2℃、光照强度1000～1500Lx、每天光照12小时的条件下诱导培养25～30天，即可得到米斛原球茎芽；所得米斛原球茎芽每棵鲜重80-200mg；直立的茎高20-35mm，茎粗1-3mm；茎上轮生有2-5片锥形叶，叶长3-10mm，叶径最宽处2-3mm，叶片绿色且表面光滑；茎底部有1-4条乳白色须根，根长1-5mm。

2.根据权利要求1所述的一种促进米斛原球茎芽发生的方法，其特征在于：步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中所述的仅含有L-鸟氨酸的固体MS培养基为每升培养基中含1.0～1.2g/L-鸟氨酸的固体MS培养基。

3.根据权利要求1所述的一种促进米斛原球茎芽发生的方法，其特征在于：步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中所述接种的接种量均为每45～50mL仅含有L-鸟氨酸的固体MS培养基中接种5～10g被培养物。