CN103651120A - 束花石斛组培快繁生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种束花石斛高效组培快繁生产方法，属于中药材组培技术领域。本发明实现束花石斛高效组培快繁生产，生产周期短、成本低，可规模化生产种苗，种苗经练苗后移栽成活率达95%以上，便于工业化生产应用。通过本发明培育出来的束花石斛种苗繁殖快速，有效成分（石斛多糖）含量与功效与野生野生型束花石斛相似，且相对稳定，解决了自然条件下束花石斛繁殖缓慢而使得生产中资源匮乏的问题，对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用具有十分积极的影响。
Description
技术领域
本发明属于中药材组培技术领域，涉及一种束花石斛高效组培快繁生产方法。
背景技术
石斛，兰科植物之一，在我国主要分布于西南、华南、台湾等地，对人体具有曲解虚热、益精强阴等疗效，药用价值已被世人所认可，并被广泛使用。石斛始载于《神农本草经》，记载：“味甘、平，无毒；治伤中，除痹，下气，补五脏虚劳，赢瘦，强阴；久服厚肠胃，轻身，延年，长肌肉，逐皮肤邪热，定志除惊等”。《本草纲目拾遗》（清·赵学敏）：“清胃除虚热，生津，已劳损，以之代茶，开胃健脾，定惊疗风，能镇炎痰，解暑，甘芳降气等”。
石斛属为兰科比较大的属之一，全球约有1000余种，我国有石斛属植物共74种2变种，其中有药用价值且能进行商品流通的有50余种，如束花石斛、铁皮石斛、金钗石斛等。束花石斛（Dendrobium chrysanthum Wall．exLindl）是《中华人民共和国药典》收载入药的石斛中药材之一，味淡、性微寒，有滋阴养胃、清热解毒的功效，在临床上多用于治疗慢性咽喉炎、眼科疾病、血栓闭塞性疾病，效果十分明显，在我国主要分布云南、广西、贵州等省。
束花石斛是脉络宁、通塞脉片、石斛液光丸等著名中成药的主要原料之一，为我国常用的传统中药植物，国内外需求量大。由于近年来过量挖采，野生资源已经濒临灭绝而成为稀缺药材，而该植物的生长周期较长，产量远远不能满足药用制品和保健品生产需求，供需矛盾较突出。因此，只有通过组培快繁技术，大量繁育种苗，发展人工栽培生产，才能满足市场需求。
从20世纪70年代开始，我国科学家开始对石斛的组织培养育苗和人工栽培做了大量研究，并于80年代，实现铁皮石斛组培苗的工厂化生产，成功将技术研究推向实际应用。采用工厂化快繁种苗不仅保护了这一珍稀野生资源，还持续为相关制药厂和保健品生产厂家提供了原材料，缓解国内市场供需矛盾。而目前对于束花石斛的组培繁殖研究较少。史永锋等（束花石斛快繁育苗技术的研究），中草药，第36卷第3期，2005年3月）为寻找束花石斛快繁育苗的有效途径，采用组织培养和野生自然栖息的束花石斛诱导高位腋芽萌发等途径进行探索，最后得出结论：在组织培养中，改良1/2MS培养基德圆球茎形成效果最好，调整不同溶度的N、P、K及外援激素对诱导束花石斛圆球增殖、生根壮苗极为明显；外援激素对诱导束花石斛的高位腋芽萌发无明显效果，高位芽萌发与茎株胜利年龄和营养状况有关。这些研究为束花石斛组培繁殖产业化奠定了科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种束花石斛高效组培快繁生产方法，本方法不仅可以进行工厂化生产以满足市场需求，而且用该方法培育出来的束花石斛性能相对稳定，食用安全，有效成分（石斛多糖）含量与功效与野生型束花石斛相似，间接保护了野生资源。
为实现所述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种束花石斛组培快繁生产方法，包括如下步骤：
（1）将野生束花石斛植株引种在苗圃内，于花期进行人工授粉，授粉后果实成熟，将果实作为外植体。
（2）将选取的果实经外表灭菌处理后，取出内部的种胚，均匀撒播到萌芽培养基上，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25-30天后，种子萌发形成圆球茎。
（3）将步骤（2）中形成的圆球茎转接到分化培养基中，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25-30天后，圆球茎分化形成带芽的芽苗。
（4）将步骤（3）中形成的芽苗转接到壮苗培养基中，在温度25±2℃、光照强度2000-3000Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25-30天后，可培养出3cm高的大苗。
（5）将步骤（4）中培养出来的大苗转接到生根培养基中，在温度25±2℃、光照强度2000-3000Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25-30天后，可培养出5cm高以上根系发达的完整大苗。
（6）将步骤（5）中培养出来的健壮大苗转移至温室大棚内练苗15-20天，然后清洗组培苗根部的培养基，用0.25-0.5%多菌灵溶液浸7-10min后移栽至苗圃的基质中。
所述萌芽培养基为MS+马铃薯汁100g/L+AC1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂5.0g/L，pH为5.2-5.4。
所述分化培养基为MS+马铃薯汁200g/L+AC1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.0g/L，pH为5.2-5.4。
所述壮苗培养基为MS+香蕉汁100g/L+AC1.0g/L+活性炭1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂5.0g/L，pH为5.2-5.4。
所述生根培养基为1/2MS+NAA0.5-1.0g/L+活性炭0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.0g/L，pH为5.2-5.4。
所述步骤（2）的灭菌处理是将外植体用流动的自来水下冲洗干净后，置于超净工作台上用体积分数70-80%的酒精浸泡30-60s，再用0.1%的氯化汞消毒10-15min，然后取出用无菌水漂洗5次。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和积极效果：
（1）本发明实现束花石斛高效组培快繁生产，生产周期短、成本低，可规模化生产种苗，种苗经练苗后移栽成活率达95%以上，便于工业化生产应用。
（2）本发明方法采用束花石斛种子为外植体，在种子萌芽和圆球茎培养过程不使用激素，避免了衰退、变异等问题的发生，有利于保持种苗的优良形状，提高种苗使用的安全性。
（3）通过本发明培育出来的束花石斛种苗繁殖快速，有效成分（石斛多糖）含量与功效与野生野生型束花石斛相似，且相对稳定，解决了自然条件下束花石斛繁殖缓慢而使得生产中资源匮乏的问题，对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用具有十分积极的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，本实施例仅是对本发明作更清楚的说明，而不是对本发明的限制。
1、培养基配制
实施例1：萌芽培养基：以MS为基本培养基，每升添加马铃薯汁100g/L、AC1.0g/L、蔗糖30g/L、琼脂5.0g/L，pH调节至5.2-5.4；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，加盖；将加入培养基的培养瓶放入高压灭菌锅内于121℃、105kPa条件下灭菌20min；灭菌后取出，冷却备用。
实施例2：分化培养基：以MS为基本培养基，每升添加马铃薯汁200g/L、AC1.0g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.0g/L，pH调节至5.2-5.4；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，加盖；将加入培养基的培养瓶放入高压灭菌锅内于121℃、105kPa条件下灭菌20min；灭菌后取出，冷却备用。
实施例3：壮苗培养基：以MS为基本培养基，每升添加香蕉汁100g/L、AC1.0g/L、活性炭1.0g/L、蔗糖30g/L、琼脂5.0g/L，pH调节至5.2-5.4；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，加盖；将加入培养基的培养瓶放入高压灭菌锅内于121℃、105kPa条件下灭菌20min；灭菌后取出，冷却备用。
实施例4：生根培养基：以1/2MS为基本培养基，每升添加NAA0.5-1.0g/L、活性炭0.5g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.0g/L，pH调节至5.2-5.4；将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，加盖；将加入培养基的培养瓶放入高压灭菌锅内于121℃、105kPa条件下灭菌20min；灭菌后取出，冷却备用。
2、生产实施例
实施例5
本发明一种束花石斛组培快繁生产方法，包括如下步骤：
（1）将在野外原生产地采摘回来的野生束花石斛植株引种在苗圃内，于花期进行人工授粉，授粉后果实成熟，将果实作为外植体。
（2）将选取的外植体果实用流动的自来水下冲洗干净后，置于超净工作台上用体积分数75%的酒精浸泡60s，再用0.1%的氯化汞消毒10min，然后取出用无菌水漂洗5次；用无菌滤纸吸干果实表面的水分后剖开果实，取出内部的种胚，均匀撒播到萌芽培养基（实施例1）上，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养28天后，种子萌发形成圆球茎。
（3）将步骤（2）中形成的圆球茎转接到分化培养基（实施例2）中，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养30天后，圆球茎分化形成带芽的芽苗。
（4）将步骤（3）中形成的芽苗转接到壮苗培养基（实施例3）中，在温度25±2℃、光照强度2000-3000Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25天后，可培养出3cm高的大苗。
（5）将步骤（4）中培养出来的大苗转接到生根培养基（实施例4）中，在温度25±2℃、光照强度2000-3000Lx、光照时间12h/d的条件下，培养26天后，可培养出5cm高以上根系发达的完整大苗。
（6）将步骤（5）中培养出来的健壮大苗转移至温室大棚内练苗16天，然后清洗组培苗根部的培养基，用0.3%多菌灵溶液浸8min后移栽至苗圃的基质中。
本方法种苗经练苗后移栽成活率为95.31%。
实施例6
本发明一种束花石斛组培快繁生产方法，包括如下步骤：
（1）将在野外原生产地采摘回来的野生束花石斛植株引种在苗圃内，于花期进行人工授粉，授粉后果实成熟，将果实作为外植体。
（2）将选取的外植体果实用流动的自来水下冲洗干净后，置于超净工作台上用体积分数80%的酒精浸泡40s，再用0.1%的氯化汞消毒10min，然后取出用无菌水漂洗5次；用无菌滤纸吸干果实表面的水分后剖开果实，取出内部的种胚，均匀撒播到萌芽培养基（实施例1）上，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25天后，种子萌发形成圆球茎。
（3）将步骤（2）中形成的圆球茎转接到分化培养基（实施例2）中，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养28天后，圆球茎分化形成带芽的芽苗。
（4）将步骤（3）中形成的芽苗转接到壮苗培养基（实施例3）中，在温度25±2℃、光照强度2000-3000Lx、光照时间12h/d的条件下，培养30天后，可培养出3cm高的大苗。
（5）将步骤（4）中培养出来的大苗转接到生根培养基（实施例4）中，在温度25±2℃、光照强度2000-3000Lx、光照时间12h/d的条件下，培养30天后，可培养出5cm高以上根系发达的完整大苗。
（6）将步骤（5）中培养出来的健壮大苗转移至温室大棚内练苗20天，然后清洗组培苗根部的培养基，用0.35%多菌灵溶液浸10min后移栽至苗圃的基质中。
本方法种苗经练苗后移栽成活率为96.54%。
实施例7
本发明一种束花石斛组培快繁生产方法，包括如下步骤：
（1）将在野外原生产地采摘回来的野生束花石斛植株引种在苗圃内，于花期进行人工授粉，授粉后果实成熟，将果实作为外植体。
（2）将选取的外植体果实用流动的自来水下冲洗干净后，置于超净工作台上用体积分数70%的酒精浸泡50s，再用0.1%的氯化汞消毒12min，然后取出用无菌水漂洗5次；用无菌滤纸吸干果实表面的水分后剖开果实，取出内部的种胚，均匀撒播到萌芽培养基（实施例1）上，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养30天后，种子萌发形成圆球茎。
（3）将步骤（2）中形成的圆球茎转接到分化培养基（实施例2）中，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养26天后，圆球茎分化形成带芽的芽苗。
（4）将步骤（3）中形成的芽苗转接到壮苗培养基（实施例3）中，在温度25±2℃、光照强度2000-3000Lx、光照时间12h/d的条件下，培养28天后，可培养出3cm高的大苗。
（5）将步骤（4）中培养出来的大苗转接到生根培养基（实施例4）中，在温度25±2℃、光照强度2000-3000Lx、光照时间12h/d的条件下，培养28天后，可培养出5cm高以上根系发达的完整大苗。
（6）将步骤（5）中培养出来的健壮大苗转移至温室大棚内练苗18天，然后清洗组培苗根部的培养基，用0.4%多菌灵溶液浸7min后移栽至苗圃的基质中。
本方法种苗经练苗后移栽成活率为96.07%。
Claims (6)
1.一种束花石斛组培快繁生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将野生束花石斛植株引种在苗圃内，于花期进行人工授粉，授粉后果实成熟，将果实作为外植体；
（2）将选取的果实经外表灭菌处理后，取出内部的种胚，均匀撒播到萌芽培养基上，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25-30天后，种子萌发形成圆球茎；
（3）将步骤（2）中形成的圆球茎转接到分化培养基中，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25-30天后，圆球茎分化形成带芽的芽苗；
（4）将步骤（3）中形成的芽苗转接到壮苗培养基中，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25-30天后，可培养出3cm高的大苗；
（5）将步骤（4）中培养出来的大苗转接到生根培养基中，在温度25±2℃、光照强度1800-2500Lx、光照时间12h/d的条件下，培养25-30天后，可培养出5cm高以上根系发达的完整大苗；
（6）将步骤（5）中培养出来的健壮大苗转移至温室大棚内练苗15-20天，然后清洗组培苗根部的培养基，用0.25-0.5%多菌灵溶液浸7-10min后移栽至苗圃的基质中。
2.根据权利要求1所述的束花石斛组培快繁生产方法，其特征在于，所述萌芽培养基为MS+马铃薯汁100g/L+AC1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂5.0g/L，pH为5.2-5.4。
3.根据权利要求1所述的束花石斛组培快繁生产方法，其特征在于，所述分化培养基为MS+马铃薯汁200g/L+AC1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.0g/L，pH为5.2-5.4。
4.根据权利要求1所述的束花石斛组培快繁生产方法，其特征在于，所述壮苗培养基为MS+香蕉汁100g/L+AC1.0g/L+活性炭1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂5.0g/L，pH为5.2-5.4。
5.根据权利要求1所述的束花石斛组培快繁生产方法，其特征在于，所述生根培养基为1/2MS+NAA0.5-1.0g/L+活性炭0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂5.0g/L，pH为5.2-5.4。
6.根据权利要求1所述的束花石斛组培快繁生产方法，其特征在于，所述步骤（2）的灭菌处理是将外植体用流动的自来水下冲洗干净后，置于超净工作台上用体积分数70-80%的酒精浸泡30-60s，再用0.1%的氯化汞消毒10-15min，然后取出用无菌水漂洗5次。
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| CN104054569A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-09-24 | 霍山宝信园石斛开发有限公司 | 一种野生铁皮石斛的选种培育方法 |
| CN104054575A (zh) * | 2014-05-30 | 2014-09-24 | 霍山宝信园石斛开发有限公司 | 一种野生米斛的选种培育方法 |
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