CN105104190B - 金线莲组织培养成苗方法 - Google Patents
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Abstract
一种金线莲组织培养成苗方法，主要包括：A、培养基准备，该步骤包括配制和灭菌两步；B、接种，在无菌条件下将经预处理的外植体去叶，每一外植体剪取带一个节的基部茎段，接种于准备好的培养基上；C、培养，包括避光培养和光照培养；以番薯泥配合花宝1号、花宝4号和花宝5号，经合理配比制成培养基，促进金线莲幼苗的诱导与的生长，幼苗在培养瓶中无需再进行转接，操作步骤减少，人工成本降低，污染率降低，成苗率高，15天内开始长芽，1个月开始生根，4个月后培养成正常组培苗，成苗率为94％以上，移栽2个月后统计成活率达97％以上，缩短了金线莲种苗生产周期，有利于快速育苗。
Description
技术领域
本发明涉及金线莲栽培技术领域，特别涉及一种金线莲组织培养成苗方法。
背景技术
金线莲为兰科开唇植物花叶兰属多年生珍稀中草药。民间使用范围较广，具有治疗百病之功效，素有″药王″、″金草″、″神药″、″鸟人参″等美称，被誉为南方的冬虫夏草，乃稀有野生山珍极品，价值非凡。自大唐列为贡品入朝，为历代皇宫专用御品。
《本草纲目》、《中华本草》、《本草拾遗》、《中药大辞典》、《福建药物志》、《中国经济植物志》、《浙南本草新编》等著名典籍均有金线莲的记载。金线莲富含多种黄铜、氨基酸、牛磺酸、甾醇、多糖、强心苷、微量元素等。
人们生活水平的不断提高及保健意识不断增强，随着金线莲的营养成分不断被发现，市场需求量正以相同的比例上升，金线莲处于供不应求状态。且因市场金线莲货源短缺，国家大力提倡人工培育种植业和开发金线莲。
近些年，随着金线莲的药用价值不断被挖掘，其市场需求量迅速增加，但由于金线莲在自然状态下极难繁殖且生长缓慢，很难满足日益增大的市场需求。
由于组织培养具有环境因子可人工控制，繁殖周期短、速度快，可周年进行生产，节省生产材料，同时还具有保持植物原有优良性状等优势，所以被广泛采用于很多植物种苗的工厂化繁育，取得了巨大的的经济效益。经过多年的组织培养实践，金线莲组培快繁技术亦日趋发展，但现阶段关于组培技术主要集中在提高不定芽诱导率和芽增殖系数等，仍存在培养时间较长、成本较高，金线莲的产量一直跟不上市场的需求。
发明内容
基于此，有必要提供一种培养成本低、简便快捷、成苗率高的金线莲组织培养成苗方法。
一种金线莲组织培养成苗方法，包括：
A、培养基准备，包括配制和灭菌，其中
配制，以MS为基本培养基，每升添加活性炭2～4g、蛋白胨1～3g、番薯泥120～160g、琼脂6～7g、蔗糖20～30g、花宝1号0.8～0.9g、花宝4号0.1～0.3g和花宝5号0.2～0.3g为原料进行配制，配制过程为，按上述原料称量活性炭、蔗糖和番薯泥加入富硒纯净水并拌匀加热至沸腾，停止加热后称量加入MS母液、蛋白胨、琼脂、花宝1号、花宝4号和花宝5号，混合后的培养基的pH值调节至5.6，待琼脂完全溶解，趁热分装于培养瓶，富硒纯净水为自深井富硒井水取得，经过滤沉淀后制得；
灭菌，将分装有培养基的培养瓶置于120～125℃、140～160kPa的高温高压环境中灭菌15～20min，灭菌后取出培养瓶，冷却备用；
B、接种，在无菌条件下将经预处理的外植体去叶，每一外植体剪取带一个节的基部茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接8～10个所述基部茎段，每个基部茎段长度为1～2cm；
C、培养，包括避光培养和光照培养，其中
避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为25±2℃、湿度为50％以下的避光环境中诱导丛生芽，避光培养时间为15±2天；
光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为25±2℃培养室进行光照，光照时间12～14h/天，光照强度为1200～15001x，培养时间四个月左右，培养期间每两个月对培养室进行消毒处理。
在其中一个实施例中，所述步骤A中，所述培养基以MS为基本培养基，每升添加活性炭3g、蛋白胨2g、番薯泥150g、琼脂6.5g、蔗糖25g、花宝1号0.8g、花宝4号0.3g和花宝5号0.2g为原料进行配制。
在其中一个实施例中，所述步骤A中，所述培养基以MS为基本培养基，每升添加活性炭3g、蛋白胨2g、番薯泥150g、琼脂6.5g、蔗糖25g、花宝1号0.9g、花宝4号0.1g和花宝5号0.3g为原料进行配制。
在其中一个实施例中，所述步骤B中，所述经预处理的外植体，预处理过程为：
选种，选择自然生长、无病虫害的健壮野生金线莲植株，移入洁净棚内培养6～8天，以去除杂菌；
清洗，将培养后的植株取出，以流水冲洗，去除表面附着物；
脱毒，将清洗后的植株浸泡于0.1％升汞溶液中1min，再以无菌水冲洗3-5遍，以对植株进行脱毒处理备用。
在其中一个实施例中，所述番薯泥为富硒沙土所栽种的番薯的新鲜块状根粉碎成泥制得。
在上述金线莲组织培养成苗方法中，以番薯泥配合花宝1号、花宝4号和花宝5号，经合理配比制成培养基，促进金线莲幼苗的诱导与的生长，幼苗在培养瓶中无需再进行转接，操作步骤减少，人工成本降低，污染率降低，成苗率高，15天内开始长芽，1个月开始生根，4个月后培养成正常组培苗，成苗率为94％以上，移栽2个月后统计成活率达97％以上，缩短了金线莲种苗生产周期，有利于快速育苗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以更好地理解本发明的技术方案，并不用于限定本发明。
一种金线莲组织培养成苗方法，包括：
A、培养基准备，包括配制和灭菌，其中
配制，以MS为基本培养基，每升添加活性炭2～4g、蛋白胨1～3g、番薯泥120～160g、琼脂6～7g、蔗糖20～30g、花宝1号0.8～0.9g、花宝4号0.1～0.3g和花宝5号0.2～0.3g为原料进行配制。
配制过程为，按上述原料称量活性炭、蔗糖和番薯泥加入富硒纯净水并拌匀加热至沸腾，停止加热后称量加入MS母液、蛋白胨、琼脂、花宝1号、花宝4号和花宝5号，混合后的培养基的pH值调节至5.6，待琼脂完全溶解，趁热分装于培养瓶，富硒纯净水为自深井富硒井水取得，经过滤沉淀后制得。
灭菌，将分装有培养基的培养瓶置于120～125℃、140～160kPa的高温高压环境中灭菌15～20min，灭菌后取出培养瓶，冷却备用。
B、接种，在无菌条件下将经预处理的外植体去叶，每一外植体剪取带一个节的基部茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接8～10个所述基部茎段，每个基部茎段长度为1～2cm。
C、培养，包括避光培养和光照培养，其中
避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为25±2℃、湿度为50％以下的避光环境中诱导丛生芽，避光培养时间为15±2天。
光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为25±2℃培养室进行光照，光照时间12～14h/天，光照强度为1200～15001x，培养时间四个月左右，培养期间每两个月对培养室进行消毒处理。
在上述金线莲组织培养成苗方法中，以番薯泥配合花宝1号、花宝4号和花宝5号，经合理配比制成培养基，促进金线莲幼苗的诱导与的生长，幼苗在培养瓶中无需再进行转接，操作步骤减少，人工成本降低，污染率降低，成苗率高，15天内开始长芽，1个月开始生根，4个月后培养成正常组培苗，成苗率为94％以上，移栽2个月后统计成活率达97％以上，缩短了金线莲种苗生产周期，有利于快速育苗。
在其中一个实施例中，所述番薯泥为富硒沙土所栽种的番薯的新鲜块状根粉碎成泥制得。
硒是一种微量元素，当土壤中的硒含量富集到大于0.4mg/kg时即为富硒土。硒是人体必需的微量元素和营养元素，具有提高人体免疫力、促进淋巴细胞增殖、抗体和免疫球蛋白合成等主要功能，被称为人体微量元素中的″抗癌之王″，对结肠癌、皮肤癌、肝癌、乳腺癌等具有明显抑制作用和防护作用。中国广东梅州等地广泛分布有富硒土，以其地所产的番薯，及取自其深井的富硒水为原料培养金线莲幼苗，幼苗存活率提高，且金线莲硒吸收率良好，经济价值大为提高。
在其中一个实施例中，所述步骤B中，所述经预处理的外植体，预处理过程为：
选种，选择自然生长、无病虫害的健壮野生金线莲植株，移入洁净棚内培养6～8天，以去除杂菌；
清洗，将培养后的植株取出，以流水冲洗，去除表面附着物；
脱毒，将清洗后的植株浸泡于0.1％升汞溶液中1min，再以无菌水冲洗3-5遍，以对植株进行脱毒处理备用。
下面以具体的实施例进行进一步详细说明：
实施例1
A、称取活性炭200g、蔗糖2000g和番薯泥16kg加入100L富硒纯净水并拌匀加热至沸腾，停止加热后加入MS母液，并称量加入蛋白胨100g、琼脂600g、花宝1号85g、花宝4号20g和花宝5号25g，混合后的培养基的pH值调节至5.6，待琼脂完全溶解，趁热分装于培养瓶。
灭菌，将分装有培养基的培养瓶置于120℃、160kPa的高温高压环境中灭菌15min，灭菌后取出培养瓶，冷却备用。
B、接种，选择自然生长、无病虫害的健壮野生金线莲植株，移入洁净棚内培养7天，将培养后的植株取出，以流水冲洗，去除表面附着物，将清洗后的植株浸泡于0.1％升汞溶液中1min，再以无菌水冲洗3-5遍，作为接种外植体，在无菌条件下将经预处理的外植体去叶，每一外植体剪取带一个节的基部茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接8个所述基部茎段，每个基部茎段长度为1～2cm。
C、培养，包括避光培养和光照培养，其中
避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为25±2℃、湿度为50％以下的避光环境中诱导丛生芽，避光培养时间为15±2天。
光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为25±2℃培养室进行光照，光照时间12h/天，光照强度为15001x，培养时间四个月。
实施例2
A、称取活性炭300g、蔗糖2500g和番薯泥15kg加入100L富硒纯净水并拌匀加热至沸腾，停止加热后加入MS母液，并称量加入蛋白胨200g、琼脂650g、花宝1号80g、花宝4号30g和花宝5号20g，混合后的培养基的pH值调节至5.6，待琼脂完全溶解，趁热分装于培养瓶。
灭菌，将分装有培养基的培养瓶置于123℃、150kPa的高温高压环境中灭菌18min，灭菌后取出培养瓶，冷却备用。
B、接种，选择自然生长、无病虫害的健壮野生金线莲植株，移入洁净棚内培养7天，将培养后的植株取出，以流水冲洗，去除表面附着物，将清洗后的植株浸泡于0.1％升汞溶液中1min，再以无菌水冲洗3-5遍，作为接种外植体，在无菌条件下将经预处理的外植体去叶，每一外植体剪取带一个节的基部茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接8个所述基部茎段，每个基部茎段长度为1～2cm。
C、培养，包括避光培养和光照培养，其中
避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为25±2℃、湿度为50％以下的避光环境中诱导丛生芽，避光培养时间为15±2天。
光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为25±2℃培养室进行光照，光照时间13h/天，光照强度为14001x，培养时间四个月。
实施例3
A、称取活性炭400g、蔗糖3000g和番薯泥12kg加入100L富硒纯净水并拌匀加热至沸腾，停止加热后加入MS母液，并称量加入蛋白胨300g、琼脂700g、花宝1号85g、花宝4号10g和花宝5号30g，混合后的培养基的pH值调节至5.6，待琼脂完全溶解，趁热分装于培养瓶。
灭菌，将分装有培养基的培养瓶置于125℃、140kPa的高温高压环境中灭菌20min，灭菌后取出培养瓶，冷却备用。
B、接种，选择自然生长、无病虫害的健壮野生金线莲植株，移入洁净棚内培养7天，将培养后的植株取出，以流水冲洗，去除表面附着物，将清洗后的植株浸泡于0.1％升汞溶液中1min，再以无菌水冲洗3-5遍，作为接种外植体，在无菌条件下将经预处理的外植体去叶，每一外植体剪取带一个节的基部茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接8个所述基部茎段，每个基部茎段长度为1～2cm。
C、培养，包括避光培养和光照培养，其中
避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为25±2℃、湿度为50％以下的避光环境中诱导丛生芽，避光培养时间为15±2天。
光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为25±2℃培养室进行光照，光照时间14h/天，光照强度为12001x，培养时间四个月。
实施例4
A、称取活性炭300g、蔗糖2500g和番薯泥15kg加入100L富硒纯净水并拌匀加热至沸腾，停止加热后加入MS母液，并称量加入蛋白胨200g、琼脂650g、花宝1号90g、花宝4号10g和花宝5号30g，混合后的培养基的pH值调节至5.6，待琼脂完全溶解，趁热分装于培养瓶。
灭菌，将分装有培养基的培养瓶置于120℃、160kPa的高温高压环境中灭菌15min，灭菌后取出培养瓶，冷却备用。
B、接种，选择自然生长、无病虫害的健壮野生金线莲植株，移入洁净棚内培养7天，将培养后的植株取出，以流水冲洗，去除表面附着物，将清洗后的植株浸泡于0.1％升汞溶液中1min，再以无菌水冲洗3-5遍，作为接种外植体，在无菌条件下将经预处理的外植体去叶，每一外植体剪取带一个节的基部茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接8个所述基部茎段，每个基部茎段长度为1～2cm。
C、培养，包括避光培养和光照培养，其中
避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为25±2℃、湿度为50％以下的避光环境中诱导丛生芽，避光培养时间为15±2天。
光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为25±2℃培养室进行光照，光照时间12h/天，光照强度为15001x，培养时间四个月。
下表为不同实施例培养金线莲组培苗情况表：
| 培养时间 | 苗高 | 顶叶长 | 污染率 | 移栽成活率 | |
| 实施例1 | 4个月 | 6.5 | 1.6 | 2.3％ | 94.6％ |
| 实施例2 | 4个月 | 6.7 | 1.7 | 2.0％ | 96.8％ |
| 实施例3 | 4个月 | 6.9 | 1.7 | 2.7％ | 94.9％ |
| 实施例4 | 4个月 | 6.4 | 1.5 | 3.1％ | 92.7％ |
通过以上实施例的数据表明，本方法的培养时间短，转接次数少，污染率低，自然成苗率高，得到的组培苗在苗高、生根数、叶片状态及出瓶综合状态较好，且成苗的组培苗移栽成活率高，并且1个月后移栽苗已经正常生长，发育良好，病虫害少，生长健壮。
以上所述实施方式仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为不脱离本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种金线莲组织培养成苗方法，其特征在于，包括：
A、培养基准备，包括配制和灭菌，其中
配制，以MS为基本培养基，每升添加活性炭2～4g、蛋白胨1～3g、番薯泥120～160g、琼脂6～7g、蔗糖20～30g、花宝1号0.8～0.9g、花宝4号0.1～0.3g和花宝5号0.2～0.3g为原料进行配制，配制过程为，按上述原料称量活性炭、蔗糖和番薯泥加入富硒纯净水并拌匀加热至沸腾，停止加热后称量加入MS母液、蛋白胨、琼脂、花宝1号、花宝4号和花宝5号，混合后的培养基的pH值调节至5.6，待琼脂完全溶解，趁热分装于培养瓶，富硒纯净水为自深井富硒井水取得，经过滤沉淀后制得；
灭菌，将分装有培养基的培养瓶置于120～125℃、140～160kPa的高温高压环境中灭菌15～20min，灭菌后取出培养瓶，冷却备用；
B、接种，在无菌条件下将经预处理的外植体去叶，每一外植体剪取带一个节的基部茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接8～10个所述基部茎段，每个基部茎段长度为1～2cm；
C、培养，包括避光培养和光照培养，其中
避光培养，将接好种的培养瓶置于温度为25±2℃、湿度为50％以下的避光环境中诱导丛生芽，避光培养时间为15±2天；
光照培养，将经避光培养的培养瓶移入温度为25±2℃培养室进行光照，光照时间12～14h/天，光照强度为1200～15001x，培养时间四个月左右，培养期间每两个月对培养室进行消毒处理。
2.根据权利要求1所述金线莲组织培养成苗方法，其特征在于：所述步骤A中，所述培养基以MS为基本培养基，每升添加活性炭3g、蛋白胨2g、番薯泥150g、琼脂6.5g、蔗糖25g、花宝1号0.8g、花宝4号0.3g和花宝5号0.2g为原料进行配制。
3.根据权利要求1所述金线莲组织培养成苗方法，其特征在于：所述步骤A中，所述培养基以MS为基本培养基，每升添加活性炭3g、蛋白胨2g、 番薯泥150g、琼脂6.5g、蔗糖25g、花宝1号0.9g、花宝4号0.1g和花宝5号0.3g为原料进行配制。
4.根据权利要求1所述金线莲组织培养成苗方法，其特征在于，所述步骤B中，所述经预处理的外植体，预处理过程为：
选种，选择自然生长、无病虫害的健壮野生金线莲植株，移入洁净棚内培养6～8天，以去除杂菌；
清洗，将培养后的植株取出，以流水冲洗，去除表面附着物；
脱毒，将清洗后的植株浸泡于0.1％升汞溶液中1min，再以无菌水冲洗3-5遍，以对植株进行脱毒处理备用。
5.根据权利要求1～4任意一项所述金线莲组织培养成苗方法，其特征在于：所述番薯泥为富硒沙土所栽种的番薯的新鲜块状根粉碎成泥制得。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Jiangnan Road 514000 Guangdong city of Meizhou province Fucci Meijiang district (Meijiang IRS diagonally opposite) Guangdong huxingshan Biological Technology Co. Ltd. Applicant after: Hu Xingshan bio tech ltd, Guangdong Address before: Two, Guangdong, Meizhou province Lido Road, Li Ying Ying City, No. 514000, building 9 Applicant before: Hu Xingshan bio tech ltd, Guangdong |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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