CN103416305B - 金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法，包括以下四个组织培养阶段：①种子无菌萌发形成原球茎；②原球茎的增殖与小苗分化培养；③无菌苗壮苗培养；④生根培养，不同的组织培养阶段采用不同的无激素培养基。本发明操作简便、程序少、费用低廉，不需要对组培苗进行频繁继代，且在整个培养过程中不使用外源植物激素，较好地解决了目前普遍存在于金线莲组织培养过程中的大量使用外源植物激素、生产成本高、种苗参差不一及食用不安全等问题，不仅大大提高了种苗质量和移栽成活率，而且提高了种苗使用的安全性。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及一种金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法。
背景技术
金线莲（Anoectochitus formosanus）是一种珍稀濒危中草药，属兰科开唇兰属花叶开唇兰的多年生草本植物，别名金线兰、金蚕等，我国医学书籍《本草求源》和《国药大药典》等均有记载，民间应用广泛。金线莲以全草入药，报道称应用于治疗各种常见疾病及疑难杂症。由于其治疗面广，疗效独特，被民间视为“神药”，台湾称之为“中药之王”，已被列入台湾二十九种需要保护的稀有植物之一，福建省也列为省级野生药材保护品种。
由于金线莲具有很好的药用价值，而其种子在自然条件下难以萌发，资源再生慢，加上长期无节制的采挖，资源濒临枯竭。为了更好地保护金线莲野生资源，应大力发展人工栽培，满足市场需求，保障金线莲资源的可持续利用。
金线莲种子极其细小，在自然界很难萌发，野生苗多依靠无性繁殖的方法繁殖后代。但是兰科植物的种子可以在无菌条件下萌发，经过原球茎阶段形成植株。据报道，金线莲每个蒴果内的种子量可达数万粒，使用种子繁殖组培苗较其他方法具有以下优势：有性繁殖可以获得数量巨大的可供遗传利用的植株，操作简便，成苗速度快，能满足快速繁殖种苗的需要。
目前关于金线莲的组织培养快繁种苗已发表相关研究报道和专利，但绝大部分的培养方法都添加了植物激素以促进植株的分化和生长，如“一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法”（申请号：200810059233.3）、“通过植物组织培养生产福建道地金线莲的方法”（申请号：201010513785.4）、“通过组织培养生产台湾金线莲的方法”（申请号：201010000762.3）及“一种金线莲的快繁方法”（授权公告号CN102090341B）（申请号：201010604313.X）等。外源植物激素的长期应用，不仅会导致组培苗的优良性状发生退化或变异，而金线莲作为具功能性的植物，外源激素的使用不利于人体健康。此外，相关方法中的组织培养操作复杂，成本高。
发明内容
为了解决现有技术所存在的上述问题，本发明提供了一种金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法，该培养方法操作简便、程序少、费用低廉，不需要对组培苗进行频繁继代，且在整个培养过程中不使用外源植物激素，较好地解决了目前普遍存在于金线莲组织培养过程中的大量使用外源植物激素、生产成本高、种苗参差不一及食用不安全等问题，不仅大大提高了种苗质量和移栽成活率，而且提高了种苗使用的安全性。
本发明技术方案是这样构成的：一种金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括以下四个组织培养阶段：
（1）种子无菌萌发形成原球茎：选择金线莲近成熟的蒴果，进行蒴果表面消毒灭菌处理后，将蒴果切开，取出种子均匀播种在无激素种子萌发培养基上，播种后的培养瓶置于温度20-28℃、无光照条件下培养诱导种子萌发，培养时间30-40天，使种子膨大、萌发形成白色或乳黄色的原球茎；所述无激素种子萌发培养基为：MS或N6基本培养基+土豆泥100-150g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
（2）原球茎的增殖与小苗分化培养：将第（1）阶段获得的原球茎转入无激素增殖与分化培养基中，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间8-12小时/天，培养时间60-90天，使原球茎增殖并分化形成带叶和茎的芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；所述的无激素增殖与分化培养基为：MS或N6基本培养基+土豆泥100-200g/L+番茄汁50-100g/L+蛋白胨1-3g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
（3）无菌苗壮苗培养：将第（2）阶段获得的已分化的芽或无菌苗转移进行1-2次的壮苗培养，每次壮苗培养由以下两个依次进行的培养周期组成：
第一个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基A中，培养时间30-50天，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间8-12小时/天；所述无激素壮苗培养基A为：MS或N6基本培养基+土豆泥100-150g/L+蛋白胨1-3g/L+活性炭0.5-2.0g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
第二个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基B中，培养时间30-50天，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间8-12小时/天；所述无激素壮苗培养基B为：MS或N6基本培养基+土豆泥50-100g/L+香蕉泥100-200g/L+活性炭0.5-2.0g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
第1次壮苗培养结束后，选择具有2片以上叶片且株高2cm以上的无菌壮苗进入第（4）阶段的生根培养，其余的弃用或者接着进行第2次壮苗培养；第2次壮苗培养结束后，选择具有2片以上叶片且株高2cm以上的无菌壮苗进入第（4）阶段的生根培养；
（4）生根培养：将第（3）阶段获得的无菌壮苗转入无激素生根培养基中，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间10-14小时/天，培养时间40-60天；所述无激素生根培养基为：MS或N6基本培养基+香蕉泥100-200g/L+土豆泥0-50g/L+活性炭1-2g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8。
较之现有技术而言，本发明所述的金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法具有以下优点：
（1）本发明的整套技术采用无外源植物激素培养，在培养基配置中不添加任何植物激素，并且根据不同培养时期的不同要求，用天然的土豆泥和香蕉泥做为营养成分，培养出的金线莲种苗比有激素培养出的种苗茁壮，且合格苗达100%，不再出现无效苗。因此，本发明不仅大大提高了种苗的质量、移栽成活率以及种苗使用的安全性，降低了生产成本，而且更加环保，符合目前绿色农业、食品安全的需求，有利于实现中草药的安全、绿色生产。
（2）本发明操作步骤简便，费用低，不需要对组培苗进行频繁继代培养，大大节省人力、物力，便于金线莲种苗的规模化、工业化生产。
（3）本发明利用种子进行有性繁殖，能够在一定时间内获得数量巨大的可供遗传利用的种苗，还能经过筛选获得大量的性状优良的植株，操作简便，成苗速度快，不仅能够有效地保护野生金线莲资源，同时还能够满足工业化生产种苗需要的连续性生产流程。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和实施例对本发明内容进行详细说明：
（一）具体实施方式
本发明体实施方式提供了一种金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括以下四个组织培养阶段：
（1）种子无菌萌发形成原球茎：选择金线莲近成熟的蒴果，进行蒴果表面消毒灭菌处理后，将蒴果切开，取出种子均匀播种在无激素种子萌发培养基上，播种后的培养瓶置于温度20-28℃、无光照条件下（即黑暗环境）培养诱导种子萌发，培养时间30-40天，使种子膨大、萌发形成白色或乳黄色的原球茎；所述无激素种子萌发培养基为：MS或N6基本培养基+土豆泥100-150g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8。
金线莲授粉后的蒴果发育与老化过程，其内部种胚要经历乳白色浆状变成金黄色丝状、黄色丝状、棕色直至褐色的丝状。人工栽培的金线莲优良株系于花期进行人工授粉和果实培育，上述培养阶段所选择的金线莲近成熟的蒴果指金线莲人工授粉后50-80天、饱满、硬实、无病虫危害且外表为红色或浅棕色的蒴果（此时，蒴果内部种胚为金黄色或黄色丝状），或者野生金线莲自然授粉后、饱满、硬实、无病虫危害且外表为红色或浅棕色的蒴果。
所述的蒴果表面消毒灭菌处理是将所选取的蒴果置于无菌超净工作台上，用浓度为60%-95%的酒精（通常采用市售的浓度为75%的酒精，但浓度在60%-95%之间的酒精都能起到较好的消毒效果）浸泡30-60秒后，取出转入浓度为8-15%的次氯酸钠溶液中消毒8-10分钟，接着取出转入无菌容器中用无菌水浸洗3-5次，最后取出用无菌纸吸干蒴果表面水分。
（2）原球茎的增殖与小苗分化培养：将第（1）阶段获得的原球茎转入无激素增殖与分化培养基中，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间8-12小时/天，培养时间60-90天，使原球茎增殖并分化形成带叶和茎的芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；所述的无激素增殖与分化培养基为：MS或N6基本培养基+土豆泥100-200g/L+番茄汁50-100g/L+蛋白胨1-3g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8。
该阶段的培养过程中，当培养到40-60天时，原球茎会迅速增殖、重叠堆积在无激素增殖与分化培养基上，并伴有叶原基出现；继续培养20-30天，原球茎分化形成带叶和茎的芽或具叶、茎及胚根的无菌苗。
（3）无菌苗壮苗培养：将第（2）阶段获得的已分化的芽或无菌苗转移进行1-2次的壮苗培养，每次壮苗培养由以下两个依次进行的培养周期组成：
第一个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基A中，培养时间30-50天，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间8-12小时/天；所述无激素壮苗培养基A为：MS或N6基本培养基+土豆泥100-150g/L+蛋白胨1-3g/L+活性炭0.5-2.0g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
第二个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基B中，培养时间30-50天，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间8-12小时/天；所述无激素壮苗培养基B为：MS或N6基本培养基+土豆泥50-100g/L+香蕉泥100-200g/L+活性炭0.5-2.0g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
第1次壮苗培养结束后，选择具有2片以上叶片（最好颜色深绿的）且株高2cm以上的无菌壮苗进入第（4）阶段的生根培养，其余的弃用或者接着进行第2次壮苗培养；第2次壮苗培养结束后，选择具有2片以上叶片（最好颜色深绿的）且株高2cm以上的无菌壮苗进入第（4）阶段的生根培养；
（4）生根培养：将第（3）阶段获得的无菌壮苗转入无激素生根培养基中，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间10-14小时/天，培养时间40-60天；所述无激素生根培养基为：MS或N6基本培养基+香蕉泥100-200g/L+土豆泥0-50g/L+活性炭1-2g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8。
完成上述生根培养阶段后，便能培育出高度大于4cm、具2条以上根的无菌大苗，将无菌大苗接着进行炼苗移栽即可。炼苗时保证75-80%的空气湿度；培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间10-14小时/天。
以上各阶段培养基的制作都是按照各自配比将各原料混合后搅拌均匀即可。各阶段培养基的pH值可通过KOH（或NaOH）和HCL调整，调整方法参考如下：以1升培养基的量为例，将培养基配方中的所有物质加入一起溶解后，将最终的培养基体积用水调整到1升，充分混合后，用浓度为1摩尔/升的KOH（或NaOH）和HCL调整培养基的酸碱度（pH值）到所需值。
以上各阶段培养基定容所用的水可采用过滤的普通自来水或井水、自来水、矿泉水、蒸馏水等干净的水。以上各阶段培养基中的白糖包括蔗糖、冰糖等。
MS基本培养基组成如下表所述：
| 组成成分 | 质量（mg/L） | 组成成分 | 质量（mg/L） |
| 硝酸铵NH4NO3 | 1650 | 钼酸钠Na2MoO4.2H2O | 0.25 |
| 硝酸钾KNO4 | 1900 | 硫酸铜CuSO4·5H2O | 0.025 |
| 氯化钙CaCl2·2H2O | 440 | 氯化钴CoCl2.6H2O | 0.025 |
| 硫酸镁MgSO4·7H2O | 370 | 硫酸铁FeSO4·7H2O | 27.8 |
| 磷酸二氢钾KH2PO4·H2O | 170 | VB1 | 0.1 |
| 碘化钾KI | 0.83 | 烟酸 | 0.5 |
| 硼酸H3BO3 | 6.2 | VB6 | 0.5 |
| 硫酸锰MnSO4·4H2O | 22.3 | 甘氨酸 | 2.0 |
| 硫酸锌ZnSO4·7H2O | 8.6 | 肌醇 | 100 |
N6基本培养基的成分组成如下表所述：
| 组成成分 | 质量（mg/L） | 组成成分 | 质量（mg/L） |
| 硫酸铵(NH4)2SO4 | 463 | 硫酸铁FeSO4·7H2O | 27.8 |
| 硝酸钾KNO4 | 2830 | VB1 | 1.0 |
| 氯化钙CaCl2·2H2O | 166 | 烟酸 | 0.5 |
| 硫酸镁MgSO4·7H2O | 185 | VB6 | 0.5 |
| 磷酸二氢钾KH2PO4·H2O | 400 | 甘氨酸 | 2.0 |
| 碘化钾KI | 0.8 | ||
| 硼酸H3BO3 | 1.6 | ||
| 硫酸锰MnSO4·4H2O | 4.4 | ||
| 硫酸锌ZnSO4·7H2O | 1.5 |
（二）实施例
实施例1
自福建省南靖县采集野生金线莲植株种植于网室内，经数月观察选择优良株系于花期进行人工异株授粉，55天后选择果实饱满、硬实、无病虫危害、外表颜色为红色或浅棕色的蒴果用于组织培养。将选择的蒴果置于无菌超净工作台上，用浓度为75%的酒精浸泡50秒后，取出转入浓度为10%的次氯酸钠溶液中消毒9分钟，接着取出转入无菌容器中用无菌水浸洗4次，最后取出用无菌纸吸干蒴果表面水分，之后按以下四个组织培养阶段依次进行培养：
（1）种子无菌萌发形成原球茎：进行蒴果表面消毒灭菌处理后，将蒴果切开，取出种子均匀播种在无激素种子萌发培养基上，播种后的培养瓶置于温度20-28℃之间、无光照条件下培养诱导种子萌发，培养35天后，种子膨大、萌发形成白色或乳黄色的原球茎，萌发率达90.3%；所述无激素种子萌发培养基为：MS基本培养基+土豆泥120g/L+白糖25g/L+琼脂7.0g/L，pH值为5.6；
（2）原球茎的增殖与小苗分化培养：将第（1）阶段获得的原球茎转入无激素增殖与分化培养基中，培养温度20-28℃之间，光照强度2000lx，光照时间10小时/天，培养55天后原球茎增殖堆积在培养基表面，继续培养15天，观察到原球茎分化形成带叶和茎的芽，高达1.5cm以上，分化率达87.8%；所述的无激素增殖与分化培养基为：MS基本培养基+土豆泥180g/L+番茄汁80g/L+蛋白胨2g/L+白糖25g/L+琼脂6.0g/L，pH值为5.6；
（3）无菌苗壮苗培养：将第（2）阶段获得的已分化的芽或无菌苗转移进行1次的壮苗培养，每次壮苗培养由以下两个依次进行的培养周期组成：
第一个壮苗培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基A中，培养时间40天，培养温度20-28℃，光照强度2000lx，光照时间10小时/天；所述无激素壮苗培养基A为：MS基本培养基+土豆泥120g/L+蛋白胨2g/L+活性炭1.0g/L+白糖25g/L+琼脂6.0g/L，pH值为5.6；
第二个壮苗培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基B中，培养时间40天，培养温度20-28℃，光照强度2000lx，光照时间10小时/天；所述无激素壮苗培养基B为：MS基本培养基+土豆泥80g/L+香蕉泥180g/L+活性炭1.0g/L+白糖25g/L+琼脂6.0g/L，pH值为5.6。
第1次壮苗培养结束后，大部分无菌苗都有2片以上的叶片且株高达2cm以上，部分无菌苗甚至有4片以上的叶片且株高达4cm以上。选择具有2片以上叶片且株高2cm以上的无菌壮苗进入第（4）阶段的生根培养。
（4）生根培养：将第（3）阶段获得的无菌壮苗转入无激素生根培养基中，培养温度20-28℃，光照强度2000lx，光照时间12小时/天，培养时间50天；所述无激素生根培养基为：MS基本培养基+香蕉泥150g/L+活性炭1.5g/L+白糖25g/L+琼脂6.0g/L，pH值为5.6。
完成上述生根培养阶段后，培育出的无菌大苗高度大于4cm、至少具2条以上根，生根率达96.1%，将无菌大苗接着进行炼苗移栽即可。
实施例2
选择金线莲种植基地种植的金线莲优良单株，在盛花第3天进行人工异花授粉，60天后选择果实饱满、硬实、无病虫危害、外表颜色为红棕色的蒴果用于组织培养。将选择的蒴果置于无菌超净工作台上，用浓度为75%的酒精浸泡30秒后，取出转入浓度为15%的次氯酸钠溶液中消毒8分钟，接着取出转入无菌容器中用无菌水浸洗5次，最后取出用无菌纸吸干蒴果表面水分，之后按以下四个组织培养阶段依次进行培养：
（1）种子无菌萌发形成原球茎：进行蒴果表面消毒灭菌处理后，将蒴果切开，取出种子均匀播种在无激素种子萌发培养基上，播种后的培养瓶置于温度20-28℃之间、无光照条件下培养诱导种子萌发，培养40天后，种子膨大、萌发形成白色或乳黄色的原球茎，萌发率达93.3%；所述无激素种子萌发培养基为：MS基本培养基+土豆泥150g/L+白糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH值为5.8；
（2）原球茎的增殖与小苗分化培养：将第（1）阶段获得的原球茎转入无激素增殖与分化培养基中，培养温度20-28℃之间，光照强度2500lx，光照时间8小时/天，培养60天后原球茎增殖堆积在培养基表面，继续培养30天观察原球茎分化形成带叶和茎的芽，高达1.5cm以上，分化率达90.1%；所述的无激素增殖与分化培养基为：MS基本培养基+土豆泥200g/L+番茄汁100g/L+蛋白胨3g/L+白糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH值为5.8；
（3）无菌苗壮苗培养：将第（2）阶段获得的已分化的芽或无菌苗转移进行1次的壮苗培养，每次壮苗培养由以下两个依次进行的培养周期组成：
第一个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基A中，培养时间50天，培养温度20-28℃，光照强度2500lx，光照时间8小时/天；所述无激素壮苗培养基A为：MS基本培养基+土豆泥150g/L+蛋白胨3g/L+活性炭2.0g/L+白糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH值为5.8；
第二个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基B中，培养时间30天，培养温度20-28℃，光照强度2500lx，光照时间8小时/天；所述无激素壮苗培养基B为：MS基本培养基+土豆泥100g/L+香蕉泥200g/L+活性炭2.0g/L+白糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH值为5.8。
第1次壮苗培养结束后，大部分无菌苗都有2片以上的叶片且株高达2cm以上，部分无菌苗甚至有4片以上的叶片且株高达4cm以上。选择具有2片以上叶片且株高2cm以上的无菌壮苗进入第（4）阶段的生根培养。
（4）生根培养：将第（3）阶段获得的无菌壮苗转入无激素生根培养基中，培养温度20-28℃，光照强度2500lx，光照时间10小时/天，培养时间60天；所述无激素生根培养基为：MS基本培养基+香蕉泥200g/L+活性炭2g/L+白糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH值为5.8。
完成上述生根培养阶段后，培育出的无菌大苗高度大于4cm、至少具2条以上根，生根率达97.3%，将无菌大苗接着进行炼苗移栽即可。
实施例3
采集自云南野生金线莲自然授粉后、饱满、硬实、无病虫危害且外表为浅棕色的蒴果。将选择的蒴果置于无菌超净工作台上，用浓度为75%的酒精浸泡60秒后，取出转入浓度为8%的次氯酸钠溶液中消毒10分钟，接着取出转入无菌容器中用无菌水浸洗3次，最后取出用无菌纸吸干蒴果表面水分，之后按以下四个组织培养阶段依次进行培养：
（1）种子无菌萌发形成原球茎：进行蒴果表面消毒灭菌处理后，将蒴果切开，取出种子均匀播种在无激素种子萌发培养基上，播种后的培养瓶置于温度20-28℃之间、无光照条件下培养诱导种子萌发，培养30天后，种子膨大、萌发形成白色或乳黄色的原球茎，萌发率达89.2%；所述无激素种子萌发培养基为：MS基本培养基+土豆泥100g/L+白糖20g/L+琼脂5.0g/L，pH值为5.4；
（2）原球茎的增殖与小苗分化培养：将第（1）阶段获得的原球茎转入无激素增殖与分化培养基中，培养温度20-28℃之间，光照强度1500lx，光照时间12小时/天，培养40天后原球茎增殖堆积在培养基表面，继续培养20天观察原球茎分化形成带叶和茎的芽，高达1.5cm以上，分化率88.8%；所述的无激素增殖与分化培养基为：MS基本培养基+土豆泥100g/L+番茄汁50g/L+蛋白胨1g/L+白糖20g/L+琼脂5.0g/L，pH值为5.4；
（3）无菌苗壮苗培养：将第（2）阶段获得的已分化的芽或无菌苗转移进行1次的壮苗培养，每次壮苗培养由以下两个依次进行的培养周期组成：
第一个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基A中，培养时间30天，培养温度20-28℃，光照强度1500lx，光照时间12小时/天；所述无激素壮苗培养基A为：MS基本培养基+土豆泥100g/L+蛋白胨1g/L+活性炭0.5g/L+白糖20g/L+琼脂5.0g/L，pH值为5.4；
第二个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基B中，培养时间50天，培养温度20-28℃，光照强度1500lx，光照时间12小时/天；所述无激素壮苗培养基B为：MS基本培养基+土豆泥50g/L+香蕉泥100g/L+活性炭0.5g/L+白糖20g/L+琼脂5.0g/L，pH值为5.4。
第1次壮苗培养结束后，大部分无菌苗都有2片以上的叶片且株高达2cm以上，部分无菌苗甚至有4片以上的叶片且株高达4cm以上。选择具有2片以上叶片且株高2cm以上的无菌壮苗进入第（4）阶段的生根培养。
（4）生根培养：将第（3）阶段获得的无菌壮苗转入无激素生根培养基中，培养温度20-28℃，光照强度1500lx，光照时间14小时/天，培养时间40天；所述无激素生根培养基为：MS基本培养基+香蕉泥100g/L+活性炭1g/L+白糖20g/L+琼脂5.0g/L，pH值为5.4。
完成上述生根培养阶段后，培育出的无菌大苗高度大于4cm、至少具2条以上根，生根率达92.7%，将无菌大苗接着进行炼苗移栽即可。
实施例4
参照实施例1，将各阶段的培养基中的MS基本培养基换成N6基本培养基，琼脂换成卡拉胶，将第（3）阶段的壮苗培养次数由1次改为2次，在第（4）阶段的无激素生根培养基中增加土豆泥30g/L，其余参数同实施例1。
实施例5
参照实施例2，将各阶段的培养基中的MS基本培养基换成N6基本培养基，琼脂换成卡拉胶，将第（3）阶段的壮苗培养次数由1次改为2次，在第（4）阶段的无激素生根培养基中的增加土豆泥5g/L，其余参数同实施例2。
实施例6
参照实施例3，将各阶段的培养基中的MS基本培养基换成N6基本培养基，琼脂换成卡拉胶，将第（3）阶段的壮苗培养次数由1次改为2次，在第（4）阶段的无激素生根培养基中增加土豆泥50g/L，其余参数同实施例3。
（三）实验对比
1、有无添加外源植物激素的培养基培养的金线莲种苗质量比较如下表所示：
2、有无激素培养的金线莲种苗移栽3个月后的生长情况比较如下表所示：
Claims (4)
1.一种金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括以下四个组织培养阶段：
（1）种子无菌萌发形成原球茎：选择金线莲近成熟的蒴果，进行蒴果表面消毒灭菌处理后，将蒴果切开，取出种子均匀播种在无激素种子萌发培养基上，播种后的培养瓶置于温度20-28℃、无光照条件下培养诱导种子萌发，培养时间30-40天，使种子膨大、萌发形成白色或乳黄色的原球茎；所述无激素种子萌发培养基为：MS或N6基本培养基+土豆泥100-150g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
（2）原球茎的增殖与小苗分化培养：将第（1）阶段获得的原球茎转入无激素增殖与分化培养基中，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间8-12小时/天，培养时间60-90天，使原球茎增殖并分化形成带叶和茎的芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；所述的无激素增殖与分化培养基为：MS或N6基本培养基+土豆泥100-200g/L+番茄汁50-100g/L+蛋白胨1-3g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
（3）无菌苗壮苗培养：将第（2）阶段获得的已分化的芽或无菌苗转移进行1-2次的壮苗培养，每次壮苗培养由以下两个依次进行的培养周期组成：
第一个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基A中，培养时间30-50天，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间8-12小时/天；所述无激素壮苗培养基A为：MS或N6基本培养基+土豆泥100-150g/L+蛋白胨1-3g/L+活性炭0.5-2.0g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
第二个培养周期：将无菌苗转入无激素壮苗培养基B中，培养时间30-50天，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间8-12小时/天；所述无激素壮苗培养基B为：MS或N6基本培养基+土豆泥50-100g/L+香蕉泥100-200g/L+活性炭0.5-2.0g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8；
第1次壮苗培养结束后，选择具有2片以上叶片且株高2cm以上的无菌壮苗进入第（4）阶段的生根培养，其余的弃用或者接着进行第2次壮苗培养；第2次壮苗培养结束后，选择具有2片以上叶片且株高2cm以上的无菌壮苗进入第（4）阶段的生根培养；
（4）生根培养：将第（3）阶段获得的无菌壮苗转入无激素生根培养基中，培养温度20-28℃，光照强度1500-2500lx，光照时间10-14小时/天，培养时间40-60天；所述无激素生根培养基为：MS或N6基本培养基+香蕉泥100-200g/L+土豆泥0-50g/L+活性炭1-2g/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.4-5.8。
2.根据权利要求1所述的金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：步骤（1）所选择的金线莲近成熟的蒴果指金线莲人工授粉后50-80天、饱满、硬实、无病虫危害且外表为红色或浅棕色的蒴果，或者野生金线莲自然授粉后、饱满、硬实、无病虫危害且外表为红色或浅棕色的蒴果。
3.根据权利要求1或2所述的金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：所述的蒴果表面消毒灭菌处理是将所选取的蒴果置于无菌超净工作台上，用浓度为60%-95%的酒精浸泡30-60秒后，取出转入浓度为8-15%的次氯酸钠溶液中消毒8-10分钟，接着取出转入无菌容器中用无菌水浸洗3-5次，最后取出用无菌纸吸干蒴果表面水分。
4.根据权利要求3所述的金线莲种苗的无激素组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：蒴果表面消毒灭菌处理过程中，使用的酒精浓度为75%。
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