CN101461327A - 滇重楼快繁技术和炼苗、种植的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种滇重楼快繁技术和炼苗、种植的方法，其快繁技术包括筛选优质单株体系、消毒、组培：炼苗是关系组培苗种植成活率高低的关键，本发明首次利用微量元素进行滇重楼炼苗，使炼苗成活率达80％，从而确保种植成活率达80％；炼苗是将再生小苗先置于添加维生素及植物激素的培养基中培养后，再加入微量元素进行培养再移栽；种植方法是将经过炼苗的幼苗移栽在经消毒的配方土壤培养袋中，待新长出的顶芽长成叶片时，即可移栽野外并进行虫害防治。本发明的技术及方法可确保种苗品质的一致性，确保重楼中药材优质种源。炼苗的成活率达80％。主根粗壮，须根增多，种植野外时适应性强，大田种植成活率达80％以上，解决了组培不易生根、炼苗技术不成熟，种植不易成活的瓶颈难题。具有生长周期短、生产成本低、品质好、可规模化生产种苗的特点。

Description

滇重楼快繁技术和炼苗、种植的方法

技术领域

本发明涉及一种滇重楼快繁技术和炼苗、种植的方法。

背景技术

重楼是《中国药典》收录品种，是云南白药和中药配伍中重要的稀缺中药材，重楼是以地下根为药材，重楼主根生长缓慢，周期长，依赖于采挖野生资源来满足需求，资源日渐枯竭.国内虽有种植，但播种后1-2年萌发出芽，尚末解决种源，随着我国制药企业对重楼原料需求量的迅速增长，重楼已逐渐成为濒临消亡的珍稀濒危物种。

目前国外无此相关技术的研究报道，我国对于重楼的引种驯化和人工栽培技术的研究从上世纪80年代就开始了，例如：李运昌(1982)对滇重楼的有性繁殖进行了研究。王丽萍，起学伟(2002)也对滇重楼进行了野生驯化及栽培技术的初步研究。近年来对重楼需求每年以20％幅度递增，而其野生资源逐年减少，供需逐年扩大。种植重楼是大势所趋，综观技术有四：

1、假植

在中药现代法种植中，云南省重楼的大多数种植公司是将甲地的野生重楼挖出，运到乙地种植，实际上不是种植是假植，假植处理不妥，烂根极多，导致重楼资源短缺，没有解决从获得种苗至大田种植的根本问题。

2、有性繁殖种苗的种植

从种植方面而言，目前国内常采用的两种方法(有性种子繁殖和无性切块繁殖)之一：采集野外和假植重楼的种子进行有性繁植，如澄江正飞药材种植公司。野生滇重楼的种子采集困难，滇重楼种子的生物特性决定滇重楼种子的发芽必须经过两个冬季休眠才会发芽，才能长成幼苗，是典型的“二年种子”，种植后十年其根可作药材，十二年种植费用和管理成本很高，周期过长，药农不能早见效益，难于推广。非专业技术人员采集种子的品种难于控制，使种植的重楼有非药用滇重楼的情况，品种混乱使药材质量不易控制。

3、滇重楼无繁--切块种植

先对滇重楼带顶芽的块茎进行切块，将切块直接种入苗床，待成芽后再移入大田进行种植。如云南白药有限公司和澄江正飞药材种植公司。非专业技术人员挖来的重楼品种难于控制，使种植的重楼品种混乱，使种植的重楼有非药用滇重楼的情况。切块后品种不保证，药材质量难控制。切块快繁可缩短种植周期，但仍需采集野生重楼为材料，种植中烂根较多尚未完全解决，于资源保护不利。

4、滇重楼组培苗

云南农业大学，云南大学和云南中医学院，先后进行了组培实验。组培生产种苗，可缩短出苗周期，使品种单一，但组培苗不易生根，种植不易成活的瓶颈难题尚未解决，滇重楼组培苗大田种植成活率方面没有突破，虽有人做过试验，但均未见有成功和较好效果的文献报道。

5、滇重楼组培苗存在问题

滇重楼组培苗不易生根，炼苗技术不成熟，种植不易成活是困绕科技工作者多年，一直没有解决的瓶颈难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种滇重楼快繁技术和炼苗、种植的方法，该方法利用组织培养的技术原理，选择滇重楼根部的顶端为外植体，进行无性繁植；攻克了组培苗不易生根，炼苗技术不成熟、种植不易成活的瓶颈难题，为滇重楼资源的再生、确保重楼中药材的市场供应、满足制药企业对重楼原料需求、实现资源的再生和持续利用提供了有效的方法。

本发明的技术方案如下：

一、快繁技术

材料：经过对甾体皂甙化学成分含量分析后，选择高含量植株茎、芽为外植体，建立单株无菌体系，确保种苗品质的一致性，确保滇重楼中药材优质种源。

1)对外植体消毒：取健壮根冲洗1小时——70％乙醇擦洗根部——放到超净工作台上按以下步骤操作：用0.1％升汞液浸泡10—15min，放入装有无菌水的瓶子摇洗6次，用消毒镊子取出在用消毒刀片先切芽头部分，然后顺着芽头往下在芽眼处斜切，切面成三角形，将切面向下沿瓶边插入MS培养基中，每瓶放一块外植体。盖紧瓶盖，用保鲜袋封好瓶口，；

2)组培：

①培养基配制：以MS为基本培养基，附加不同浓度的植物激素(如：Naphthalene acetcacid，6-benzyladenine，kinetin，Indole-3-butyric acid，Indole-3-actic acid，adenine)蔗糖30g/L、琼脂粉6.5g/L、PH值＝5.6--6.4，生根培养基中加入活性炭1g/L。

配制过程按照常规方法，培养瓶为玻璃瓶或透明塑料瓶。灭菌采用121℃灭菌30分钟高压湿热灭菌。

②组培条件：组培室温度25℃、置于光照培养箱中，在温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为1000～2000勒可斯，μM m-2 s-1条件下培养。

二、炼苗

将上面获得的再生小苗从生根培养基中取出，用无菌水洗去再生小苗的培养基。于大量元素培养基和微量元素液以及根据目的添加铁盐、肌醇、甘氨酸、脯氨酸、各种维生素、植物激素，炼苗12天，根3—5条，长度3—5cm。

大量元素培养基即MS培养基，其具体配方为：硝酸钾18-49、硫酸镁.5.1-8.2、硝酸铵11.25、磷酸二氢钾1.6-5.3，定溶1升，与用无水氯化钙6.64克定溶1升的溶液进行混配；

微量元素液具体配方为：上述培养基中每升加入硒1.6—4.2克，铵1.8—5.6克，锌0.002—0.01克，磷0.01—0.5克，培养10—15天，增加光照强度，一般要求为4000～6000勒可斯，而后打开瓶盖通风、透气5—7天，待苗木叶色浓绿、块茎木质化程度提高，并逐步适应后、再移栽。也可以将生根瓶移入温室内培养，而后打开瓶盖通风、透气，使苗逐步适应后再移栽。

三、种植

具体方法步骤及条件：从微量元素液中取出幼苗，移栽在经消毒的土壤培养袋中，置于背阴、通风、湿润的地床上，无需施肥、浇水，一周后检查土壤湿润度：以土壤从手指缝中流出，手捏住土壤时湿润无渗水为标准；20天后小苗叶片转为墨绿色，长出新根后，可添加腐熟土更换营养袋中消毒土壤，待长出的顶芽长成叶片时，即可移栽野外。

虫害防治：重楼的主要虫害为白蚂蚁及老鼠，老鼠喜温，因此，野外移栽防治鼠害的条件极为重要：首先要选择西边背阴1800米海拔以上的寒冷山区为宜；同时，定期灭鼠。

本发明的有益效果：

优选重楼的根中“根茎顶端生长优势”为外植体进行单株组培组培，可确保种苗品质的一致性，确保重楼中药材优质种源。诱导出愈伤组织，分化频率为100％，增殖系数为5—6倍以上。愈伤组织转接到不定芽分化和继代培养，每个芽的年增殖系数理论上为1.0X1010以上。无根不定芽，转接到生根培养基中，培养得到不定根生根苗，生根达3—5厘米。炼苗时加入微量元素，可长出新的须根2—5条，须根长度均超过0.5CM。炼苗的成活率达80％.主根粗壮，须根增多，种植野外时适应性强，大田种植成活率达80％以上，解决了组培不易成活的难题。

重楼种子具“二次休眠”的生理特性，用种子有性繁殖出苗需二年以上；利用“根茎顶端生长优势”为外植体进行组培，在一年内即可培育三批组培苗，提前二年获得种苗，缩短了种植周期。此发明创造技术与现有其他技术相比，具有生长周期短、生产成本低、品质好、可规模化生产种苗的特点。

具体实施方式

实施例1：愈伤组织诱导与分化

取甾体皂甙化学成分含量高，健壮的重楼根外殖体，用70％的乙醇表面消毒1-6分钟，再用0.1％的升汞消毒5-15分钟，灭菌蒸馏水洗6次，每次10分钟。然后，将消毒后的外植体切成小块接种在0.2mg/L NAA和1.5mg/L 6-BA激素，分裂素3％活性炭，添加100ml/L椰汁的MS蔗糖琼脂培养基上，配制过程按照常规方法，培养瓶为玻璃瓶，灭菌采用121℃灭菌30分钟高压湿热灭菌。

置于光照培养箱中，在温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为1000～2000勒可斯，μM m-2 s-1条件下培养；经过对外植体诱导后得到愈伤组织，培养4周，其体积可比原愈伤组织扩大5～6倍。诱导出愈伤组织，增殖系数为5～6倍以上。

按此方法可每月继代培养，每个芽的年增殖系数理论上为1.0X1010以上。

实施例2：不定芽、不定根诱导

选取愈伤组织转接到不定芽分化和继代培养基中，置于温度为10℃±2，光照时间为4小时，光照强度为1000～2000勒可斯，μM m-2 s-1条件下培养得到不定芽。按此方法45天为一周期继代培养。

选取生长健壮、高度为1.5-3.0cm的无根不定芽，转接到生根培养基中，置于温度为20℃±2，光照时间为10小时，光照强度2000～4000勒可斯，μM m-2 s-1条件下培养得到不定根生根苗，生根达3—5厘米。

实施例3：炼苗

采用微量元素配方：将获得的生根苗从生根培养基中取出，用无菌水洗去培养基。将生根苗置于微量元素液，每升加入硒4.2克，铵5.6克，锌0.01克，磷0.5克，培养15天，保持光照强度为4000～6000勒可斯，μM m-2 s-1，气温为20-25℃，相对湿度为70-100％。待长出木质化新根3—5条，再将其移栽到大棚进行炼苗30—50天，可长出新的须根2—5条，须根长度均超过0.5CM。

实施例4：种植

经大棚炼苗长出新的须根2—5条，须根长度均超过0.5cm时，木质化新根粗壮，原地上部分枯萎，变黄逐渐倒苗，新生苗芽顶出现，此时适应性强，在11月，4月和8月份分批将大棚中的幼苗整株移栽于野外，并保持水分。种植成活率达到80％以上，突破了我国重楼组培苗炼苗技术及难以种植成活的瓶径难题。

Claims (3)

1、一种滇重楼快繁技术，其特征是包括：

组培：选择高含量植株茎、芽为外植体，建立单株无菌体系，对外植体消毒后插入生根培养基中进行组培；

生根培养基配制：以MS为基本培养基，附加植物激素，蔗糖30g/L、琼脂粉6.5g/L、PH值＝5.6--6.4，培养基中加入活性炭1g/L；

组培条件：在温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为1000～2000勒可斯、μMm-2s-1条件下培养；

2、一种滇重楼炼苗方法，其特征为步骤如下：

将获得的再生小苗从生根培养基中取出用无菌水洗净，于MS培养基中添加铁盐、肌醇、甘氨酸、脯氨酸各种维生素及植物激素炼苗12天，根5—10条，长度3—5cm；再加入微量元素，每升加入硒1.6—4.2克，铵1.8—5.6克，锌0.002—0.01克，磷0.01—0.5克，培养10—15天，增加光照强度至4000～6000勒可斯，而后打开瓶盖通风、透气5—7天，待苗木叶色浓绿、块茎木质化程度提高，并逐步适应后、再移栽；

3、一种滇重楼种植方法，其特征为具体方法是：

从上述微量元素液中取出幼苗，移栽在经消毒的土壤培养袋中，置于背阴、通风、湿润的地床上，无需施肥、浇水，一周后检查土壤湿润度：以土壤从手指缝中流出、手捏住土壤时湿润无渗水为标准；20天后小苗叶片转为墨绿色，长出新根后，可添加腐熟土更换营养袋中消毒土壤，待长出的顶芽长成叶片时，即可移栽野外并进行虫害防治。