CN102301956B - 一种以重楼芽鞘为外植体的愈伤组织诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以重楼芽鞘为外植体的愈伤组织诱导方法，该方法是先将重楼根茎上将萌发的隐芽进行消毒和预培养，再选取预培养后体积明显膨大的芽体的白色内层芽鞘作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA0.5～2.0 mg·L-1+NAA0.5~4mg·L-1+椰汁20~80 mg·L-1+蔗糖30～50 g·L-1 +琼脂6.0～7.0 g·L-1中进行培养，培养50~60 天后，外植体表面即长出白色或黄白色的质地紧密的愈伤组织。本发明较好的解决了重楼传统生产方法中存在的生长时间长、成本高等问题，可有效缓解当前重楼药材短缺现象。
Description
技术领域
本发明涉及一种重楼组织培养方法，特别是涉及一种以重楼芽鞘为外植体的愈伤组织诱导方法。
背景技术
重楼是名贵中药材之一，全世界共有24种，我国拥有19种，其中又以西南地区各省的种类和资源尤为丰富，如云南、四川、贵州等地。重楼主要有效成分是甾体皂苷，其苷元主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元，并含有氨基酸、甾酮、蜕皮激素、黄酮苷等化合物。现代药理研究表明，重楼具有抗肿瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，其良好的疗效已被众多的制药工业用于药剂的使用，是云南白药、宫血宁、热毒清等重要中成药的主要成分。
随着中医药产业的快速发展，重楼药材的需求正以每年20％的幅度递增，而其野生资源却逐年减少，导致重楼价格迅速上涨，严重制约了制药企业的产量和质量。当前，重楼主要靠采挖野生资源，由于长期过度采挖, 并缺乏对其生态环境的保护，致使野生重楼资源遭到了毁灭性的破坏, 现己濒临灭绝。
当前重楼主要是靠种子和根茎进行繁殖，由于重楼种子存在种胚发育不完全，胚乳坚硬，胚轴后熟等明显“双重休眠”特性，因此重楼种子在播种后通常需要经历两个冬天才能萌发成苗，是典型的“二年生种子”， 而且在自然状态下重楼种子出苗率很低、生长周期长，从出苗到成材需要8~10年的时间；而使用重楼根茎进行营养繁殖, 由于重楼根茎本身就是其药用有效部位，因此利用根茎切块生产重楼种苗存在用种量大、生产成本高等问题。
利用组织培养技术生产重楼具有生长周期短，繁殖率高、能有效降低灾害性气候对重楼生长的影响等优点，可进行周年培养生产，且培养条件优越，对重楼生长极为有利。目前重楼植物的组织培养仍未取得满意效果，其主要原因是在外植体的选择和进行有效诱导培养上仍未有明显突破。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以重楼芽鞘为外植体的愈伤组织诱导方法,该方法能实现对愈伤组织的有效诱导。
为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤：
（1）选取重楼根茎上将萌发的隐芽，先将隐芽用自来水冲洗干净，然后阴干，再在超净台用浓度为70 %~75 %的酒精消毒10~60 s，接着用浓度为0. 1 %~0. 15 %的升汞消毒4~10 min，最后用无菌水震荡洗3~6次，洗后用已灭菌的滤纸反复吸干隐芽表面的水分；
（2）将消毒处理后的隐芽接种于培养基MS+6-BA1.0～3.0 mg·L-1+椰汁0~100 mg·L-1+蔗糖30～50 g·L-1 +琼脂6.0～7.0 g·L-1 中进行预培养，所采用的pH值为5.5～6.0，培养温度16～20 °C、每天光照6～10小时、光照强度为1000～1500 lx；
（3）选取预培养后体积明显膨大的芽体，在超净工作台上先剥去其外层芽鞘，再将其白色内层芽鞘作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA0.5～2.0 mg·L-1+NAA0.5~4mg·L-1+椰汁20~80 mg·L-1+蔗糖30～50 g·L-1 +琼脂6.0～7.0 g·L-1中进行培养，所采用的培养基pH值为5.5～6.0，培养温度为16～26 °C、每天光照8～12小时、光照强度为1200～1800 lx，培养50~60 天后，外植体表面上长出的白色或黄白色物即为愈伤组织。
上述步骤（2）的预培养时间为20～30天。
本发明首次提出了以重楼内层芽鞘为外植体的愈伤组织诱导方法,为重楼植物的组织培养提供了一种新的途径。该方法可缩短重楼的生长周期、降低生产成本，且能实现批量生产，从而可有效解决当前重楼药材短缺的问题。
具体实施方式
实施例1
（1）选取重楼根茎上将萌发的健壮、无病虫害和直径在2 cm左右的白色隐芽，先将隐芽用自来水冲洗干净，然后阴干，再在超净台用浓度为70 %的酒精消毒30 s，接着用浓度为0. 1 %的升汞消毒8min，最后用无菌水震荡洗5次，洗后用已灭菌的滤纸反复吸干隐芽表面的水分；
（2）将消毒处理后的隐芽接种于培养基MS+6-BA2.0 mg·L-1+椰汁80mg·L-1+蔗糖30g·L-1 +琼脂6.0 g·L-1 中进行预培养，所采用的pH值为5.8，培养温度20 °C、每天光照8小时、光照强度为1200 lx；
（3）选取预培养25天后体积明显膨大的芽体，在超净工作台上先剥去其外层芽鞘，再切取其肥厚肉质的白色内层芽鞘作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA3.0mg·L-1+椰汁50 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1 +琼脂6.0 g·L-1中进行培养，所采用的培养基pH值为5.8，培养温度为25 °C、每天光照10小时、光照强度为1500 lx，培养55天后，外植体表面上长出的白色或黄白色物即为愈伤组织，统计其愈伤组织诱导率为22.3%。
实施例2
将实施例1步骤（2）中的预培养基改为MS+6-BA2.0 mg·L-1+蔗糖30g·L-1 +琼脂6.0 g·L-1 ，步骤（3）中的愈伤组织诱导培养基改为MS+6-BA1.0 mg·L-1 +NAA3.0 mg·L-1+椰汁30 mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6.0g·L-1，其它步骤同实施例1，诱导培养55天后其愈伤组织诱导率为18.14 %。
比较实施例1
将实施例1中的步骤（2）去掉，直接选取未经预培养处理的白色内层芽鞘作为外植体，其它步骤同实施例1，诱导培养55天后其愈伤组织诱导率仅为2.54%，说明对隐芽进行预培养处理能明显提高愈伤组织的诱导率。
Claims (2)
1.一种以重楼芽鞘为外植体的愈伤组织诱导方法, 其特征在于包括如下步骤：
（1）选取重楼根茎上将萌发的隐芽，先将隐芽用自来水冲洗干净，然后阴干，再在超净台用浓度为70 %~75 %的酒精消毒10~60 s，接着用浓度为0. 1 %~0. 15 %的升汞消毒4~10 min，最后用无菌水震荡洗3~6次，洗后用已灭菌的滤纸反复吸干隐芽表面的水分；
（2）将消毒处理后的隐芽接种于培养基MS+6-BA1.0～3.0 mg·L-1+椰汁0~100 mg·L-1+蔗糖30～50 g·L-1 +琼脂6.0～7.0 g·L-1 中进行预培养，所采用的pH值为5.5～6.0，培养温度16～20 ℃、每天光照6～10小时、光照强度为1000～1500 lx；
（3）选取预培养后体积明显膨大的芽体，在超净工作台上先剥去其
外层芽鞘，再将其白色内层芽鞘作为外植体接入愈伤组织诱导培养基MS+6-BA0.5～2.0 mg·L-1+NAA0.5~4mg·L-1+椰汁20~80 mg·L-1+蔗糖30～50 g·L-1 +琼脂6.0～7.0 g·L-1中进行培养，所采用的培养基pH值为5.5～6.0，培养温度为16～26℃、每天光照8～12小时、光照强度为1200～1800 lx，培养50~60 天后，外植体表面上长出的白色或黄白色物即为愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的一种以重楼芽鞘为外植体的愈伤组织培养方法，其特征在于：预培养的时间为20～30天。
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