CN104823847B - 一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，属于植物组织培养快速繁殖技术领域。一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，包括以下依序进行的步骤：(1)果实的选择；(2)无菌播种与萌发培养；(3)无菌实生苗的健壮培养；(4)丛生芽增殖培养；(5)壮苗生根培养；(6)炼苗移栽。本发明所提供的方法操作简便，能获得大量的性状优良的植株，可供遗传利用及产业化生产，其投入少，成苗速度快，种苗壮，生产周期短，仅6‑7个月，不仅能够有效地保护野生浙江金线兰资源，同时还能够满足工业化生产种苗需要的连续性生产流程。
Description
技术领域
本发明涉及一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，属于植物组织培养快速繁殖技术领域。
背景技术
浙江金线兰Anoectochilus zhejiangensis Z.Wei&Y.B.Chang又称浙江开唇兰，是我国珍稀濒危的兰科植物之一，已列入国家二级保护植物名录，浙江省珍稀濒危植物名录。野生分布于浙江、福建、广西等地，生于海拔700-1200米的山坡或沟谷的密林下阴湿处。为我国传统名贵草药，民间应用广泛。
由于浙江金线兰为兰科开唇兰属植物，种胚发育不完全，自然条件下种子发芽率极低，资源再生缓慢。随着人为肆意采挖、生态环境的破坏，野生浙江金线兰资源已濒临灭绝，此外，兰科植物种子结构简单，几乎没有贮藏营养物质，而且种子也未发现有贮藏营养物质的组织，在自然条件下很难萌发，并且幼苗生长缓慢。
发明内容
本发明的目的在于提供一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，以解决现有生产中存在的上述问题，本发明所提供的方法操作简便，能获得大量的性状优良的植株，可供遗传利用及产业化生产，其投入少，成苗速度快，种苗壮，生产周期短，仅6-7个月，不仅能够有效地保护野生浙江金线兰资源，同时还能够满足工业化生产种苗需要的连续性生产流程。
本发明的技术方案如下：
一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)果实的选择：于浙江金线兰开花期，选择优良的浙江金线兰株系进行人工同株或异株授粉，授粉70-80天后,选择发育基本成熟、且外表颜色接近黄色或黄褐色的果实用于组织培养；或者野外采集的野生浙江金线兰植株上的蒴果，选择果实外表颜色近黄色或黄褐色、且未开裂者用于组织培养；
(2)无菌播种与萌发培养：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为70-85％的酒精浸泡30-45秒后，置于质量百分比浓度为0.08-0.15％升汞溶液中消毒8-15分钟，用无菌水冲洗干净后(一般冲洗3-5次即可)，切开果实，取出白色粉状或浆状种胚接种到种子萌发培养基上，所述种子萌发培养基由以下组分按照以下配比组成：MS或N6基本培养基+80-200g/L土豆泥+50-200ml/L椰子水+20-30g/L白糖或蔗糖+5.0-8.0g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.4-5.8；接种后的培养瓶置于温度20-28℃、无光照条件下培养诱导种胚萌发；
种胚萌发培养28-32天后种胚膨大萌发形成白色、乳黄色的原球茎，50-60天后形成具有带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；
(3)无菌实生苗的健壮培养：将步骤(2)获得的带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗转入光照条件下进行10-20天的健壮培养，培养条件为光照度2000-2500lx，光照8-10小时/天，培养温度22±2℃；
健壮培养后，实生苗的茎和叶的颜色由浅绿色、黄色转成绿色，茎节挺拔、叶片伸展，植株健壮，大大降低了玻璃化，利于进行丛生芽增殖。
(4)丛生芽增殖培养：在无菌条件下，先将步骤(3)中获得的健壮的实生苗切割成带至少一个茎节的茎段或顶芽(所述茎段长度优选为0.5-1.6cm)，插入增殖培养基中诱导培养生成丛生芽；再将诱导培养生成的丛生芽分切成带至少一个茎节的顶芽或茎段，插入新的增殖培养基中进行至少一次继代增殖培养，每次继代增殖的培养周期为70-90天，每次继代增殖获得的丛生芽用于下一步骤的壮苗生根培养或者用于下一周期的继代增殖培养；整个培养过程中，培养温度为22±2℃，光照度为1300-2500lx，光照8-10小时/天；所述增殖培养基由以下组分按照以下配比组成：MS或N6基本培养基+1.0-2.5mg/L 6-BA+0.2-0.5mg/L NAA+1-2g/L LH+20-30g/L白糖或蔗糖+6-7g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.2-5.6；
诱导培养后，茎段或顶芽在所述增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在新的增殖培养基上能进行继代增殖，增殖系数可达3.5-5.4倍，70-90天即可进行再次继代，周期短，繁殖速度快；
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)中获得的丛生芽切割成单株，接种到壮苗生根培养基上进行80-100天的壮苗生根培养，培养温度22±2℃，光照度2000-2500lx，光照8-10小时/天；所述壮苗生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+1.0-2.0mg/L NAA+100-280g/L香蕉+0-80g/L马铃薯+1.0-3.0g/L活性炭+15-20g/L白糖或蔗糖+6-8g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.2-5.6；
壮苗生根培养80-100天后形成株高3cm以上的完整植株；
(6)炼苗移栽：将完成步骤(5)的壮苗生根培养获得的高度大于3cm且具有2条以上根的无菌大苗接着进行炼苗移栽。
本发明所提供的一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法对比现有技术有如下优点：
1)本发明利用成熟或近成熟的蒴果进行无菌播种获得大量无菌实生苗，再将实生苗的顶芽或茎段增殖丛生芽并通过壮苗和生根培养获得完整植株，有助于解决种苗繁育问题，还能有效保护和抢救野生资源。
2)本发明应用组织培养方法，以浙江金线兰种子为外植体快速繁殖种苗，具有出苗快、种苗健壮、生长良好、没有无效苗等优点，不仅大大降低了生产成本，而且种苗移栽成活率高达96％以上。
3)本发明操作简便，具有投入少、产出高的特点，生产周期短，仅6-7个月，可操作性强，应用价值高，适于工厂化生产。
4)本发明利用种子进行有性繁殖，能够在一定时间内获得数量巨大的可供遗传利用的种苗，还能经过筛选获得大量的性状优良的植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和具体实施例来对本发明进行详细的说明。
(一)具体实施方式如下：
一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)果实的选择：于浙江金线兰开花期，选择优良的浙江金线兰株系进行人工同株或异株授粉，授粉70-80天后,选择发育基本成熟、且外表颜色接近黄色或黄褐色的果实用于组织培养；或者野外采集的野生浙江金线兰植株上的蒴果，选择果实外表颜色近黄色或黄褐色、且未开裂者用于组织培养；
(2)无菌播种与萌发培养：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为70-85％的酒精浸泡30-45秒后，置于质量百分比浓度为0.08-0.15％升汞溶液中消毒8-15分钟，用无菌水冲洗干净后(一般冲洗3-5次即可)，切开果实，取出白色粉状或浆状种胚接种到种子萌发培养基上，所述种子萌发培养基由以下组分按照以下配比组成：MS或N6基本培养基+80-200g/L土豆泥+50-200ml/L椰子水+20-30g/L白糖或蔗糖+5.0-8.0g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.4-5.8；接种后的培养瓶置于温度20-28℃、无光照条件下培养诱导种胚萌发；
种胚萌发培养28-32天后种胚膨大萌发形成白色、乳黄色的原球茎，50-60天后形成具有带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；
(3)无菌实生苗的健壮培养：将步骤(2)获得的带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗转入光照条件下进行10-20天的健壮培养，培养条件为光照度2000-2500lx，光照8-10小时/天，培养温度22±2℃；
健壮培养后，实生苗的茎和叶的颜色由浅绿色、黄色转成绿色，茎节挺拔、叶片伸展，植株健壮，大大降低了玻璃化，利于进行丛生芽增殖。
(4)丛生芽增殖培养：在无菌条件下，先将步骤(3)中获得的健壮的实生苗切割成带至少一个茎节的茎段或顶芽(所述茎段长度优选为0.5-1.6cm)，插入增殖培养基中诱导培养生成丛生芽；再将诱导培养生成的丛生芽分切成带至少一个茎节的顶芽或茎段，插入新的增殖培养基中进行至少一次继代增殖培养，每次继代增殖的培养周期为70-90天，每次继代增殖获得的丛生芽用于下一步骤的壮苗生根培养或者用于下一周期的继代增殖培养；整个培养过程中，培养温度为22±2℃，光照度为1300-2500lx，光照8-10小时/天；所述增殖培养基由以下组分按照以下配比组成：MS或N6基本培养基+1.0-2.5mg/L 6-BA+0.2-0.5mg/L NAA+1-2g/L LH+20-30g/L白糖或蔗糖+6-7g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.2-5.6；
诱导培养后，茎段或顶芽在所述增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在新的增殖培养基上能进行继代增殖，增殖系数可达3.5-5.4倍，70-90天即可进行再次继代，周期短，繁殖速度快；
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)中获得的丛生芽切割成单株，接种到壮苗生根培养基上进行80-100天的壮苗生根培养，培养温度22±2℃，光照度2000-2500lx，光照8-10小时/天；所述壮苗生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+1.0-2.0mg/L NAA+100-280g/L香蕉+0-80g/L马铃薯+1.0-3.0g/L活性炭+15-20g/L白糖或蔗糖+6-8g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.2-5.6；
壮苗生根培养80-100天后形成株高3cm以上的完整植株；
(6)炼苗移栽：将完成步骤(5)的壮苗生根培养获得的高度大于3cm且具有2条以上根的无菌大苗接着进行炼苗移栽。
其中，6-BA是6-苄氨基嘌呤；NAA是a-萘乙酸；LH是水解乳蛋白；
MS培养基的基本组成如下表所述：
N6培养基的基本组成如下表所述：
上述培养基中，各物质的浓度均指其在最终配制获得的营养液中所占浓度。
(二)具体实施例如下：
实施例1(最佳实施例)
一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)果实的选择：于浙江金线兰开花期，选择优良的浙江金线兰株系进行人工同株或异株授粉，授粉75天后,选择发育基本成熟、且外表颜色接近黄色或黄褐色的果实用于组织培养；
(2)无菌播种与萌发培养：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为75％的酒精浸泡40秒后，置于质量百分比浓度为0.1％升汞溶液中消毒10分钟，用无菌水冲洗4次后，切开果实，取出白色粉状或浆状种胚接种到种子萌发培养基上，所述种子萌发培养基由以下组分按照以下配比组成：MS基本培养基+100g/L土豆泥+100ml/L椰子水+20g/L白糖+7.0g/L琼脂，pH值为5.8；接种后的培养瓶置于温度24℃左右、无光照条件下培养诱导种胚萌发；
种胚萌发培养30天后种胚膨大萌发形成白色、乳黄色的原球茎，50天后形成具有带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；
(3)无菌实生苗的健壮培养：将步骤(2)获得的带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗转入光照条件下进行10天的健壮培养，培养条件为光照度2200lx，光照10小时/天，培养温度22±2℃；
健壮培养10天后，实生苗的茎和叶的颜色由浅绿色、黄色转成绿色，茎节茎节伸长具1-3节，挺拔、叶片伸展，植株健壮，大大降低了玻璃化，利于进行丛生芽增殖。
(4)丛生芽增殖培养：在无菌条件下，先将步骤(3)中获得的健壮的实生苗切割成带至少一个茎节的茎段或顶芽(所述茎段长度为1.5cm)，插入增殖培养基中诱导培养生成丛生芽；再将诱导培养生成丛生芽分切成带至少一个茎节的顶芽或茎段，插入新的增殖培养基中进行至少一次继代增殖培养，每次继代增殖的培养周期为80天，每次继代增殖获得的丛生芽用于下一步骤的壮苗生根培养或者用于下一周期的继代增殖培养；整个培养过程中，培养温度为22±2℃，光照度为2000lx，光照10小时/天；所述增殖培养基由以下组分按照以下配比组成：MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+2g/L LH+22g/L白糖+6.5g/L琼脂，pH值为5.4；
诱导培养后，茎段或顶芽在所述增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在新的增殖培养基上能进行继代增殖，增殖系数达5.4倍，80天即可进行再次继代，周期短，繁殖速度快；
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)中获得的丛生芽切割成单株，接种到壮苗生根培养基上进行95天的壮苗生根培养，培养温度22±2℃，光照度2500lx，光照9小时/天；所述壮苗生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+1.5mg/L NAA+150g/L香蕉+30g/L马铃薯+2.0g/L活性炭+18g/L白糖+7g/L琼脂，pH值为5.4；
壮苗生根培养95天后形成株高3cm以上的完整植株；
(6)炼苗移栽：将完成步骤(5)的壮苗生根培养获得的高度大于3cm且具有2条以上根的无菌大苗接着进行炼苗移栽。
实施例2
一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)果实的选择：采集自福建建阳野生浙江金线兰自然授粉后、饱满、硬实、无病虫危害且外表为浅棕色的蒴果用于组织培养；
(2)无菌播种与萌发培养：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为80％的酒精浸泡45秒后，置于质量百分比浓度为0.12％升汞溶液中消毒12分钟，用无菌水冲洗3次后，切开果实，取出白色粉状或浆状种胚接种到种子萌发培养基上，所述种子萌发培养基由以下组分按照以下配比组成：MS基本培养基+120g/L土豆泥+120ml/L椰子水+20g/L白糖+6.0g/L琼脂，pH值为5.6；接种后的培养瓶置于温度20℃左右、无光照条件下培养诱导种胚萌发；
种胚萌发培养28天后种胚膨大萌发形成白色、乳黄色的原球茎，60天后形成具有带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；
(3)无菌实生苗的健壮培养：将步骤(2)获得的带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗转入光照条件下进行15天的健壮培养，培养条件为光照度2000lx，光照8小时/天，培养温度22±2℃；
健壮培养后，实生苗的茎和叶的颜色由浅绿色、黄色转成绿色，茎节伸长具1-3节，茎节挺拔、叶片伸展，植株健壮，大大降低了玻璃化，利于进行丛生芽增殖。
(4)丛生芽增殖培养：在无菌条件下，先将步骤(3)中获得的健壮的实生苗切割成带至少一个茎节的茎段或顶芽(所述茎段长度为1.3cm)，插入增殖培养基中诱导培养生成丛生芽；再将诱导培养生成丛生芽的植株切成带至少一个茎节的顶芽或茎段，插入新的增殖培养基中进行至少一次继代增殖培养，每次继代增殖的培养周期为84天，每次继代增殖获得的丛生芽用于下一步骤的壮苗生根培养或者用于下一周期的继代增殖培养；整个培养过程中，培养温度为22±2℃，光照度为2500lx，光照8小时/天；所述增殖培养基由以下组分按照以下配比组成：MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+1.5g/L LH+30g/L白糖+6g/L琼脂，pH值为5.6；
诱导培养后，茎段或顶芽在所述增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在新的增殖培养基上能进行继代增殖，增殖系数可达4.9倍，84天即可进行再次继代，周期短，繁殖速度快；
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)中获得的丛生芽切割成单株，接种到壮苗生根培养基上进行100天的壮苗生根培养，培养温度22±2℃，光照度2200lx，光照8小时/天；所述壮苗生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+1.0mg/L NAA+100g/L香蕉+50g/L马铃薯+1.0g/L活性炭+20g/L白糖+6g/L琼脂，pH值为5.4；
壮苗生根培养100天后形成株高3cm以上的完整植株；
(6)炼苗移栽：将完成步骤(5)的壮苗生根培养获得的高度大于3cm且具有2条以上根的无菌大苗接着进行炼苗移栽。
实施例3
一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)果实的选择：于浙江金线兰开花期，选择优良的浙江金线兰株系进行人工同株或异株授粉，授粉80天后,选择发育基本成熟、且外表颜色接近黄色或黄褐色的果实用于组织培养；
(2)无菌播种与萌发培养：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为70％的酒精浸泡35秒后，置于质量百分比浓度为0.08％升汞溶液中消毒12分钟，用无菌水冲洗5次后，切开果实，取出白色粉状或浆状种胚接种到种子萌发培养基上，所述种子萌发培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+80g/L土豆泥+150ml/L椰子水+30g/L白糖+6.5g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.6；接种后的培养瓶置于温度28℃、无光照条件下培养诱导种胚萌发；
种胚萌发培养32天后种胚膨大萌发形成白色、乳黄色的原球茎，55天后形成具有带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；
(3)无菌实生苗的健壮培养：将步骤(2)获得的带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗转入光照条件下进行17天的健壮培养，培养条件为光照度2500lx，光照8小时/天，培养温度22±2℃；
健壮培养后，实生苗的茎和叶的颜色由浅绿色、黄色转成绿色，茎节伸长具1-3节，茎节挺拔、叶片伸展，植株健壮，没有出现玻璃化，利于进行丛生芽增殖。
(4)丛生芽增殖培养：在无菌条件下，先将步骤(3)中获得的健壮的实生苗切割成带至少一个茎节的茎段或顶芽(所述茎段长度为1.0cm)，插入增殖培养基中诱导培养生成丛生芽；再将诱导培养生成丛生芽的植株分切成带至少一个茎节的顶芽或茎段，插入新的增殖培养基中进行至少一次继代增殖培养，每次继代增殖的培养周期为70天，每次继代增殖获得的丛生芽用于下一步骤的壮苗生根培养或者用于下一周期的继代增殖培养；整个培养过程中，培养温度为22±2℃，光照度为2200lx，光照10小时/天；所述增殖培养基由以下组分按照以下配比组成：MS基本培养基+2.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+1.0g/L LH+20g/L白糖+6.5g/L琼脂，pH值为5.6；
诱导培养后，茎段或顶芽在所述增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在新的增殖培养基上能进行继代增殖，增殖系数可达5.1倍，80天即可进行再次继代，周期短，繁殖速度快；
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)中获得的丛生芽切割成单株，接种到壮苗生根培养基上进行80天的壮苗生根培养，培养温度22±2℃，光照度2000lx，光照10小时/天；所述壮苗生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+2.0mg/L NAA+180g/L香蕉+50g/L马铃薯+1.5g/L活性炭+20g/L白糖+8g/L琼脂，pH值为5.4；
壮苗生根培养80天后形成株高3cm以上的完整植株；
(6)炼苗移栽：将完成步骤(5)的壮苗生根培养获得的高度大于3cm且具有2条以上根的无菌大苗接着进行炼苗移栽。
实施例4
一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)果实的选择：采集自广西的野生浙江金线兰自然授粉后，果实饱满、硬实、无病虫危害且外表为黄色或浅棕色的蒴果，用于组织培养；
(2)无菌播种与萌发培养：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为75％的酒精浸泡40秒后，置于质量百分比浓度为0.12％升汞溶液中消毒15分钟，用无菌水冲洗5次后，切开果实，取出白色粉状或浆状种胚接种到种子萌发培养基上，所述种子萌发培养基由以下组分按照以下配比组成：N6基本培养基+100g/L土豆泥+200ml/L椰子水+25g/L白糖+7.0g/L卡拉胶，pH值为5.8；接种后的培养瓶置于温度25℃左右、无光照条件下培养诱导种胚萌发；
种胚萌发培养32天后种胚膨大萌发形成白色、乳黄色的原球茎，55天后形成具有带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；
(3)无菌实生苗的健壮培养：将步骤(2)获得的带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗转入光照条件下进行20天的健壮培养，培养条件为光照度2300lx，光照9小时/天，培养温度22±2℃；
健壮培养后，实生苗的茎和叶的颜色由浅绿色、黄色转成绿色，茎节挺拔、叶片伸展，植株健壮，大大降低了玻璃化，利于进行丛生芽增殖。
(4)丛生芽增殖培养：在无菌条件下，先将步骤(3)中获得的健壮的实生苗切割成带至少一个茎节的茎段或顶芽(所述茎段长度为1.6cm)，插入增殖培养基中诱导培养生成丛生芽；再将诱导培养生成的丛生芽分切成带至少一个茎节的顶芽或茎段，插入新的增殖培养基中进行至少一次继代增殖培养，每次继代增殖的培养周期为85天，每次继代增殖获得的丛生芽用于下一步骤的壮苗生根培养或者用于下一周期的继代增殖培养；整个培养过程中，培养温度为22±2℃，光照度为2500lx，光照8小时/天；所述增殖培养基由以下组分按照以下配比组成：N6基本培养基+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+1.2g/L LH+25g/L白糖+7.0g/L卡拉胶，pH值为5.2；
诱导培养后，茎段或顶芽在所述增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在新的增殖培养基上能进行继代增殖，增殖系数可达4.4倍，85天即可进行再次继代，周期短，繁殖速度快；
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)中获得的丛生芽切割成单株，接种到壮苗生根培养基上进行85天的壮苗生根培养，培养温度22±2℃，光照度2500lx，光照8小时/天；所述壮苗生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+1.8mg/L NAA+200g/L香蕉+3.0g/L活性炭+15g/L白糖+6g/L卡拉胶，pH值为5.4；
壮苗生根培养85天后形成株高3cm以上的完整植株；
实施例5
一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)果实的选择：于浙江金线兰开花期，选择优良的浙江金线兰株系进行人工同株或异株授粉，授粉70天后,选择发育基本成熟、且外表颜色接近黄色或黄褐色的果实用于组织培养；
(2)无菌播种与萌发培养：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为75％的酒精浸泡30秒后，置于质量百分比浓度为0.15％升汞溶液中消毒8分钟，用无菌水冲洗干净4次后，切开果实，取出白色粉状或浆状种胚接种到种子萌发培养基上，所述种子萌发培养基由以下组分按照以下配比组成：N6基本培养基+200g/L土豆泥+50ml/L椰子水+22g/L白糖+6.5g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.6；接种后的培养瓶置于温度25℃、无光照条件下培养诱导种胚萌发；
种胚萌发培养28天后种胚膨大萌发形成白色、乳黄色的原球茎，70天后形成具有带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗；
(3)无菌实生苗的健壮培养：将步骤(2)获得的带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗转入光照条件下进行13天的健壮培养，培养条件为光照度2500lx，光照10小时/天，培养温度22±2℃；
健壮培养后，实生苗的茎和叶的颜色由浅绿色、黄色转成绿色，茎节挺拔、叶片伸展，植株健壮，大大降低了玻璃化，利于进行丛生芽增殖。
(4)丛生芽增殖培养：在无菌条件下，先将步骤(3)中获得的健壮的实生苗切割成带至少一个茎节的茎段或顶芽(所述茎段长度为1.3cm)，插入增殖培养基中诱导培养生成丛生芽；再将诱导培养生成的丛生芽分切成带至少一个茎节的顶芽或茎段，插入新的增殖培养基中进行至少一次继代增殖培养，每次继代增殖的培养周期为90天，每次继代增殖获得的丛生芽用于下一步骤的壮苗生根培养或者用于下一周期的继代增殖培养；整个培养过程中，培养温度为22±2℃，光照度为1300lx，光照10小时/天；所述增殖培养基由以下组分按照以下配比组成：N6基本培养基+1.2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2g/L LH+25g/L白糖+6.0g/L卡拉胶，pH值为5.4；
诱导培养后，茎段或顶芽在所述增殖培养基上能形成丛生芽，丛生芽在新的增殖培养基上能进行继代增殖，增殖系数可达3.5倍，90天即可进行再次继代，周期短，繁殖速度快；
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)中获得的丛生芽切割成单株，接种到壮苗生根培养基上进行85天的壮苗生根培养，培养温度22±2℃，光照度2500lx，光照10小时/天；所述壮苗生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+1.2mg/L NAA+150g/L香蕉+60g/L马铃薯+2.5g/L活性炭+20g/L白糖+5.8g/L卡拉胶，pH值为5.4；
壮苗生根培养85天后形成株高3cm以上的完整植株；
(6)炼苗移栽：将完成步骤(5)的壮苗生根培养获得的高度大于3cm且具有2条以上根的无菌大苗接着进行炼苗移栽。
在以上各实施例中：
表1 椰子汁与土豆泥配合对浙江金线兰原球茎分化小芽的影响
| 椰子汁浓度(mg/L) | 0 | 50 | 100 | 150 | 200 | 250 |
| 土豆泥g/L | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 分化率(％) | 30.3 | 93.7 | 98.1 | 95.1 | 96.3 | 45.4 |
对比试验表明50.0～200.0ml/L椰子汁能促进原球茎分化芽，小芽的叶片浅绿色，较厚；椰子汁大于200ml/L时，抑制原球茎分化小芽，原球茎易玻璃化而失去分化芽的能力。
表2 水解乳蛋白对丛生芽增殖的影响
| 水解乳蛋白浓度(mg/L) | 0 | 1.0 | 1.5 | 2.0 |
| 增殖倍数 | 2.1 | 5.2 | 4.9 | 3.7 |
添加1-2g/L水解乳蛋白有机添加物的培养基能促进丛生芽增殖和幼苗生长。
上述具体实施方式只是对本发明的技术方案进行详细解释，本发明并不只仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种浙江金线兰种子组织培养与快速育苗方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)果实的选择：于浙江金线兰开花期，选择优良的浙江金线兰株系进行人工同株或异株授粉，授粉70-80天后,选择发育基本成熟、且外表颜色接近黄色或黄褐色的果实用于组织培养；或者野外采集的野生浙江金线兰植株上的蒴果，选择果实外表颜色近黄色或黄褐色、且未开裂者用于组织培养；
(2)无菌播种与萌发培养：将步骤(1)中选取的果实用质量百分比浓度为70-85％的酒精浸泡30-45秒后，置于质量百分比浓度为0.08-0.15％升汞溶液中消毒8-15分钟，用无菌水冲洗干净后，切开果实，取出白色粉状或浆状种胚接种到种子萌发培养基上，所述种子萌发培养基由以下组分按照以下配比组成：MS或N6基本培养基+80-200g/L土豆泥+50-200ml/L椰子水+20-30g/L白糖或蔗糖+5.0-8.0g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.4-5.8；接种后的培养瓶置于温度20-28℃、无光照条件下培养诱导种胚萌发；
(3)无菌实生苗的健壮培养：将步骤(2)获得的带叶和茎的小芽或者具有叶、茎及胚根的无菌苗转入光照条件下进行10-20天的健壮培养，培养条件为光照度2000-2500lx，光照8-10小时/天，培养温度22±2℃；
(4)丛生芽增殖培养：在无菌条件下，先将步骤(3)中获得的健壮的实生苗切割成带至少一个茎节的茎段或顶芽，插入增殖培养基中诱导培养生成丛生芽；再将诱导培养生成的丛生芽分切成带至少一个茎节的顶芽或茎段，插入新的增殖培养基中进行至少一次继代增殖培养，每次继代增殖的培养周期为70-90天，每次继代增殖获得的丛生芽用于下一步骤的壮苗生根培养或者用于下一周期的继代增殖培养；整个培养过程中，培养温度为22±2℃，光照度为1300-2500lx，光照8-10小时/天；所述增殖培养基由以下组分按照以下配比组成：MS或N6基本培养基+1.0-2.5mg/L 6-BA+0.2-0.5mg/L NAA+1-2g/L LH(水解乳蛋白)+20-30g/L白糖或蔗糖+6-7g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.2-5.6；
(5)壮苗生根培养：将步骤(4)中获得的丛生芽切割成单株，接种到壮苗生根培养基上进行80-100天的壮苗生根培养，培养温度22±2℃，光照度2000-2500lx，光照8-10小时/天；所述壮苗生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+1.0-2.0mg/L NAA+100-280g/L香蕉+0-80g/L马铃薯+1.0-3.0g/L活性炭+15-20g/L白糖或蔗糖+6-8g/L琼脂或卡拉胶，pH值为5.2-5.6；
(6)炼苗移栽：将完成步骤(5)的壮苗生根培养获得的高度大于3cm且具有2条以上根的无菌大苗接着进行炼苗移栽。
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