CN116158349B - 一种金线兰离体扩繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，提供了一种金线兰离体扩繁的方法，包括以下步骤：(1)对金线兰当年生茎段消毒；(2)将消毒后的茎段进行不定芽诱导培养，壮苗‑生根培养后得到生根苗；(3)将生根苗进行炼苗移栽得到金线兰再生苗。本发明通过添加低浓度的植物生长调节剂与原生境生长的金线兰根际土壤中天然含有的香兰醇，培养获得了表型一致的金线兰再生植株。本发明通过在培养基中添加香兰醇保证了培养基中低浓度植物生长调节剂的使用，保证了较好的出芽率的同时能有效减少植株内外源激素的富集，保证药用安全性，且不受季节限制，能为天然药用生产的开展与野生金线兰的资源保护提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种金线兰离体扩繁的方法。
背景技术
金线兰(Anoectochilusroxburghii(wa11.)Lindl.)，又名花叶开唇兰、金线草、金线莲等，是一种兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)的多年生珍稀草本药用植物。金线兰全株均可入药，富含多糖、黄酮类化合物、生物碱等成分，具有清热解毒、降血压、抗衰老、提高机体免疫等多种功效，被视为珍贵药材，享有“药中之王”的美称。
近年来，随着对金线兰药用成分和临床应用研究的深入发展，金线兰野生资源一直处于供不应求的阶段，市场货源极度紧缺。加之人为的破坏性采挖，金线兰资源锐减，使金线兰处于濒临灭绝之境。然而，金线兰种子缺乏胚乳，自然条件下依赖于真菌共生，萌发率极低。生产上常采用分根繁殖或扦插繁殖，耗时长且繁殖系数低，难以形成规模种植。采用组织培养技术对金线莲进行繁殖，是对其资源保护的有效手段，同时也是解决目前市场大规模需求的重要途径。
为达到高效生产的目的，金线兰商品化生产利用组培技术耗时短的优势，常综合使用多种高浓度植物生长调节剂扩繁金线兰种苗，造成外源植物激素在植株体内积累残留，人大量食用此类农产品，会对身体造成一定的危害。因此，如何在保证食品安全性的前提下扩繁出高品质的金线兰成为当前急需解决的一个难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金线兰离体扩繁的方法，本发明在培养基中添加原生境生长的金线兰根际土壤中天然含有的香兰醇，使用了低浓度的植物生长调节剂，从根源上减少了外源植物激素的富集残留，并且本发明使用香兰醇作为外源添加物，对金线兰的生长繁殖具有促进作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种金线兰离体扩繁的方法，包括以下步骤：
(1)对金线兰当年生茎段消毒；
(2)将消毒后的茎段进行不定芽诱导培养，壮苗-生根培养后得到生根苗；
(3)将生根苗进行炼苗移栽得到金线兰再生苗。
优选的，步骤(1)中所述消毒前还包括洗涤的步骤，所述洗涤依次用活性洗涤剂、水进行；所述消毒依次用酒精、次氯酸钠、植物组织培养抗菌剂对洗涤后的茎段进行处理。
优选的，所述活性洗涤剂的冲洗次数为3～5次。
优选的，所述水冲洗的时间为2～4h。
优选的，所述酒精的体积百分比浓度为70～80％，所述酒精的消毒时间为60～90s。
优选的，所述次氯酸钠的有效氯浓度为0.05～0.15％，所述次氯酸钠的消毒时间为3～5min。
优选的，所述植物组织培养抗菌剂的体积百分比浓度为5～10％，所述植物组织培养抗菌剂的消毒时间为4～6min。
优选的，步骤(2)中所述不定芽诱导培养的培养基以MS固体培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：香蕉汁45～55g/L、蔗糖25～35g/L、6-BA0.1～0.3mg/L、香草醇10～30mg/L。
优选的，步骤(2)中所述壮苗-生根培养的培养基以1/2MS固体培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：香蕉汁45～55g/L、蔗糖25～35g/L、NAA0.1～0.3mg/L、AC0.1～0.3mg/L。
优选的，步骤(2)中所述不定芽诱导培养、壮苗-生根培养的培养条件为：培养温度23～27℃，光照强度2000～3000lx，光照周期12～16h/d。
优选的，所述不定芽诱导培养的时间为40～50d，所述壮苗-生根培养的时间为50～70d。
优选的，步骤(3)中所述炼苗移栽的步骤为：将生根苗转入温室中培养10～16d，然后移栽至栽培基质中继续培养。
优选的，所述栽培基质中的组分包括腐殖土和木屑，所述腐殖土和木屑的质量比为1:1～2。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1.本发明所述的一种金线兰离体扩繁的方法，通过添加低浓度的植物生长调节剂，从源头上减少了外源植物激素的富集残留，保证了金线兰的食品安全，且能为金线兰药用市场提供性状稳定、品质优良的种苗，亦可为金线兰野生资源的回归保护提供技术支撑。
2.本发明所述的一种利用金线兰离体扩繁的方法，首次在金线兰组培培养基中添加香兰醇，其中香兰醇能有效促进金线兰不定芽诱导的发生，以20mg/L的香兰醇效果最佳。香兰醇天然存在于原生境生长的金线兰根际土壤中，同时，香兰醇是联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会、欧盟委员会、美国食用香料和提取物制造协会等批准的食品用香料，少量添加不影响金线兰的食品安全性。
附图说明
图1为实施例1外植体茎段培养15d后的不定芽诱导情况；
图2为实施例1不定芽增殖培养30d后的生长情况；
图3为实施例1不定芽壮苗-生根培养60d后的生长情况；
图4为实施例1移栽成活的金线兰再生植株。
具体实施方式
本发明提供了一种金线兰离体扩繁的方法，包括以下步骤：
(1)对金线兰当年生茎段消毒；
(2)将消毒后的茎段进行不定芽诱导培养，壮苗-生根培养后得到生根苗；
(3)将生根苗进行炼苗移栽得到金线兰再生苗。
在本发明中，首先对金线兰当年生茎段消毒，优选的所述金线兰当年生茎段为从生长健壮、无病虫害的野生金线兰母株上采集得到。
在本发明中，在对金线兰当年生茎段消毒前还包括洗涤的步骤，所述洗涤依次用活性洗涤剂、水进行；所述活性洗涤剂包括洗洁精或洗衣粉，所述活性洗涤剂的冲洗次数为3～5次，优选为4次；所述水冲洗的时间为2～4h，优选为3h。
在本发明中，所述消毒依次用酒精、次氯酸钠、植物组织培养抗菌剂对洗涤后的茎段进行处理。
在本发明中，所述酒精的体积百分比浓度为70～80％，优选为72～78％，进一步优选为74～76％；所述酒精的消毒时间为60～90s，优选为65～85s，进一步优选为70～80s。
在本发明中，所述次氯酸钠的有效氯浓度为0.05～0.15％，优选为0.08～0.12％，进一步优选为0.09～0.11％；所述次氯酸钠的消毒时间为3～5min，优选为3.5～4.5min，进一步优选为4min。
在本发明中，所述植物组织培养抗菌剂的体积百分比浓度为5～10％，优选为6～9％，进一步优选为7～8％；所述植物组织培养抗菌剂的消毒时间为4～6min，优选为4.5～5.5min，进一步优选为5min；所述植物组织培养抗菌剂购自上海翊圣生物技术有限公司。
在本发明中，将消毒后的茎段进行不定芽诱导培养，壮苗-生根培养后得到生根苗。所述不定芽诱导培养的培养基以MS固体培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：香蕉汁45～55g/L、蔗糖25～35g/L、6-BA0.1～0.3mg/L、香草醇10～30mg/L。
在本发明中，所述不定芽诱导培养的培养基包括香蕉汁45～55g/L，优选为48～52g/L，进一步优选为49～51g/L。所述香蕉汁的制备方法为：称取50g香蕉，加入100mL水，置于榨汁机中充分搅碎后，用纱布过滤得到香蕉汁。
在本发明中，所述不定芽诱导培养的培养基包括蔗糖25～35g/L，优选为27～33g/L，进一步优选为28～31g/L。
在本发明中，所述不定芽诱导培养的培养基包括6-BA0.1～0.3mg/L，优选为0.15～0.25mg/L，进一步优选为0.18～0.22mg/L。
在本发明中，所述不定芽诱导培养的培养基包括香草醇10～30mg/L，优选为15～25mg/L，进一步优选为18～22mg/L。
在本发明中，所述壮苗-生根培养的培养基以1/2MS固体培养基为基础培养基，还包括以下浓度的组分：香蕉汁45～55g/L、蔗糖25～35g/L、NAA0.1～0.3mg/L、AC0.1～0.3mg/L。
在本发明中，所述壮苗-生根培养的培养基包括香蕉汁45～55g/L，优选为48～52g/L，进一步优选为49～51g/L。
在本发明中，所述壮苗-生根培养的培养基包括蔗糖25～35g/L，优选为27～33g/L，进一步优选为28～31g/L。
在本发明中，所述壮苗-生根培养的培养基包括NAA0.1～0.3mg/L，优选为0.15～0.25mg/L，进一步优选为0.18～0.22mg/L。
在本发明中，所述壮苗-生根培养的培养基包括AC0.1～0.3mg/L，优选为0.15～0.25mg/L，进一步优选为0.18～0.22mg/L。
在本发明中，所述不定芽诱导培养、壮苗-生根培养的培养条件为：培养温度23～27℃，优选为24～26℃，进一步优选为25℃；光照强度2000～3000lx，优选为2200～2800lx，进一步优选为2400～2600lx；光照周期12～16h/d，优选为13～15h/d，进一步优选为14h/d。
在本发明中，所述不定芽诱导培养的时间为40～50d，优选为42～48d，进一步优选为44～46d；所述壮苗-生根培养的时间为50～70d，优选为55～65d，进一步优选为58～62d。
在本发明中，将生根苗进行炼苗移栽得到金线兰再生苗；所述炼苗移栽的步骤为：将生根苗转入温室中培养10～16d，然后移栽至栽培基质中继续培养。
在本发明中，优选的在进行温室培养5～7d后向培养金线兰幼苗的组培瓶中注入覆盖培养基表面1cm深的无菌水，然后继续培养。
在本发明中，所述栽培基质中的组分包括腐殖土和木屑，所述腐殖土和木屑的质量比为1:1～2，优选为1:1.5。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种金线兰离体扩繁的方法，包括以下步骤：
(1)外植体选择与消毒：采集野生金线兰当年生茎段，用活性洗涤剂清洗表面泥土5次后，流水下冲洗2h；用体积百分比浓度为75％酒精消毒60s，无菌水洗涤6次；再用有效氯浓度为0.1％的次氯酸钠消毒5min，无菌水洗涤6次；最后用体积百分比浓度为8％的植物组织培养抗菌剂消毒6min，无菌水冲洗6次。用无菌滤纸吸干表面水分，切成1cm的带芽茎段，作为起始外植体备用。
(2)不定芽诱导：将步骤(1)中消毒处理后的茎段接种于添加香蕉汁(称取50g香蕉，加入100mL水，置于榨汁机中充分搅碎后，用纱布过滤即得香蕉汁)50g/L、蔗糖30g/L、6-BA0.2mg/L和香草醇20mg/L的MS固体培养基中，放置于光照周期16h/d、光照强度2500lx、温度25±2℃的培养间培养，15d后统计不定芽诱导率。培养15d后，茎段伤口部位诱导出白色的不定芽。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)中的不定芽继续培养30d后，白色不定芽转绿变深，且增殖数倍。
(4)壮苗与生根：将步骤(3)中增殖的不定芽接种于添加了50g/L香蕉汁、30g/L蔗糖、NAA0.2mg/L、AC0.2mg/L的1/2MS固体培养基中，放置于光照周期16h/d、光照强度2500lx、温度25±2℃的培养间培养。培养60d后，获得茎秆粗壮且生成数条根的健壮生根苗。
(5)炼苗与移栽：将步骤(4)中的生根苗连同广口组培瓶一起转入温室中放置1周，进行环境适应培养；
(6)将(5)中的广口组培瓶打开瓶盖，并注入覆盖培养基表面1cm深的无菌水，炼苗1周；
(7)将(6)中的组培苗经光照湿度适应培养后，洗去根部附着的培养基，并移栽至腐殖土和木屑(1:1)的栽培基质中，于温室中培养，成为与自然生长一致的金线兰再生植株。
实施例2
本实施例提供了一种金线兰离体扩繁的方法，包括以下步骤：
(1)外植体选择与消毒：采集野生金线兰当年生茎段，用活性洗涤剂清洗表面泥土3次后，流水下冲洗3h；用体积百分比浓度为70％酒精消毒90s，无菌水洗涤5次；再用有效氯浓度为0.05％的次氯酸钠消毒5min，无菌水洗涤5次；最后用体积百分比浓度为10％的植物组织培养抗菌剂消毒4min，无菌水冲洗5次。用无菌滤纸吸干表面水分，切成1cm的带芽茎段，作为起始外植体备用。
(2)不定芽诱导：将步骤(1)中消毒处理后的茎段接种于添加香蕉汁(称取50g香蕉，加入100mL水，置于榨汁机中充分搅碎后，用纱布过滤即得香蕉汁)45g/L、蔗糖35g/L、6-BA0.1mg/L和香草醇10mg/L的MS固体培养基中，放置于光照周期15h/d、光照强度2300lx、温度25±2℃的培养间培养，15d后统计不定芽诱导率。培养15d后，茎段伤口部位诱导出白色的不定芽。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)中的不定芽继续培养30d后，白色不定芽转绿变深，且增殖数倍。
(4)壮苗与生根：将步骤(3)中增殖的不定芽接种于添加了45g/L香蕉汁、35g/L蔗糖、NAA0.1mg/L、AC0.3mg/L的1/2MS固体培养基中，放置于光照周期15h/d、光照强度2300lx、温度25±2℃的培养间培养。培养60d后，获得茎秆粗壮且生成数条根的健壮生根苗。
(5)炼苗与移栽：将步骤(4)中的生根苗连同广口组培瓶一起转入温室中放置1周，进行环境适应培养；
(6)将(5)中的广口组培瓶打开瓶盖，并注入覆盖培养基表面1cm深的无菌水，炼苗1周；
(7)将(6)中的组培苗经光照湿度适应培养后，洗去根部附着的培养基，并移栽至腐殖土和木屑(1:2)的栽培基质中，于温室中培养，成为与自然生长一致的金线兰再生植株。
实施例3
本实施例提供了一种金线兰离体扩繁的方法，包括以下步骤：
(1)外植体选择与消毒：采集野生金线兰当年生茎段，用活性洗涤剂清洗表面泥土5次后，流水下冲洗2h；用体积百分比浓度为80％酒精消毒60s，无菌水洗涤5次；再用有效氯浓度为0.15％的次氯酸钠消毒3min，无菌水洗涤5次；最后用体积百分比浓度为5％的植物组织培养抗菌剂消毒6min，无菌水冲洗5次。用无菌滤纸吸干表面水分，切成1cm的带芽茎段，作为起始外植体备用。
(2)不定芽诱导：将步骤(1)中消毒处理后的茎段接种于添加香蕉汁(称取50g香蕉，加入100mL水，置于榨汁机中充分搅碎后，用纱布过滤即得香蕉汁)55g/L、蔗糖25g/L、6-BA0.3mg/L和香草醇30mg/L的MS固体培养基中，放置于光照周期14h/d、光照强度2800lx、温度25±2℃的培养间培养，15d后统计不定芽诱导率。培养15d后，茎段伤口部位诱导出白色的不定芽。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)中的不定芽继续培养30d后，白色不定芽转绿变深，且增殖数倍。
(4)壮苗与生根：将步骤(3)中增殖的不定芽接种于添加了55g/L香蕉汁、25g/L蔗糖、NAA0.3mg/L、AC0.1mg/L的1/2MS固体培养基中，放置于光照周期14h/d、光照强度2800lx、温度25±2℃的培养间培养。培养60d后，获得茎秆粗壮且生成数条根的健壮生根苗。
(5)炼苗与移栽：将步骤(4)中的生根苗连同广口组培瓶一起转入温室中放置1周，进行环境适应培养；
(6)将(5)中的广口组培瓶打开瓶盖，并注入覆盖培养基表面1cm深的无菌水，炼苗1周；
(7)将(6)中的组培苗经光照湿度适应培养后，洗去根部附着的培养基，并移栽至腐殖土和木屑(1:1)的栽培基质中，于温室中培养，成为与自然生长一致的金线兰再生植株。
实验例
采用实验例1的方法得到金线兰再生植株，培养过程中不定芽诱导图片见图1，不定芽增殖培养图片见图2，生根苗图片见图3，再生植株图片见图4。以实施例1的金线兰离体扩繁的方法为基础，在不定芽诱导培养阶段另外设置4组对照组，分别为不添加香兰醇组(CK)，添加香兰醇浓度为10mg/L(对照组1)，添加香兰醇浓度为30mg/L(对照组2)，添加香兰醇浓度为40mg/L(对照组3)，除香兰醇浓度不同外其余组分与操作步骤与实施例1均相同，5组处理每组处理接种30个外植体，设3次重复，探究香兰醇添加浓度对于不定芽诱导率的影响，培养15d后统计不定芽诱导率。其中，不定芽诱导率按诱导出不定芽的外植体数/接种的总外植体数×100％计算。结果见表1，由表1可知，添加20mg/L的香兰醇处理效果最佳，在保证低浓度激素诱导的前提下，接种15d后不定芽诱导率可达到29.47％。经壮苗生根培养后，植株正常生长，移栽后成活率高。本发明与现有的技术参数相比较，足以保证工厂化育苗生产的要求以及实现对野生金线兰的资源保护，可在应用中产生积极效果。
表1.不同浓度香兰醇对金线兰不定芽诱导的影响
由以上实施例可知，本发明提供了一种金线兰离体扩繁的方法，本发明使用低浓度的植物生长调节剂，从根源上减少了外源植物激素的富集残留，并且本发明使用香兰醇作为外源添加物，对金线兰的生长繁殖具有促进作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种金线兰离体扩繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体选择与消毒：采集野生金线兰当年生茎段，用活性洗涤剂清洗表面泥土5次后，流水下冲洗2h；用体积百分比浓度为75%酒精消毒60s，无菌水洗涤6次；再用有效氯浓度为0.1%的次氯酸钠消毒5min，无菌水洗涤6次；最后用体积百分比浓度为8%的植物组织培养抗菌剂消毒6min，无菌水冲洗6次；用无菌滤纸吸干表面水分，切成1cm的带芽茎段，作为起始外植体备用；
（2）不定芽诱导：将步骤(1)中消毒处理后的茎段接种于添加香蕉汁50g/L、蔗糖30g/L、6-BA 0.2mg/L和香草醇20-40mg/L的MS固体培养基中，放置于光照周期16h/d、光照强度2500lx、温度25±2℃的培养间培养，15d后统计不定芽诱导率；培养15d后，茎段伤口部位诱导出白色的不定芽；
所述香蕉汁的制备方法为：称取50g香蕉，加入100mL水，置于榨汁机中充分搅碎后，用纱布过滤即得香蕉汁；
（3）不定芽增殖：将步骤(2)中的不定芽继续培养30d后，白色不定芽转绿变深，且增殖数倍；
（4）壮苗与生根：将步骤(3)中增殖的不定芽接种于添加了50g/L香蕉汁、30g/L蔗糖、NAA 0.2mg/L、AC 0.2mg/L的1/2MS固体培养基中，放置于光照周期16h/d、光照强度2500lx、温度25±2℃的培养间培养；培养60d后，获得茎秆粗壮且生成数条根的健壮生根苗；
（5）炼苗与移栽：将步骤(4)中的生根苗连同广口组培瓶一起转入温室中放置1周，进行环境适应培养；
（6）将步骤(5)中的广口组培瓶打开瓶盖，并注入覆盖培养基表面1cm深的无菌水，炼苗1周；
（7）将步骤(6)中的组培苗经光照湿度适应培养后，洗去根部附着的培养基，并移栽至腐殖土和木屑的栽培基质中，于温室中培养，成为与自然生长一致的金线兰再生植株；
所述腐殖土和木屑的质量比为1:1。
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