CN104823846A - 浙江金线兰种苗的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，它能有效提高浙江金线兰的繁殖效率，防止试管苗出现徒长和玻璃化现象，从而获得大量浙江金线兰种苗，为其规模化生产应用奠定基础。所述方法包括外植体的准备阶段、初代诱导培养阶段、继代培养阶段、生根培养阶段和移栽种植阶段；初代诱导培养基和继代增殖培养基均由以下组分配比组成：MS+0.1-0.5mg/L TDZ+0.5-0.8mg/L6-BA+0.18-0.25mg/L NAA+50-100g/L土豆泥+0.2-0.6mg/L活性炭；生根培养基由以下组分配比组成：MS+0.6-1.5mg/L NAA+50-100g/L香蕉泥+0.4-1.0mg/L活性炭。
Description
技术领域
本发明涉及一种繁殖浙江金线兰种苗的方法，属于植物组织培养快速繁殖技术领域。
背景技术
浙江金线兰Anoectochilus zhejiangensis Z.Wei&Y.B.Chang又称浙江开唇兰，是我国珍稀濒危的兰科植物之一，已列入国家二级保护植物名录，浙江省珍稀濒危植物名录。野生分布于浙江(遂昌)、福建(建阳、将乐)、广西(龙胜)等地，生于海拔700-1200米的山坡或沟谷的密林下阴湿处。为我国传统名贵草药，民间应用广泛。
浙江金线兰为兰科开唇兰属植物，种子微小胚发育未成熟，自然条件下种子发芽率低，其生长对环境条件要求高，自然繁殖和生长缓慢。随着人们的采挖、生态环境的破坏，野生浙江金线兰资源已非常稀少，濒临灭绝。
发明内容
本发明的目的在于提供一种浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，克服现有尚未建立其种苗快速繁殖的方法，以解决其种苗紧缺、资源濒危的问题，本发明所提供的方法不仅能有效提高浙江金线兰的繁殖效率，还能防止试管苗出现徒长和玻璃化现象，从而获得大量浙江金线兰种苗，为其规模化生产应用奠定基础。
本发明的技术方案如下：
浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
采集浙江金线兰植株，遮荫培养15-30天；从其中选择开始恢复生长的植株，剪取地上部份的茎节，除去叶片，作为外植体；在超净工作台上，采用质量百分比浓度为9-11％的次氯酸钠溶液对所述外植体消毒8-15分钟，无菌水冲洗干净，沥干水分备用；
(2)初代诱导培养阶段
在无菌条件下，将步骤(1)中无菌处理好的外植体切成带一个茎节的茎段，所述茎段长度为0.4-1.2cm，将所述茎段插入初代诱导培养基中进行初代诱导培养，培养周期为40-70天，培养条件为光照1000-1500Lx的日光灯光照，光照周期为8-10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(3)继代培养阶段
将步骤(2)中初代诱导培养获得的带有萌发的腋芽或顶芽的外植体切成带一个腋芽或顶芽的茎段，所述茎段长度为0.4-1.2cm，将所述茎段插入继代增殖培养基中进行至少一次继代培养，每次继代培养的培养周期为90-100天；
(4)生根培养阶段
将步骤(3)中每次继代培养获得的小苗，转移接种到生根培养基中培养，培养周期为90-120天；
(5)移栽种植阶段
将步骤(4)中生根培养后获得的种苗，转移至温室大棚内炼苗10-30天，炼苗后将种苗取出洗净，种植在栽培基质中，置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，栽培湿度为60-90％，光照度为4000-7000Lx，栽培周期为120-180天；所述栽培基质为草炭土和分化黄壤土以2.0-2.5︰1的体积比例混合的混合物；
所述步骤(2)中的初代诱导培养基和步骤(3)中的继代增殖培养基均由以下组分按照以下配比组成：MS+0.1-0.5mg/L TDZ(噻苯隆)+0.5-0.8mg/L6-BA+0.18-0.25mg/L NAA+50-100g/L土豆泥+0.2-0.6mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60；
所述步骤(4)中的生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+0.6-1.5mg/L NAA+50-100g/L香蕉泥+0.4-1.0mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60；
其中，6-BA是6-苄氨基嘌呤；NAA是a-萘乙酸；TDZ是噻苯隆；
MS培养基的基本组成如下表所述：
所述步骤(3)和步骤(4)中的培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为10-12h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％。
进一步的，
步骤(1)外植体的准备阶段中，所述的浙江金线兰植株为野生或栽培的浙江金线兰植株；所述遮荫培养指将采集得到的浙江金线兰植株种植于网室内干净的河沙中进行遮荫培养,所述网室的网目为20-40目，选取遮荫培养后的叶片硬挺、茎节伸展的健壮植株，剪取其幼嫩茎节；用无菌水冲洗的次数为3-5次；每次冲洗的时间为1-2分钟；
步骤(2)初代诱导培养阶段和步骤(3)继代培养阶段中，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；所述茎段的形态学下端插入培养基中；所述继代培养的的次数为8-20次；
步骤(5)移栽种植阶段中，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照度为4000-5000Lx，湿度为45-60％。
本发明所提供的浙江金线兰种苗的快速繁殖方法对比现有技术有如下优点：
1)本发明率先开展了浙江金线兰人工快速繁殖的研究，为其规模化生产应用奠定基础，有助于解决市场对种苗需求问题。
2)通过继代增殖和壮苗培养，大大提高了浙江金线兰的繁殖系数，增强了小苗的生长势，提高了栽培成活率。
3)本发明提出的浙江金线兰组培快繁优化培养基针对性强、适用性好，腋芽的诱导率达90％以上，芽的增殖率每个培养周期达5倍以上，通过组织培养生产出的浙江金线兰种苗具有生长整齐、繁殖速度快等优点。
4)本发明能够在短期内生产出大量的生长整齐、健壮的小苗供生产栽培需要。
5)在以浙江金线兰茎段为外植体的无菌处理阶段，采用酒精和次氯酸钠进行二次灭菌，既能保证处理后的外植体具有较高成活率，又能有效降低外植体的污染率。
6)本发明由于在初代诱导培养阶段和继代培养阶段的培养基中添加适宜浓度的TDZ与6-BA配合使用，TDZ能有效解除浙江金线莲腋芽的休眠，诱导不定芽及腋芽的萌发，而TDZ和6-BA配合又起到良好的协同作用，因此既可提高单芽增殖数，又可有效缓解TDZ浓度过高引起的矮化现象和玻璃化现象，提高浙江金线兰的繁殖效率。
7)本发明由于将采集到的野生浙江金线兰植株或他处收集的浙江金线兰植株先经过网室遮荫培养后，再进行后续培养，不仅能有效降低污染率，而且大大提高了培养的成功率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和具体实施例来对本发明进行详细的说明。
具体实施方式如下：
浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
采集浙江金线兰植株，种植于网目为20-40目的网室内干净的普通河沙中遮荫培养,培养时间15-20天；从其中选择开始恢复生长、叶片硬挺、茎节伸展的健壮植株，剪取地上部份的幼嫩茎节，除去叶片，作为外植体；在超净工作台上，采用质量百分比浓度为9-11％的次氯酸钠溶液对所述外植体消毒8-15分钟，用无菌水冲洗3-5次；每次冲洗的时间为1-2分钟；沥干水分备用；
(2)初代诱导培养阶段
在无菌条件下，将步骤(1)中无菌处理好的外植体切成带一个茎节的茎段，所述茎段长度为0.4-1.2cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入初代诱导培养基中进行初代诱导培养，培养周期为40-70天，所述初代诱导培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+0.1-0.5mg/L TDZ(噻苯隆)+0.5-0.8mg/L 6-BA+0.18-0.25mg/LNAA+50-100g/L土豆泥+0.2-0.6mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60；培养条件为光照1000-1500Lx的日光灯光照，光照周期为8-10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(3)继代培养阶段
将步骤(2)中初代诱导培养获得的带有萌发的腋芽或顶芽的外植体切成带一个腋芽或顶芽的茎段，所述茎段长度为0.4-1.2cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入继代增殖培养基中进行至少1次继代培养，每次继代培养的培养周期为90-100天；继代培养次数为8-20次；所述继代增殖培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+0.1-0.5mg/LTDZ(噻苯隆)+0.5-0.8mg/L 6-BA+0.18-0.25mg/L NAA+50-100g/L土豆泥+0.2-0.6mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为10-12h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(4)生根培养阶段
将步骤(3)中每次继代培养获得的小苗，转移接种到生根培养基中培养，培养周期为90-120天；所述生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+0.6-1.5mg/L NAA+50-100g/L香蕉泥+0.4-1.0mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60。培养基的pH值为5.34-5.60；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为10-12h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(5)移栽种植阶段
将步骤(4)中生根培养后获得的种苗，转移至温室大棚内炼苗10-30天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照度为4000-5000Lx，湿度为45-60％，炼苗后将种苗取出洗净，种植在栽培基质中，置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，栽培湿度为60-90％，光照度为4000-7000Lx，栽培周期为120-180天；所述栽培基质为草炭土和分化黄壤土以2.0-2.5︰1的体积比例混合的混合物；
上述培养基中，各物质的浓度均指其在最终配制获得的营养液中所占浓度。
具体实施例如下：
实施例1(最佳实施例)
浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
采集野生浙江金线兰植株，种植于网目为25目的网室内干净的河沙中遮荫培养,培养15天；从其中选择开始恢复生长、叶片硬挺、茎节伸展的健壮植株，剪取地上部份的幼嫩茎节，除去叶片，作为外植体；在超净工作台上，采用质量百分比浓度为10％的次氯酸钠溶液对所述外植体消毒10分钟，用无菌水冲洗3次；每次冲洗的时间为2分钟；沥干水分备用；
(2)初代诱导培养阶段
在无菌条件下，将步骤(1)中无菌处理好的外植体切成带一个茎节的茎段，所述茎段长度为1.0cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入培养基中进行初代诱导培养，培养周期为40天，所述培养基组成为：MS+0.3mg/L TDZ+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭，培养基的pH值为5.47；培养条件为光照1000-1500Lx的日光灯光照，光照周期为9h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(3)继代培养阶段
将步骤(2)中初代诱导培养获得的带有萌发的腋芽或顶芽的外植体切成带一个腋芽或顶芽的茎段，所述茎段长度为1.0cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入培养基中进行至少1次继代培养，每次继代培养的培养周期为90天；继代培养次数为10次；所述培养基组成为：MS+0.3mg/L TDZ+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭，培养基的pH值为5.47；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为11h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(4)生根培养阶段
将步骤(3)中的继代培养获得的小苗，接种到培养基中培养，培养周期为120天；所述培养基组成为：MS+1.0mg/L NAA+90g/L香蕉泥+0.5mg/L活性炭，培养基的pH值为5.47；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为11h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(5)移栽种植阶段
将步骤(4)中生根培养后获得的种苗，转移至温室大棚内炼苗15天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照度为4000-5000Lx，湿度为45-60％，炼苗后将种苗取出洗净，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土和分化黄壤土以2.25︰1的体积比例混合的混合物；置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，栽培湿度为60-90％，光照度为4000-7000Lx，栽培周期为150天。
实施例2
浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
采集栽培的浙江金线兰植株，种植于网目为20目的网室内干净的河沙中遮荫培养,培养16天；从其中选择开始恢复生长、叶片硬挺、茎节伸展的健壮植株，剪取地上部份的幼嫩茎节，除去叶片，作为外植体；在超净工作台上，采用质量百分比浓度为9％的次氯酸钠溶液对所述外植体消毒8分钟，用无菌水冲洗3次；每次冲洗的时间为1分钟；沥干水分备用；
(2)初代诱导培养阶段
在无菌条件下，将步骤(1)中无菌处理好的外植体切成带一个茎节的茎段，所述茎段长度为0.9cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入培养基中进行初代诱导培养，培养周期为50天，所述培养基组成为：MS+0.3mg/L TDZ+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+70g/L土豆泥+0.4mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34；培养条件为光照1000-1500Lx的日光灯光照，光照周期为8h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％，培养周期为14天；
(3)继代培养阶段
将步骤(2)中初代诱导培养获得的带有萌发的腋芽或顶芽的外植体切成带一个腋芽或顶芽的茎段，所述茎段长度为0.9cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入培养基中进行至少1次继代培养，每次继代培养的培养周期为90天；继代培养次数为5次；所述培养基组成为：MS+0.3mg/L TDZ+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+70g/L土豆泥+0.4mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(4)生根培养阶段
将步骤(3)中的继代培养获得的小苗，接种到培养基中培养，培养周期为90天；所述培养基组成为：MS+0.8mg/L NAA+65g/L香蕉泥+0.4mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(5)移栽种植阶段
将步骤(4)中生根培养后获得的种苗，转移至温室大棚内炼苗14天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照度为4000-5000Lx，湿度为45-60％，炼苗后将种苗取出洗净，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土和分化黄壤土以2.0︰1的体积比例混合的混合物；置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，栽培湿度为60-90％，光照度为4000-7000Lx，栽培周期为120天。
实施例3
浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
采集野生浙江金线兰植株，种植于网目为40目的网室内干净的河沙中遮荫培养,培养20天；从其中选择开始恢复生长、叶片硬挺、茎节伸展的健壮植株，剪取地上部份的幼嫩茎节，除去叶片，作为外植体；在超净工作台上，采用质量百分比浓度为11％的次氯酸钠溶液对所述外植体消毒12分钟，用无菌水冲洗的次数均为5次；每次冲洗的时间为2分钟；沥干水分备用；
(2)初代诱导培养阶段
在无菌条件下，将步骤(1)中无菌处理好的外植体切成带一个茎节的茎段，所述茎段长度为1.1cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入培养基中进行初代诱导培养，培养周期为70天，所述培养基组成为：MS+0.3mg/L TDZ+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.5mg/L活性炭，培养基的pH值为5.60；培养条件为光照1000-1500Lx的日光灯光照，光照周期为10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％，培养周期为16天；
(3)继代培养阶段
将步骤(2)中初代诱导培养获得的带有萌发的腋芽或顶芽的外植体切成带一个腋芽或顶芽的茎段，所述茎段长度为1.1cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入培养基中进行至少1次继代培养，每次继代培养的培养周期为100天；继代培养次数为15次；所述培养基组成为：MS+0.3mg/L TDZ+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.5mg/L活性炭，培养基的pH值为5.60；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为12h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(4)生根培养阶段
将步骤(3)中的继代培养获得的小苗，接种到培养基中培养，培养周期为110天；所述培养基组成为：MS+1.5mg/L NAA+50g/L香蕉泥+0.6mg/L活性炭，培养基的pH值为5.60；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为12h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(5)移栽种植阶段
将步骤(4)中生根培养后获得的种苗，转移至温室大棚内炼苗16天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照度为4000-5000Lx，湿度为45-60％，炼苗后将种苗取出洗净，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土和分化黄壤土以2.5︰1的体积比例混合的混合物；置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，栽培湿度为60-90％，光照度为4000-7000Lx，栽培周期为180天。
实施例4
浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
采集野生浙江金线兰植株，种植于网目为30目的网室内干净的河沙中遮荫培养,培养时间17天；从其中选择开始恢复生长、叶片硬挺、茎节伸展的健壮植株，剪取地上部份的幼嫩茎节，除去叶片，作为外植体；在超净工作台上，采用质量百分比浓度为9％的次氯酸钠溶液对所述外植体消毒12分钟，用无菌水冲洗的次数均为3次；每次冲洗的时间为2分钟；沥干水分备用；
(2)初代诱导培养阶段
在无菌条件下，将步骤(1)中无菌处理好的外植体切成带一个茎节的茎段，所述茎段长度为0.6cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入培养基中进行初代诱导培养，培养周期为60天，所述培养基组成为：MS+0.1mg/L TDZ+0.6mg/L6-BA+0.25mg/LNAA+100g/L土豆泥+0.6mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34；培养条件为光照1000-1500Lx的日光灯光照，光照周期为10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(3)继代培养阶段
将步骤(2)中初代诱导培养获得的带有萌发的腋芽或顶芽的外植体切成带一个腋芽或顶芽的茎段，所述茎段长度为0.6cm，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；将所述茎段的形态学下端插入培养基中进行至少1次继代培养，每次继代培养的培养周期为100天；继代培养次数为15次；所述培养基组成为：MS+0.1mg/L TDZ+0.6mg/L6-BA+0.25mg/LNAA+100g/L土豆泥+0.6mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为12h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(4)生根培养阶段
将步骤(3)中的继代培养获得的小苗，接种到培养基中培养，培养周期为120天；所述培养基组成为：MS+0.6mg/L NAA+100g/L香蕉泥+0.6mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为12h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(5)移栽种植阶段
将步骤(4)中生根培养后获得的种苗，转移至温室大棚内炼苗14天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照度为4000-5000Lx，湿度为45-60％，炼苗后将种苗取出洗净，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土和分化黄壤土以2.5︰1的体积比例混合的混合物；置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，栽培湿度为60-90％，光照度为4000-7000Lx，栽培周期为120天。
实施例5
浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
采集栽培的浙江金线兰植株，种植于网目为35目的网室内干净的河沙中遮荫培养,培养时间18天；从其中选择开始恢复生长、叶片硬挺、茎节伸展的健壮植株，剪取地上部份的幼嫩茎节，除去叶片，作为外植体；在超净工作台上，采用质量百分比浓度为11％的次氯酸钠溶液对所述外植体消毒8分钟，用无菌水冲洗的次数均为5次；每次冲洗的时间为1分钟；沥干水分备用；
(2)初代诱导培养阶段
在无菌条件下，将步骤(1)中无菌处理好的外植体切成带一个茎节的茎段，所述茎段长度为1.1cm，所述茎段的生物学下端的长度大于生物学上端的长度；将所述茎段的生物学下端插入培养基中进行初代诱导培养，培养周期为55天，所述培养基组成为：MS+0.12mg/L TDZ+0.7mg/L 6-BA+0.18mg/L NAA+55g/L土豆泥+0.4mg/L活性炭，培养基的pH值为5.60；培养条件为光照1000-1500Lx的日光灯光照，光照周期为8h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％，培养周期为16天；
(3)继代培养阶段
将步骤(2)中初代诱导培养获得的带有萌发的腋芽或顶芽的外植体切成带一个腋芽或顶芽的茎段，所述茎段长度为1.1cm，所述茎段的生物学下端的长度大于生物学上端的长度；将所述茎段的生物学下端插入培养基中进行至少1次继代培养，每次继代培养的培养周期为90天；继代培养次数为5次；所述培养基组成为：MS+0.12mg/L TDZ+0.7mg/L 6-BA+0.18mg/L NAA+55g/L土豆泥+0.4mg/L活性炭，培养基的pH值为5.60；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(4)生根培养阶段
将步骤(3)中的继代培养获得的小苗，接种到培养基中培养，培养周期为100天；所述培养基组成为：MS+1.2mg/L NAA+55g/L香蕉泥+0.4mg/L活性炭，培养基的pH值为5.60；培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(5)移栽种植阶段
将步骤(4)中生根培养后获得的种苗，转移至温室大棚内炼苗16天，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照度为4000-5000Lx，湿度为45-60％，炼苗后将种苗取出洗净，种植在栽培基质中，所述栽培基质为草炭土和分化黄壤土以2.0︰1的体积比例混合的混合物；置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，栽培湿度为60-90％，光照度为4000-7000Lx，栽培周期为180天。
在以上各实施例中：
一、理想外植体选择
实施例组：按照实施例1的步骤方法，采集野生浙江金线兰植株或者栽培浙江金线兰植株，种植于干净河沙中遮荫培养15-20天；从其中选择开始恢复生长的植株，剪取地上部份的茎节，除去叶片，作为外植体，进行培养；
对照组：对照组与实施例组的区别在于：直接采用采到的野生植株或栽培植株进行培养，而不经过网室遮荫培养。
将两组浙江金线兰的茎段，经过相同灭菌时间后，接种到相同的初代培养基上进行初代诱导培养，比较不同种类茎节对污染率和成活率的影响，筛选出适合作外植体的培养方法，为下一步无菌体系的建立奠定基础。每种处理50个茎段，三次重复，结果见表1。
表1 不同种类茎节对污染率和成活率的影响
从表1可知，经过遮荫培养的浙江金线兰植株作为外植体污染率比对照组低，并且成活率较对照组高，可达88.67％，因此在所选择的两组外植体当中，浙江金线兰植株经过遮荫过渡种植能有效降低污染率，可见经过网室遮荫培养后的植株是更加理想的外植体。
二、初代诱导培养阶段和继代培养阶段的培养基的筛选
采集浙江金线兰植株，按照实施例1步骤(1)-(3)的方法进行培养，其中仅对初代诱导培养基和继代增殖培养基的TDZ和6-BA组分含量进行调整，其余组分含量不变，配制成9组不同的培养基，分9组实验组进行对比实验。各实验组除采用的培养基不同外，其余步骤均与实施例1相同(其中第5组培养基与实施例1完全相同)。每个实验组50瓶，每瓶接种20株，从无污染的瓶中随机挑选20瓶，分别统计平均单芽增殖数、不定芽高度和节间长度，三次重复，结果见表2。
第1-9组实验组的初代诱导培养基和继代增殖培养基分别如下：
第1组：MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭；
第2组：MS+0.1mg/L TDZ+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭；
第3组：MS+0.2mg/LTDZ+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭；
第4组：MS+0.2mg/L TDZ+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭；
第5组：MS+0.3mg/L TDZ+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭(与实施例1相同)；
第6组：MS+0.3mg/L TDZ+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭；
第7组：MS+0.3mg/L TDZ+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭；
第8组：MS+0.4mg/L TDZ+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭；
第9组：MS+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭。
表2 初代诱导培养阶段和继代培养阶段的适宜培养基筛选
表2中第1-9组培养基中均能诱导不定芽增殖，但增殖不定芽的数量、不定芽高度及节间长度均存在差异。
培养基中TDZ浓度从0不断升高至0.3mg/L时，不定芽高度和节间长度均有所增加，单芽增殖数也随之增加；而TDZ浓度由0.3升高至0.5时，单芽增殖数虽然较高，但不定芽高度和节间长度又逐渐下降，出现矮化现象。当培养基中TDZ浓度达到0.3mg/L时，不定芽高度均达到5cm以上，节间长度均达到0.5cm以上，同时平均单芽增殖数达到4株以上，由此可以看出，5号-7号培养基更适宜作为优选初代诱导培养阶段和继代培养阶段的增殖培养基采用。即TDZ浓度为0.3mg/L，6-BA浓度在0.5-0.8mg/L之间是最优的选择。
此外，培养基中TDZ与6-BA配合使用，可以有效缓解TDZ浓度过高引起的矮化现象和玻璃化现象，而不添加TDZ及添加低浓度TDZ时，即使6-BA浓度适宜，单芽增殖数较低，不定芽高度和节间长度均不理想，且长势差，分生力低。可见，TDZ能有效解除浙江金线莲腋芽的休眠，诱导不定芽及腋芽的萌发，在浙江金线莲组培快繁中，TDZ和6-BA有很好的协同作用。TDZ含量过低作用效果不明显，含量高增殖数高，但易使不定芽矮化并发送玻璃苗等畸形现象，同时还出现丛生芽现象，分不出单个完整的有效芽，易产生叶片卷曲、植株矮小的无效芽。
当培养基中TDZ浓度达到0.3mg/L时，逐步将6-BA浓度从0.5mg/L提高到0.8mg/L，其中，当6-BA浓度为0.5mg/L或者0.6mg/L时，节间长度出现明显增长，均达到0.7cm以上，特别是当6-BA浓度为0.5mg/L时，平均单芽增殖数达到5.04株，为各培养基中的最高值，由此可以看出，对照6号和7号培养基，与实施例1相对应的5号培养基最适宜作为初代诱导培养阶段和继代培养阶段的增殖培养基。
三、生根培养阶段的培养基的筛选
将各实施例1-5继代培养获得的小苗，接种到各实施例的生根培养阶段的培养基中进行生根培养；每次处理接种50瓶，从无污染的瓶中随机挑选20瓶，分别统计小苗生根率，三次重复。
表3——生根培养阶段各实施例的小苗生根率
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| 小苗生根率 | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ |
| 平均根数/株 | 3 | 3 | 2 | 2 | 2 |
从表3的实验数据可以明显看出：经生根培养后，本发明的各实施例的小苗生根率均达100％，平均每株2.4条根。
四、浙江金线兰干品有效成分含量的实验数据
将各实施例1-5生根培养后获得的种苗，接着进行各实施例的移栽种植阶段，即转移至温室大棚内炼苗，炼苗后将种苗取出洗净，种植在对应栽培基质中栽培，采收后，经过恒温干燥加工获得浙江金线兰干品。
表4——各实施例的浙江金线兰干品有效成分含量
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
| 总多糖(以葡萄糖计) | 4.01％ | 3.97％ | 4.11％ | 4.03％ | 4.13％ |
| 总黄酮(以芦丁计) | 0.81％ | 0.77％ | 0.80％ | 0.79％ | 0.81％ |
从表4的实验数据可以明显看出：本发明的各实施例的浙江金线兰经恒温干燥后，其干品的主要化学成分如下：总多糖(以葡萄糖计)最高可达4.13％，总黄酮(以芦丁计)最高可达0.7％，与野生浙江金线兰总多糖和总黄酮含量相近，总多糖平均值(4.05％)与3份野生浙江金线兰总多糖的平均值(4.03％)相近，总黄酮平均值(0.796％)略高于3份野生浙江金线兰总黄酮平均值(0.778％)相近。
上述具体实施方式只是对本发明的技术方案进行详细解释，本发明并不只仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
采集浙江金线兰植株，遮荫培养15-30天；从其中选择开始恢复生长的植株，剪取地上部份的茎节，除去叶片，作为外植体；在超净工作台上，采用质量百分比浓度为9-11％的次氯酸钠溶液对所述外植体消毒8-15分钟，无菌水冲洗干净，沥干水分备用；
(2)初代诱导培养阶段
在无菌条件下，将步骤(1)中无菌处理好的外植体切成带一个茎节的茎段，所述茎段长度为0.4-1.2cm，将所述茎段插入初代诱导培养基中进行初代诱导培养，培养周期为40-70天，培养条件为光照1000-1500Lx的日光灯光照，光照周期为8-10h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％；
(3)继代培养阶段
将步骤(2)中初代诱导培养获得的带有萌发的腋芽或顶芽的外植体切成带一个腋芽或顶芽的茎段，所述茎段长度为0.4-1.2cm，将所述茎段插入继代增殖培养基中进行至少一次继代培养，每次继代培养的培养周期为90-100天；
(4)生根培养阶段
将步骤(3)中每次继代培养获得的小苗，转移接种到生根培养基中培养，培养周期为90-120天；
(5)移栽种植阶段
将步骤(4)中生根培养后获得的种苗，转移至温室大棚内炼苗10-30天，炼苗后将种苗取出洗净，种植在栽培基质中，置于生态林下或可控温湿度的设施大棚内，栽培环境温度15-32℃，栽培湿度为60-90％，光照度为4000-7000Lx，栽培周期为120-180天；所述栽培基质为草炭土和分化黄壤土以2.0-2.5︰1的体积比例混合的混合物；
所述步骤(2)中的初代诱导培养基和步骤(3)中的继代增殖培养基均由以下组分按照以下配比组成：MS+0.1-0.5mg/L TDZ(噻苯隆)+0.5-0.8mg/L6-BA+0.18-0.25mg/L NAA+50-100g/L土豆泥+0.2-0.6mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60；
所述步骤(4)中的生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+0.6-1.5mg/L NAA+50-100g/L香蕉泥+0.4-1.0mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60；
所述步骤(3)和步骤(4)中的培养条件为光照2000-3000Lx的日光灯光照，光照周期为10-12h/d，培养温度为23±2℃，培养环境湿度为40-50％。
2.根据权利要求1所述的浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，其特征在于：
步骤(1)外植体的准备阶段中，所述的浙江金线兰植株为野生浙江金线兰或栽培浙江金线兰的植株；所述遮荫培养指将采集得到的浙江金线兰植株种植于网室内干净的河沙中进行遮荫培养,所述网室的网目为20-40目，选取遮荫培养后的叶片硬挺、茎节伸展的健壮植株，剪取其幼嫩茎节；用无菌水冲洗的次数为3-5次；每次冲洗的时间为1-2分钟；
步骤(2)初代诱导培养阶段和步骤(3)继代培养阶段中，所述茎段的形态学下端的长度大于形态学上端的长度；所述茎段的形态学下端插入培养基中；所述继代培养的的次数为8-20次；
步骤(5)移栽种植阶段中，炼苗的大棚环境条件要求温度为20-30℃，光照度为4000-5000Lx，湿度为45-60％。
3.根据权利要求1或2所述的浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，其特征在于：
所述步骤(2)中的初代诱导培养基和步骤(3)中的继代增殖培养基均由以下组分按照以下配比组成：MS+0.3mg/L TDZ(噻苯隆)+0.5-0.8mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60。
4.根据权利要求3所述的浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，其特征在于：
所述步骤(2)中的初代诱导培养基和步骤(3)中的继代增殖培养基均由以下组分按照以下配比组成：MS+0.3mg/L TDZ(噻苯隆)+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+50g/L土豆泥+0.2mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60。
5.根据权利要求3所述的浙江金线兰种苗的快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(4)中的生根培养基由以下组分按照以下配比组成：MS+1.2mg/LNAA+90g/L香蕉泥+0.5mg/L活性炭，培养基的pH值为5.34-5.60。
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