CN109588312A - 一种虾脊兰植株再生体系建立的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种虾脊兰植株再生体系建立的方法，属于植物组织培养技术领域。其中包含以虾脊兰未成熟种胚作为外植体，依次经过种子灭菌、原球茎诱导、生根诱导得到完整虾脊兰植株的过程。所述种子灭菌溶液为75%酒精和0.1%升汞溶液；所述植株再生体系培养基为MS培养基上添加了NAA。本发明方法可使虾脊兰属植物再生，对后期虾脊兰种质资源扩繁及保存极其重要，可为虾脊兰属植物及兰科植物种子萌发难题的解决提供研究材料和参考，为园林及药用等植物资源开发及保护生物学研究提供基础资料。

Description

一种虾脊兰植株再生体系建立的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种虾脊兰植株再生体系的建立方法。

背景技术

虾脊兰属Calanthe R.Br.植物隶属兰科(Orchidaceae)，为多年生地生草本植物，全球约150种，我国有49种和5变种，主产于长江流域及以南地区。虾脊兰属植物形态多样、花色丰富、花型奇特，具有极高的观赏价值，有“兰中西施”的美誉。虾脊兰属植物同时具有较好的药用价值，以全草、根、假鳞茎或根茎入药，具有清热解毒、润肺止咳、活血散结和止痛消肿等功效，可用于瘰疬、淋巴结核、跌打损伤、腰肋疼痛、扁桃体炎、肌腱拉伤、脱肛和痔疮等的治疗。此外有报道称，同属内某些虾脊兰乙酸乙酯提取物对多种肿瘤细胞株具有显著细胞毒作用，相关酶水解产物具有抗白血病作用，同时，在虾脊兰属植物中还发现吲哚苷以及具有生理活性的生物碱，这些生物碱的存在使虾脊兰在传统中药中有抗炎、抗菌、抗毒素等作用。

兰科植物是生物多样性保护的旗舰类群之一，虾脊兰属作为兰科植物的一种，在中国物种红色名录第一卷将其全部物种列为珍稀濒危物种。2017年中国高等植物受威胁名录中，受威胁物种，共3879种，其中28种虾脊兰属植物在列。虾脊兰种子本身存在发芽抑制物质、遗传因素、休眠、向胚供给水和氧气受种皮机械阻力等因素，使其萌发困难。通过植物组织培养，促进虾脊兰植物种子萌发并形成完整植株，对后期虾脊兰种质资源扩繁及保存极其重要，可为虾脊兰属植物种子萌发难题的解决提供参考，同时为其在园林及药用等资源开发及保护生物学研究提供基础资料。

发明内容

本发明提供一种虾脊兰植株再生体系建立的方法，通过植物组织培养的方法完成。

本发明技术方案：

一种虾脊兰植株再生体系建立的方法，包括以下步骤：

1)种子的选择：野外采集未成熟虾脊兰蒴果；

2)种子的灭菌：将步骤1)所采集荚果进行表面清洗及灭菌消毒，经灭菌后，获得的种荚内部的种子作为外植体；

3)原球茎诱导：将步骤2)得到的外植体均匀撒播至种子诱导萌发培养基中进行培养，得到虾脊兰原球茎；

4)诱导植株生根：将步骤3)得到的虾脊兰原球茎接到诱导生根培养基中培养得到虾脊兰完整植株；

完成虾脊兰植株再生体系的建立。

优选地，所述步骤1)所选虾脊兰未成熟荚果为健康完整，未被蚊虫蛀咬破坏的蒴果。

优选地，所述步骤2)灭菌方法为依次经过流水冲洗、70％-80％酒精、0.1％-0.2％氯化汞溶液灭菌。

优选地，所述步骤3)培养温度25±2℃，光照强度900-1100lx，光照时间12-14h/d，培养时间为120d。

优选地，所述步骤3)种子诱导萌发培养基包括基础培养基和其他添加物，所述基础培养基为花宝1号或MS或1/2MS，所述中其他添加物为蛋白胨或6-BA或NAA 或TDZ或其组合，所述其他添加物在培养基的含量为0.001-3000mg/L。

进一步优选地，所述步骤3)种子诱导萌发培养基包括基础培养基和其他添加物，所述基础培养基为MS，所述其他添加物为NAA，NAA的加入量为0.02mg/L。

进一步优选地，所述步骤3)种子诱导萌发培养基包括基础培养基和其他添加物，所述基础培养基为花宝1号，所述其他添加物为蛋白胨，蛋白胨的加入量为1-4g/L。

优选地，所述步骤3)种子诱导萌发培养基包括基础培养基和其他添加物，所述基础培养基为1/2MS，所述其他添加物为TDZ，TDZ的加入量为0.01-0.3mg/L。

优选地，所述步骤4)诱导生根培养基为MS基础上添加了植物生长调节剂NAA, 添加浓度为0-2mg/L。

进一步优选地，所述培养基中植物生长调节剂NAA浓度为0.02mg/L。

进一步优选地：所述诱导生根培养基中NAA添加浓度为0.02mg/L。

本发明有益效果：

1、本发明提供了濒危兰科药用植物虾脊兰的植株再生体系建立方法。该方法以虾脊兰未成熟种子为外植体，通过筛选对比，发现培养基适宜情况下，虾脊兰种子可在同一培养基上完成原球茎诱导及及形成完整再生植株过程。与其他兰科组培再生诱导过程相比，可相应减少了继代转接所需劳动力；同时以未成熟种子进行离体培养优势在于诱导分化能力强，长期继代过程不易退化，可获得稳定的再生植株，可应用于虾脊兰工厂化育苗生产，满足其在观赏花卉及药用市场需要，解决市场需求与野生植株日益减少的困境之间的矛盾。

2、本发明通过培养添加生物生长调节剂及添加物的选择，筛选出适宜的植物生长调节剂成分，诱导虾脊兰种子一步成苗，获得稳定的再生植株。为濒危药用植物虾脊兰属植物扩繁及种质资源保存提供无菌材料，拓宽虾脊兰的发展前景，促进其在分子生物学、细胞生物学和基因工程研究，对育种相关工作起着关键性的指导作用。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

图1萌发前期淡黄色种胚；

图2未见萌发或死亡的虾脊兰种胚；

图3虾脊兰原球茎；

图4虾脊兰幼苗；

图5未生根虾脊兰植株；

图6虾脊兰再生植株；

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

MS基本培养基：可参照文献(Murashige T,Skoog F.A revised medium forrapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant,1962,15:473-497)配制。

一种虾脊兰一步成苗的方法，包含以下步骤：

1)外植体获得及灭菌：

野外采集虾脊兰未成熟的果荚，依次经清洁剂流水冲洗、75％的酒精、0.1％升汞溶液灭菌。

2)原球茎诱导：

切开灭菌后的果荚，将未成熟虾脊兰种子作为外植体；将所述的外植体置于原球茎诱导培养基中培养，获得虾脊兰原球茎。

所述步骤2)原球茎诱导方法：将步骤1)灭过菌的虾脊兰果荚，于无菌操作台切开，将种子撒播在原球茎诱导培养中，在培养温度25℃±2，光照强度1000Lx，光照时间12h/d的条件下，培养120d，种胚吸水、膨大变黄、黄绿，最终形成具有生长点的原球茎(如图3)，原球茎诱导率为60％，培养过程中所述原球茎诱导培养基为MS基础上添加了NAA，NAA添加浓度为0.02mg/L。

3)诱导生根：

将所述步骤2)诱导得到的虾脊兰原球茎继续培养，获得虾脊兰完整植株。

所述步骤3)诱导生根方法：将虾脊兰原球茎不进行转接，继续维持在所述步骤 2)培养基中进行培养，培养条件相同，继续培养60d，原球茎逐渐萌发、成苗(如图4)、生根形成完整植株(如图6)，植株再生率为100％。

实施例2

1)外植体获得及灭菌：

野外采集虾脊兰未成熟的果荚，依次经清洁剂流水冲洗、75％的酒精、0.1％升汞溶液灭菌。

2)原球茎诱导：

切开灭菌后的果荚，将未成熟虾脊兰种子作为外植体；将所述的外植体置于原球茎诱导培养基中培养，获得虾脊兰原球茎。

所述步骤2)原球茎诱导方法：将步骤1)灭过菌的虾脊兰果荚，于无菌操作台切开，将种子撒播在原球茎诱导培养中，在培养温度25℃±2，光照强度1000Lx，光照时间12h/d的条件下，培养120d，体视显微镜下观察，大部分虾脊兰种子种胚已开始进入萌发前期，种胚呈淡黄色(如图1)，最终形成具有生长点的原球茎，原球茎诱导率为20％，培养过程中所述原球茎诱导培养基为花宝1号+蛋白胨，花宝1号添加浓度为3g/L，蛋白胨添加浓度为3g/L。

3)诱导生根：

所述步骤2)诱导得到的虾脊兰原球茎，转接到诱导生根培养基中，获得虾脊兰植株。

所述步骤3)诱导生根方法：将虾脊兰原球茎转接到诱导生根的培养基中，在培养温度25℃±2，光照强度1000Lx，光照时间12h/d的条件下，培养30d，原球茎逐渐萌发、成幼苗，植株再生率为100％，但未见植株生根现象。培养过程中所述诱导生根培养基为MS培养基。

实施例3

1)外植体获得及灭菌：

野外采集虾脊兰未成熟的果荚，依次经清洁剂流水冲洗、75％的酒精、0.1％升汞溶液灭菌。

2)原球茎诱导：

切开灭菌后的果荚，将未成熟虾脊兰种子作为外植体；将所述的外植体置于原球茎诱导培养基中培养，获得虾脊兰原球茎。

所述步骤2)原球茎诱导方法：将步骤1)灭过菌的虾脊兰果荚，于无菌操作台切开，将种子撒播在原球茎诱导培养中，在培养温度25℃±2，光照强度1000Lx，光照时间12h/d的条件下，培养120d，体视显微镜下观察，种胚未见萌发(如图2)，培养过程中所述原球茎诱导培养基为MS+蛋白胨。

3)诱导生根：

所述步骤2)未萌发的种子，转接到诱导生根培养基中，获得虾脊兰完整植株。

所述步骤3)获得完整植株方法：将虾脊兰未萌发种子转接到诱导生根的培养基中，在培养温度25℃±2，光照强度1000Lx，光照时间12h/d的条件下，培养60d，种子逐渐萌发、成苗、生根形成完整植株，植株再生率为70％，培养过程中所述诱导生根培养基为MS添加了NAA，所述培养基中NAA添加浓度为0.02mg/L。

实施例4

MS基本培养基：可参照文献(Murashige T,Skoog F.A revised medium forrapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant,1962,15:473-497)配制。

1)外植体获得及灭菌：

野外采集虾脊兰未成熟的果荚，依次经清洁剂流水冲洗、75％的酒精、0.1％升汞溶液灭菌。

2)原球茎诱导：

切开灭菌后的果荚，将未成熟虾脊兰种子作为外植体；将所述的外植体置于原球茎诱导培养基中培养，获得虾脊兰原球茎。

所述步骤2)原球茎诱导方法：将步骤1)灭过菌的虾脊兰果荚，于无菌操作台切开，将种子撒播在原球茎诱导培养中，在培养温度25℃±2，光照强度1000Lx，光照时间12h/d的条件下，培养120d，种胚吸水、膨大变黄、黄绿，最终形成具有生长点的原球茎，原球茎诱导率为20％，培养过程中所述原球茎诱导培养基为1/2MS基础上添加了TDZ，TDZ添加浓度为0.2mg/L。

3)诱导生根：

所述步骤2)诱导得到的虾脊兰原球茎，转接到诱导生根培养基中，未获得虾脊兰完整植株。

所述步骤3)诱导生根方法：将虾脊兰原球茎转接到诱导生根的培养基中，在培养温度25℃±2，光照强度1000Lx，光照时间12h/d的条件下，培养60d，原球茎逐渐萌发、成苗(如图5)，植株再生率为100％，但未见生根，培养过程中所述诱导生根培养基为MS，未添加任何植物生长调节剂。

由实施例1-4可知：原球茎诱导萌发最优培养基为MS基础上添加了生物生长调节剂NAA，添加浓度为0.02mg/L，该培养条件下能够诱导虾脊兰种胚形成原球茎并萌发，效率达60％；诱导生根最适培养基亦为MS基础上添加0.02mg/LNAA，生根效率达70％以上；因此，虾脊兰植株再生培养基为MS基础上添加0.02mg/L植物生长调节剂NAA，在此培养条件下，连续培养180d，无需继代转接，得到虾脊兰完整植株。

以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通发明人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种虾脊兰植株再生体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：

种子的选择：野外采集未成熟虾脊兰蒴果；

种子的灭菌：将步骤1）所采集荚果进行表面清洗及灭菌消毒，经灭菌后，获得的种荚内部的种子作为外植体；

原球茎诱导：将步骤2）得到的外植体均匀撒播至种子诱导萌发培养基中进行培养，得到虾脊兰原球茎；

诱导植株生根：将步骤3）得到的虾脊兰原球茎接到诱导生根培养基中培养得到虾脊兰完整植株；

完成虾脊兰植株再生体系的建立。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述步骤1）所选虾脊兰未成熟荚果为健康完整，未被蚊虫蛀咬破坏的蒴果。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤2）灭菌方法为依次经过流水冲洗、70%-80%酒精、0.1%-0.2%氯化汞溶液灭菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）培养温度25±2℃，光照强度900-1100lx，光照时间12-14h/d，培养时间为120d。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）种子诱导萌发培养基包括基础培养基和其他添加物，所述基础培养基为花宝1号或MS或1/2MS，所述其他添加物为蛋白胨或6-BA或NAA或TDZ或其组合，所述其他添加物在培养基的含量为0.001-3000 mg/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3）种子诱导萌发培养基包括基础培养基和其他添加物，所述基础培养基为MS，所述其他添加物为NAA，NAA的加入量为0.02mg/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3）种子诱导萌发培养基包括基础培养基和其他添加物，所述基础培养基为花宝1号，所述其他添加物为蛋白胨，蛋白胨的加入量为1-4g/L。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3）种子诱导萌发培养基包括基础培养基和其他添加物，所述基础培养基为1/2MS，所述其他添加物为TDZ，TDZ的加入量为0.01-0.3mg/L。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤4）诱导生根培养基为MS基础上添加了植物生长调节剂NAA,添加浓度为0-2mg/L。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于：所述培养基中植物生长调节剂NAA浓度为0.02mg/L。