KR100533793B1 - 생물반응기를 이용한 섬오갈피의 부정근의 대량생산방법및 섬오갈피나무 묘목의 대량생산방법 - Google Patents

생물반응기를 이용한 섬오갈피의 부정근의 대량생산방법및 섬오갈피나무 묘목의 대량생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 섬오갈피의 부정근의 생산방법에 있어서, (a) 섬오갈피의 기내무균식물체의 뿌리를 적당한 길이로 절취한 후 식물생장물질이 첨가된 액체배지에서 부정근을 유도하고, (b) 유도된 부정근을 적당한 길이로 절취한 후 식물생장조절물질이 첨가된 액체배지에서 배양한 후, (c) 단계 b에서 배양된 부정근을 적당한 길이로 절취한 후 식물생장조절물질이 첨가된 액체배지에서 공기공급량을 0.01∼0.1vvm으로 조절하여 생물반응기에서 대규모 배양함을 특징으로 하는 부정근의 대량생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 배발생캘러스로부터 체세포배 발생과정을 거쳐 기내무균식물체를 육성하는 방법과, 조직배양기법에 의해 직접적으로 기내무균식물체를 육성하는 방법을 통해 섬오갈피 묘목을 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

생물반응기를 이용한 섬오갈피의 부정근의 대량생산방법 및 섬오갈피나무 묘목의 대량생산방법{Mass propagation Method for Stock and Adventitious Root of Acanthopanax Koreanum Nakai Using Bioreactor}
본 발명은 섬오갈피의 부정근의 대량생산방법 및 섬오갈피나무 묘목의 대량생산방법에 관한 것이다.
섬오갈피(Acanthopanax Koreanum Nakai)는 바닷가에서부터 해발 1,400m에 이르는 계곡이나 숲 속에 드물게 자라며, 높이 2m에 달하는 상록관목으로서 그 가지는 밑에서부터 많이 나며 가지에 기부가 넓은 삼각형의 가시가 있다. 잎은 호생하며 당상복엽이고 소엽은 5개이나 드물게 3개일 경우도 있는데 도란형 또는 측피침형이고 첨두 설저이며, 길이 3∼5cm로서 끝이 뾰족한 거치가 있으며, 표면은 녹색이고 광택이 있다. 또한, 뒷면은 녹색으로 맥액에 털이 밀생하고 엽병은 7∼8cm로서 털이 없다. 화경은 길이 2∼5cm로서 털이 없고, 소화경은 길고 6∼7월에 꽃이 핀다. 꽃받침에 뚜렷하지 않은 5개의 거치가 있으며, 꽃잎은 5개인데 길이는 3mm정도로서 뒤로 젖혀지며 녹색이다. 장과는 편구형으로 크기는 지름이 7mm정도인데 10월에 검게 익는다.
상기와 같은 특성을 가지는 섬오갈피로부터 다양한 생리활성을 지니는 여러 가지 물질이 분리되었다. 특히 분리된 물질 중 아칸토산((-)피마라-9(11), 15-디엔-19-오산) 성분은 현재까지 섬오갈피 뿌리에서만 대량으로 분리되며 여러 가지 약리작용이 알려져 있는데, 독성이 매우 약하며 항염 활성 및 면역체계의 항상성 유지 등에 뛰어난 약리작용이 있어 패혈증, 관절염, 염증, 류마티스 관절염, 간경변, 규폐증 등의 치료 및 예방에 효과가 높은 것으로 보고되어 있다.
종래부터 식물조직배양기술을 이용하여 상기와 같이 약효가 탁월한 것으로 알려진 섬오갈피나무를 생산하기 위한 노력으로, 섬오갈피로부터 캘러스를 유기하여, 배발생 캘러스를 경유해 체세포 배발생 과정을 거쳐 식물체로 재생시키려는 여러시도가 있어왔다. 하지만 이들은 모두 플라스크 배양수준으로서 대량으로 식물체를 생산하거나, 뿌리로부터 직접 부정근을 유도하는 기술은 보고된 바 없다.
본 발명은 상기 종래 기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 섬오갈피 부위중에서 약효가 가장 우수한 부정근을 경제적으로 연중 대량생산하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 섬오갈피나무 묘목을 경제적으로 대량생산할 수 있는 방법을 제공함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 섬오갈피의 부정근의 생산방법에 있어서, (a) 섬오갈피의 기내무균식물체의 뿌리를 적당한 길이로 절취한 후 식물생장물질이 첨가된 액체배지에서 부정근을 유도하고, (b) 유도된 부정근을 적당한 길이로 절취한 후 식물생장조절물질이 첨가된 액체배지에서 배양한 후, (c) 단계 b에서 배양된 부정근을 적당한 길이로 절취한 후 식물생장조절물질이 첨가된 액체배지에서 공기공급량을 0.01∼0.1vvm으로 조절하여 생물반응기에서 대규모 배양함을 특징으로 하는 부정근의 대량생산방법을 제공한다.
단계 a에서의 식물생장물질은 바람직하게는 IBA, NAA, 2,4-D에서 선택되는 적어도 1종 이상의 것으로 한다.
단계 b에서의 식물생장물질은 바람직하게는 IBA, TDZ, 제아틴에서 선택되는 적어도 1종 이상의 것으로 한다.
단계 c에서의 식물생장물질은 바람직하게는 IBA, TDZ, 제아틴에서 선택되는 적어도 1종 이상의 것으로 한다.
단계 a의 제 1측면에 따른 기내무균식물체의 제조방법은,
(a1) 섬오갈피조직을 무균처리하는 단계; (a2) 무균처리된 조직을 2,4-D, NAA 또는 BA에서 선택되는 1종 또는 2종이상을 0.5∼2.0mg/L 함유하는 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; (a3) 생장속도가 빠르고 밝은 노란색을 띄는 배발생 캘러스를 선택하여 당 3∼6중량%, 및 2,4-D, BA 0.1∼1.0 mg/L 함유한 액체배지에서 배양한 후 망의 크기가 100∼150㎛인 체로 체세포배를 걸러내는 단계; 및 (a4) 단계 a3에서 얻어진 체세포배를 온도 24±1℃, 광도 45∼55μ㏖/㎡s PPFD 이하로 유지되는 조건에서 DCR 고체배지나 GA3 0.5∼1.5mg/L 첨가된 1/2MS 고체배지에서 식물체로 배양하는 단계를 포함한다.
단계 a의 제 2측면에 따른 기내무균식물체의 제조방법은,
(a1') 섬오갈피의 동아 또는 액아를 무균처리하는 단계;
(a2') BA, NAA, IBA에서 선택된 적어도 1종이상의 식물생장물질을 0.1∼5.0mg/L 첨가한 MS 배지에 치상하여 다신초 및 줄기생장을 유도하는 단계; 및
(a3') 생장된 줄기를 절단하여 IBA 0.1∼5.0mg/L가 첨가된 1/2MS 배지에 치상 및 발근시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 제1측면에 따른 섬오갈피묘목의 생산방법은,
(a1-1) 섬오갈피조직을 무균처리하는 단계; (a2-1)무균처리된 조직을 2,4-D, NAA 또는 BA에서 선택되는 1종 또는 2종이상을 0.5∼2.0mg/L 함유하는 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; (a3-1) 생장속도가 빠르고 밝은 노란색을 띄는 배발생 캘러스를 선택하여 당 3∼6중량%, 및 2,4-D, BA 0.1∼1.0 mg/L 함유한 액체배지에서 배양한 후 망의 크기가 100∼150㎛인 체로 체세포배를 걸러내는 단계; (a4-1) 단계 a3-1에서 얻어진 체세포배를 온도 24±1℃, 광도 45∼55μ㏖/㎡s PPFD로 유지되는 조건에서 DCR 고체배지나 GA3 0.5∼1.5mg/L 첨가된 1/2MS 고체배지에서 식물체로 배양하는 단계; 및 (a5-1) 식물체를 배양토에 이식하여 광도가 40∼55μ㏖/㎡s PPFD, 온도가 24±1℃로 유지되는 조건에서 순화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제2측면에 따른 섬오갈피묘목의 생산방법은,
(a1-2) 섬오갈피의 동아 또는 액아를 무균처리하는 단계; (a2-2) BA, NAA, IBA에서 선택된 적어도 1종이상의 식물생장물질을 0.1∼5.0mg/L 첨가한 MS 배지에 치상하여 다신초 및 줄기생장을 유도하는 단계; (a3-2) 생장된 줄기를 절단하여 IBA 0.1∼5.0mg/L가 첨가된 1/2MS 배지에 치상 및 발근시키는 단계; 및 (a4-2) 단계 a3-2에서 얻어진 식물체를 배양토에 이식하여 광도가 40∼55μ㏖/㎡s PPFD, 온도가 24±1℃로 유지되는 조건에서 순화시키는 단계를 포함한다.
이하 본 발명의 내용을 섬오갈피 조직을 재료로 하여 1) 시료의 표면소독에 의한 무균재료화 및 캘러스 형성단계, 2) 생물반응기에서 캘러스 액체현탁 배양에 의한 복제 단계, 3) 복제된 캘러스로부터 기내무균식물체 유도, 육성 및 조직배양 방법에 의한 기내무균식물체 육성 단계, 4) 무균식물체로부터 순화된 묘목의 생산 단계, 5) 기내무균식물체 뿌리로부터 부정근의 유도 단계, 6) 생물반응기를 이용한 섬오갈피 부정근(세근)의 배양 단계로 구분하여 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
무균재료로부터 캘러스 형성를 위한 배지는 바람직하게는 MS, 1/2MS배지를 이용한다. 이때 식물생장조절물질은 바람직하게는 오옥신류 중에서 2,4-D, NAA와 사이토키닌류인 BA를 0.5 ∼ 2.0 mg/L 사용되는데, 보다 바람직하게는 2,4-D를 0.5 ∼ 1.0 mg/L 처리하는 경우가 캘러스 유도효과면에서 가장 좋다.
배 발생 캘러스 증식을 위한 생물반응기 액체배양배지는 바람직하게는 DCR 또는 1/2MS 액체배지에 2,4-D 0.1 ∼ 1.0 mg/L을 첨가하여 2주일 간격으로 계대배양하여 증식한다. 체세포배 유도를 위해서는 바람직하게는 생장조절제가 첨가되지 않은 DCR배지나 1/2MS액체배지에서 배양한다. 이러한 조건에서는 4주 배양 후 접종량의 4배 이상의 생체중량이 증가하게 된다. 유도된 체세포배는 무균대(clean bench)에서 체(Sieve)망의 크기가 100 ∼ 150㎛에 걸러 식물체 생산용으로 이용하고, 작은 세포는 다시 생물반응기에 접종하여 배발생 캘러스 증식용으로 사용한다. 이때 세포의 접종량은 바람직하게는 배지 1L당 2 ∼ 5g으로 한다.
증식된 세포는 바람직하게는 DCR 고체배지나 GA3 1.0 mg/L이 첨가된 1/2MS 고체배지에 치상하여 식물체 유도 및 생육에 적합한 배양실에서 줄기와 뿌리를 완전히 갖춘 기내무균 식물체로 육성한다.
기내무균 식물체를 얻는 또 다른 방법에는 섬오갈피 시료의 액아나 동아를 이용하는 조직배양 방법이 있다. 시료의 표면소독을 실시한 후 액아나 동아가 부착되도록 0.5 ∼ 1.0cm 길이로 절단하여 바람직하게는 BA 3.0 ∼ 5.0 mg/L 및 NAA 0.1 ∼ 0.5 mg/L를 첨가한 MS배지에 치상하고, 다신초 및 줄기생장을 유도한 후 생장된 줄기를 절단하여 바람직하게는 IBA 0.3 ∼ 1.0 mg/L가 첨가된 1/2MS 배지에 치상, 발근시켜 기내무균 식물체로 육성한다.
기내무균 식물체의 순화에 적합한 토양으로는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 펄라이트(perlite)+피트모스(peatmoss)+퇴비(원예용)=1:1:1 또는 버미큐라이트(vermiculite)+퇴비(원예용)=2:1의 부피비로 혼합한 토양이 좋다.
섬오갈피나무의 체세포 배를 바람직하게는 DCR 고체배지나 GA3 1.0 mg/L가 첨가된 1/2MS 고체배지에서 2개월간 배양 및 육성된 기내무균 식물체의 뿌리를 1.0 ∼ 2.0 cm의 길이로 절단하여 삼각플라스크에서 IBA, NAA 및 2,4-D가 첨가된 1/2MS배지에 배양한다. 3 ∼ 5주간 배양(10일 간격으로 계대배양)한 후 1.0 ∼ 2.0 cm 길이로 잘라 생물반응기 접종용 시료로 사용한다.
생물반응기를 이용한 섬오갈피의 부정근(세근) 배양은 5L 용량의 공기부양식 생물반응기에 1.0 ∼ 1.5cm로 절단된 섬오갈피 부정근을 배지 용량의 0.3 %(배지 1L당 3g)정도로 접종하는 것이 좋다.
공기부양식 생물반응기에서 섬오갈피 부정근(세근)을 배양할 경우 배양온도가 부정근(세근)의 증식에 가장 민감한 반응을 보이는데 23±1℃정도가 가장 빠른 생장을 보이는데 배양온도가 28℃이상이 되면 아주 저조한 생장을 보인다. 생장 중 공기의 공급은 초기에는 배양체가 느리게 이동할 정도로 공급하다가 부정근(세근)이 자라면 엉키지 않을 정도로 공기의 공급을 늘려야 한다.
배지의 공급은 배양 부정근(세근)이 생장하는 상태로 보아 중간에 1 ∼ 2회(접종 후 1개월이후 첨가)정도 첨가해주는 방식이 회분식 배양(one batch culture)보다 훨씬 효과적이다.
파이롯트급 또는 대용량 생물반응기를 이용하여 다량의 부정근(세근)을 얻기위한 요건 중의 하나는 섬오갈피 시료를 1.0 ∼ 1.5 cm크기로 조제하여 접종용 생물반응기에서 2주일 정도 배양하면서 오염여부를 확인하고 큰 규모의 생물반응기에 안전하게 이송하는 것이 필요하다.
본 발명에 사용가능한 생물반응기는 특별한 한정을 요하는 것은 아니며, 이미 국내에 공개된 것으로 특허 등록제 0239219, 0239220, 252382호에 개시된 모델과 동일한 것을 이용하여도 무방하다.
이하의 본 발명의 내용을 실시예로 통하여 구체적으로 설명하고자 하나 본 발명의 권리 범위는 이들 실시 예에 한정되지는 아니한다.
<실시예 1> 시료의 표면소독
본 발명에 사용한 시료는 제주도산 10년생의 섬오갈피나무로서 배양을 위하여 엽병, 녹지, 동아 및 액아를 채취하여 시료에 붙어있는 오염균을 제거하기 위하여 physan 20을 1000배로 희석하여 시료를 침지, 1∼2시간 진탕시킨 후 수돗물이나 증류수로 세척하였다.
표면소독을 위하여 시료를 clean bench내로 옮겨 70％에탄올에 10∼30초간 침지(시료에 따라 가감)시킨 후 멸균수로 3회 세척하였다. 1∼2％ 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 10∼15분 침지(시료의 상태에 따라 가감), 진탕시킨 후 멸균수로 3∼4회 세척하고 시료를 적당히 조제하여 배지에 치상하였다.
하기 표 1은 표면소독이 끝난 엽병 시료를 2 ∼ 3mm길이로 조제하여 MS배지에 치상한 후 약 10일간 오염의 정도를 나타낸 결과이다. 1∼2％ 차아염소산나트륨 용액에 5, 10, 15, 20분간씩 침지시킨 결과 1％ 차아염소산나트륨 용액에는 15분 이상 침적시키는 것이 효과적이었으나 2％ 차아염소산나트륨 용액에서는 10분 이상이 효과적이었다. 그러나, 2％ 차아염소산나트륨 용액에 20분간 침적시는 시료에 경미한 약해가 나타났으나 우려할 정도는 아니었다.
<표 1> 표면소독한 엽병 시료의 오염율
소 독 액 처리 시간(분) 비고
5 10 15 20 2％차아염소산용액 20분침적에 경미한 약해
1% 차아염소산 x □ ○ ○
2% 차아염소산 x ○ ○ ○
* 오염율
○ : 1 - 10% □ : 11-20% X : 21 - 50%
<실시예 2> 무균재료로부터 캘러스 형성단계
표면소독 후 오염이 되어 있지 않은 시료를 선택하여 식물생장조절물질이 함유되어 있는 배지에 치상하여 캘러스 증식상태를 관찰하였다. 소독된 엽병의 길이를 2.0 ∼ 3.0 mm 절단하여 고체배지에 치상하였다. 이때 사용된 배지는 MS 및 1/2MS 배지를 이용하였으며, 식물생장조절물질은 오옥신류 중에 NAA 및 2,4-D를 0.5 ∼ 2.0 mg/L 구배로 처리하였고 사이토키닌인 BA는 0.1 ∼ 0.5 mg/L 구배로 오옥신류와 함께 처리하였다.
배양조건은 24±1℃에 광량은 30 μmole/m2ㆍs PPFD에 16시간 조명을 실시하고 8시간은 암상태로 유지하였다. 캘러스 형성은 암배양 및 명배양에서 이루어지나 캘러스 형성량은 차이가 있었으며 형성배양기간은 명배양에서 광량이 많을수록 짧았으나 대체로 40∼60일 정도 소요되었다.
그 결과 2,4-D 0.5mg/L와 BA 0.1mg/L가 복합 첨가된 1/2MS에서 가장 효과가 뛰어난 것으로 확인되었으나 2,4-D 1.0 ∼ 1.5mg/L가 첨가된 MS배지에서도 캘러스 형성이 우수하였다(표 2).
<표 2> 배지 및 생장조절물질에 따른 캘러스 형성 (단위 : mg)
배 지 식물생장 조절물질 농도 (mg/L)
0.5 1.0 1.5 2.0 0.5 + 0.5 0.5 + 0.1
MS 2,4-D 133.1 262.1 202.1 64.8
MS NAA+BA 183.3
1/2MS 2,4-D+BA 352.5
<실시예 3> 생물반응기에서 캘러스 액체현탁배양에 의한 복제 단계
생장속도가 비교적 빠르고 밝은 노란색을 띄는 배발생 캘러스를 잘게 부순 다음 이를 액체배양 배지에 현탁시킨 후 약 4주 간격으로 계대배양하였다. 생물반응기에서의 세포증식은 DCR 또는 1/2MS 액체배지나 2,4-D와 BA를 각각 0.1 ∼ 1.0 mg/L가 첨가 된 1/2MS 액체배지에 접종하여 세포가 증식, 생장하는 상태를 관찰하여 3 ∼ 5주일 간격으로 계대배양하면서 망의 크기가 100∼150 ㎛인 체(Sieve)에 걸러 큰 세포는 체세포 배 식물체 생산용으로 이용하고 작은 세포는 생물반응기에서 연속적으로 복제 증식, 배양하여 이용하였다. 이때의 배양환경조건은 암배양 또는 광도 15 μmole/m2ㆍs PPFD이하로 하였다.
하기 표 3에 나타난 바와 같이 DCR배지에 첨가되는 수크로스(sucrose)의 농도에 따라 수확기의 세포 증식량이 초기접종량의 1.5 ∼ 11.9배의 차이가 있었으며 1/2MS배지의 경우도 식물생장조절물질의 첨가와 무첨가에 따라 큰 차이를 보
여 주었다.
생물반응기에 세포를 접종시에 박테리아나 곰팡이류에 오염될 가능성이 높으므로 씨드(seed)로 사용되는 세포는 오염여부를 철저히 관찰하여 사용하고 동시에 접종용 기구의 소독을 철저히 하고 작업시 기구들이 무균대 밖으로 나오지 않도록 조심하여야 한다.
씨드(seed)로 사용되는 세포의 초기 접종량은 배지 1L당 2 ∼ 5g이 적당한데 초기접종량이 많을 수록 계대 및 수확 기간이 빨라진다.
생물반응기에서 약 1개월간 현탁배양하여 체세포 배가 유도된 세포는 기내 식물체를 유도, 생산하는데 이용하였다.
<표 3> 액체현탁 배양시 배지,당 및 생장조절물질에 따른 세포 증식
배지 당 또는 식물생장조절물질 초기접종(g) 증식량(g) 증식율(배)
DCR sucrose 3% 4.5 53.5 11.9
" sucrose 6% 4.5 28.9 6.4
" sucrose 9% 4.5 6.9 1.5
1/2MS 4.5 37.2 8.3
" 2,4-D 0.1 mg/L +BA 0.1 mg/L 4.5 87.5 19.4
<실시예 4> 체세포 배로부터 식물체 유도 및 생장 단계
생물반응기에서 증식된 섬오갈피나무 체세포 배를 DCR 고체배지나 GA3 1 mg/L가 첨가된 1/2MS 고체배지에서 2개월간 배양하여 식물체로 유도, 육성하였다. 이 때의 배양환경조건은 온도가 24±1℃, 광도는 45 ∼ 55 μmole/m2ㆍs PPFD로 나타났다. 특히, 유의할 점은 배양실의 온도가 20℃ 이하로 떨어지면 생장이 급격히 저하되므로 주의하여야 한다. 유도된 식물체는 부정근(세근)의 대량배양과 토양에서 순화과정을 거쳐 묘목의 대량생산용으로 이용하였다.
<표 4> 광도별 섬오갈피 기내 식물체 생장 평균 길이 (단위 : cm)
광도(μmole/m2ㆍs) 줄기 뿌리
33 3.2 4.8
43 7.0 8.7
53 9.3 12.4
63 6.7 7.9
* 광도가 65 μmole/m2ㆍs PPFD 이상일 때 피해가 있음
<실시예 5> 조직배양방법에 의한 식물체 유도 및 생장 단계
섬오갈피의 동아 및 액아를 표면소독(소독법은 '실시예 1'과 동일)하여 BA 3.0 ∼ 5.0 mg /L 및 NAA 0.1 ∼ 0.5mg/L를 첨가한 MS배지에 치상, 다신초 및 줄기생장를 유도한 후 생장된 줄기를 절단하여 IBA 0.3 ∼ 1.0 mg/L가 첨가된 1/2MS 배지에 치상, 발근시켜 기내무균 식물체로 육성하여 부정근(세근)의 대량배양과 토양에서 순화과정을 거쳐 묘목의 대량생산용으로 이용하였다.
<실시예 6> 배양 식물체 순화에 의한 묘목의 대량생산 단계
기내에서 뿌리와 줄기가 건강하게 생육한 식물체를 꺼내어 뿌리에 묻은 배지를 물에 담가 흔들면서 완전히 제거한 후 준비된 밧-트에 이식하였다. 즉, 배양토는 표 5에 나타난 비율대로 혼합한 후 밧-트에 7∼10cm(가로×세로×높이가 55×40×20cm의 플라스틱 바구니가 좋음) 높이의 배양토를 담아 물을 충분히 흡수하도록 하였다. 이식이 끝나면 밧-트 상단에 비닐 및 아크릴 판을 덮고 준비된 순화실이나 배양실에서 순화시켰다. (순화조건: 광도가 40 ∼ 55 μmole/m2ㆍs PPFD, 온도 24±1℃, 기간은 25 ∼ 30일(묘목 상태에 따라 조정))
밧트에 이식하여 1주일까지는 밧-트내의 습도가 80％이상 유지되도록 하였고 그 이후에는 묘목의 상태에 따라 밧-트내 습도를 적절히 조절하였다. 순화기간이 끝나면 온실(온도 : 15∼30℃ 유지)로 옮겨 생장시킨 후 장마철 또는 적절한 시기에 포장 및 식재지에 이식하였다.
하기 표 5에 나타난 바와 같이 버민큐라이트, 펄라이트, 피트모스 및 퇴비(원예용)를 적절히 혼합하여 순화처리를 실시하면 92.5％이상의 건전한 묘목을 생산할 수 있었다.
<표 5> 섬오갈피 기내 식물체의 배양토별 순화 처리
배양토의 혼합 비율 (부피비) 순화기간(일) 이식본수(A) (본) 생존본수(B) (본) 생존율(B/A) (%)
버미큘라이트 28 40 39 97.5
버미큘라이트:펄라이트=1:1 28 40 37 92.5
펄라이트:피트모스:퇴비=1:1:1 28 40 40 100.0
펄라이트:퇴비=1:1 28 40 38 95.0
<실시예 7> 생물반응기를 이용한 섬오갈피 부정근(세근)의 대량생산 단계
삼각플라스크에서의 부정근 유도
섬오갈피나무 체세포 배를 DCR 고체배지나 GA3 1.0 mg/L가 첨가된 1/2MS 고체배지에서 2개월간 배양, 육성된 기내무균 식물체의 뿌리를 1.0 ∼ 2.0cm의 길이로 절단하여 삼각플라스크에서 IBA, NAA 및 2,4-D가 첨가된 1/2MS배지에 배양하였다. 모든 배양은 23±1℃가 유지되는 배양실에서 암배양하였다. 배양 8주 후 부정근 형성률 및 절편체당 발생된 부정근수 등을 조사하였다(표 6). 이때 부정근은 절편체로부터 2∼3mm이상 발달된 것으로 하였다. 그 결과 1.0 ∼ 3.0mg/L 농도의 IBA가 첨가된 처리구에서 부정근 발생율이 높았고 부정근 발생수는 IBA 3.0 ∼ 7.0mg/L 농도가 첨가된 처리구에서 높았다.
<표 6> 식물생장조절물질 처리별 섬오갈피 부정근의 발생율 및 발생수
식물생장조절물질 식물생장조절물질의 농도(mg/L) 부정근 발생율 (％) 부정근 발생수(개)
0 0 0 0
IBA 1.0 88.6 4
" 3.0 61.7 5
" 5.0 18.3 8
" 7.0 5.0 5
NAA 0.5 6.2 1
" 1.0 13.3 3
" 3.0 5.0 2
" 5.0 8.3 4
2.4-D 0.5 1.7 1
생물반응기 배양을 통한 섬오갈피나무의 부정근 생산
삼각플라스크에서 배양된 섬오갈피나무의 부정근을 다시 1.0 ∼ 2.0cm의 길이로 절단하여 MS, 1/2MS, 3/2MS, WPM, DCR, B5, LP 및 GD배지에 sucrose 3％를 첨가, 9주간 배양하여 부정근의 형성과 생장을 조사한 결과 1/2MS, DCR 및 WPM배지에서만 부정근의 형성과 생장이 관찰되었는데 특히 1/2MS배지에서 생장이 좋았고 DCR 및 WPM 배지에서는 경미한 생장만 관찰되었다.
하기 표 7은 식물생장조절물질이 섬오갈피 부정근 증식에 미치는 영향을 구명하기 위하여 10L 생물반응기에 식물생장조절물질 IBA 단일처리 및 IBA에 티디아주론(Thidiazuron(TDZ))과 제아틴(Zeatin) 등을 복합처리하여 첨가된 1/2MS 배지에서 배양한 결과이다.
1.0 ∼ 2.0cm로 절단된 접종시료에서 생성되는 부정근의 수는 IBA 단일처리에서 3 ∼ 10개였으나 IBA에 TDZ와 제아틴 등의 복합처리는 12 ∼ 25개 정도로 부정근의 수가 많고, 생장속도도 빨라 우수한 결과를 보여주었다. 일반적으로 생장조절물질의 처리 농도는 IBA 3.0∼5.0 mg/L와 TDZ(대용으로 제아틴도 가능) 0.1 ∼ 0.05 mg/L에 2 ∼ 3개월의 배양기간이 소요된다.
초기 접종량은 생물반응기 용량에 따라 약간의 차이가 있겠으나 배양배지 1L당 2 ∼ 6g 정도면 무난할 것으로 생각된다. 초기접종량이 많을수록 수확기를 앞당길 수 있는 장점이 있으나 절단된 시료에서 새로운 부정근의 형성이 늦어지거나 형성되지 않고 죽어버려 증식배양에 피해를 주는 수도 있음을 유의해야 한다.
<표 7> 생물반응기에서 식물생장조절물질 처리별 부정근 증식율
생장조절물질별 처리 농도(mg/L) 초기접종량(g) 증식량(g) 증식율(배)
IBA 1.0 20 69 2.3
" 3.0 20 90 4.5
" 5.0 20 81 4.1
IBA 3.0 + TDZ 0.1 20 240 12.0
IBA 5.0 + TDZ 0.1 20 260 13.0
IBA 3.0 + Zeatin 0.1 20 152 7.6
IBA 5.0 + Zeatin 0.1 20 203 10.2
생물반응기 용량별 섬오갈피의 부정근(세근) 배양
일반적으로 소규모 생물반응기에서 확립된 배양환경조건은 대용량 생물반응기에서도 거의 동일하게 적용된다. 그러나 대용량 생물반응기는 소규모 생물반응기에 비하여 배양환경조건을 맞추는 것이 까다롭다. 그래서 배양용량에 비례하여 수확량이 늘어나지 않지만 꾸준한 배양에 의하여 증식량을 향상시킬 수 있을 것이다. 표 8에 나타난 바와 같이 초기접종량에 비하여 생물반응기의 용량이 커질수록 수확량 및 증식율도 높아감을 관찰할 수 있었다.
생물반응기내에서 섬오갈피 부정근이 생장할 수록 서로 엉키는 현상이 관찰되는데, 엉킨 상태로 배양을 계속할 경우 내부에 있는 부정근이 생장저해를 받아 생장 중지 및 노화현상이 일어나 진한 갈색이 되고 전체적인 생산감소를 초래한다. 그러므로 배양상태를 항상 관찰하여 적절한 시기에 배지를 첨가할 것과 공기공급량(0.01 ∼ 0.1vvm)의 조절 및 배양기를 흔들어 엉킴상태를 최소화하도록 노력해야 한다.
20L급 이상의 생물반응기 배양시 초기 접종시 주입배지 전체의 1/2 ∼ 1/3정도 공급하고 배양 부정근(세근)이 엉키기 시작하는 시점인 배양 4 ∼ 6주 후에 1∼ 2회로 나누어 배지를 첨가해 주는 방식이 회분식 배양(one batch culture)방식보다 효과적임을 알 수 있었다. 모든 배양은 23±1℃가 유지되는 배양실에서 암배양하였다.
또한, 100L급 이상의 대용량 생물반응기 배양은 초기접종시의 오염을 최소화하기 위하여 1차적으로 접종용 생물반응기에 씨드(seed)를 접종, 2주간배양하면서 오염 및 배양상태를 확인하고 이상이 없을 때 대용량 생물반응기에 접종, 배양하였다.
<표 8> 생물반응기 용량별 섬오갈피의 부정근 배양효과
생물반응기 용량(L) 초기접종량(g) 수확량(9주후/g) 증식율(배)
10 20 260 13.0
20 30 670 22.3
100 100 2,750 27.5
<실시예 8> 섬오갈피 배양 부정근(세근)의 물질분석
야외에서 생장하는 섬오갈피나무와 배양하여 수확한 섬오갈피 부정근은 영양번식에 의해 증식되는 것이므로 유전적으로는 100％ 동일하나 섬오갈피나무는 수년 또는 수십년 동안 척박한 환경조건에 견디면서 자라는 것에 비해 생물반응기에서 생산된 섬오갈피 부정근은 겨우 8 ∼ 9주 정도의 배양기간이 소요되기 때문에 물질생산성 측면에서는 차이가 생길 수 있다. 이에 대한 분석을 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 다음과 같이 수행하였다.
배양시료 각 1g씩을 가열추출장치(Hana Precision system)에 넣고, 40％(v/v) 메탄올 30㎖를 가한 후 약 80℃의 온도에서 1시간 동안 추출하였다. 추출된 시료는 막여과기(membrane filter)를 사용하여 여과한 후 사용하였다.
함량분석은 HPLC(TSP operating system)에 이동상으로 아세토니트릴:물(1% H3PO4) = 15 : 85 혼합용매, 칼럼으로 Spherisorb ODS(0.5㎛, 4.6 x 250 mm), 유속은 0.6㎖/min, injection volume은 20㎕, UV검출기(TSP 3000HR) 220nm에서 분석을 행한 결과 도 8에서 보는바와 같이 성분이 거의 동일한 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 섬오갈피 부위중에서 약효가 가장 우수한 부정근을 경제적으로 연중 대량생산하여 제약원료, 건강식품, 화장품, 제과 및 식료품 등으로 이용할 재료의 공급이 가능하므로 국민의 건강증진은 물론, 섬오갈피의 유효성분 및 약리효과의 집중적인 연구로 고부가가치의 신약개발을 가능하게 한다.
또한, 섬오갈피나무 묘목을 경제적으로 대량생산할 수 있어 멸종위기의 유용식물의 복원뿐만 아니라, 유용한 약용식물을 식재하는 농가의 소득증대에도 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에서 시료로 사용된 섬오갈피나무의 사진
도 2a는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 섬오갈피로부터 유기된 세포의 사진
도 2b는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 생물반응기에서 섬오갈피 세포가 대량으로 복제되는 과정을 보여주는 사진
도 3a는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 섬오갈피 세포부터 체세포 배 및 식물체를 유도하는 과정을 보여주는 사진
도 3b는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 기내에서 생육하는 섬오갈피 식물체의 뿌리 및 줄기 사진
도 4a는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 배양토에 식재하여 순화되는 섬오갈피 식물체의 사진
도 4b는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 순화된 섬오갈피 묘목의 야외 생장 모습사진
도 5a는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 생물반응기 접종 1개월 후 섬오갈피 뿌리 절편체로부터 부정근(세근)이 생장하는 모습을 보여주는 사진
도 5b는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 수확 10일 전의 생물반응기에서 생장한 섬오갈피 부정근(세근)의 사진
도 5c는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 접종 1주일 후 섬오갈피 뿌리 절편체에 형성된 부정근(세근) 원기의 사진
도 5d는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 접종 4주 후 섬오갈피 뿌리 절편체로부터 생장하는 부정근(세근)의 확대 사진
도 6은 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 섬오갈피 부정근(세근)의 탱크배양모습을 보여주는 사진
도 7은 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 생물반응기에서 배양, 건조시킨 섬오갈피 부정근(세근)의 사진
도 8a는 야외에서 생장한 섬오갈피 식물체 추출물의 HPLC 물질분석결과
도 8b는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 생물반응기에서 배양, 증식된 섬오갈피 부정근(세근) 추출물의 HPLC 물질분석결과

Claims (8)

  1. (a) 섬오갈피의 기내무균식물체의 뿌리를 적당한 길이로 절취한 후 식물생장물질이 첨가된 액체배지에서 부정근을 유도하고, (b) 유도된 부정근을 적당한 길이로 절취한 후 식물생장조절물질이 첨가된 액체배지에서 배양한 후, (c) 단계 b에서 배양된 부정근을 적당한 길이로 절취한 후 식물생장조절물질이 첨가된 액체배지에서 공기공급량을 0.01∼0.1vvm으로 조절하여 생물반응기에서 대규모 배양함을 특징으로 하는 부정근의 대량생산방법
  2. 제 1항에 있어서, 단계 a에서의 식물생장물질은 IBA, NAA, 2,4-D에서 선택되는 적어도 1종 이상임을 특징으로 하는 대량생산방법
  3. 제 1항에 있어서, 단계 b에서의 식물생장물질은 IBA, TDZ, 제아틴에서 선택되는 적어도 1종 이상임을 특징으로 하는 대량생산방법
  4. 제 1항에 있어서, 단계 c에서의 식물생장물질은 IBA, TDZ, 제아틴에서 선택되는 적어도 1종 이상임을 특징으로 하는 대량생산방법
  5. 제 1항에 있어서, 단계 a의 기내무균식물체는
    (a1) 섬오갈피조직을 무균처리하는 단계;
    (a2) 무균처리된 조직을 2,4-D, NAA 또는 BA에서 선택되는 1종 또는 2종이상을 0.5∼2.0mg/L 함유하는 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
    (a3) 생장속도가 빠르고 밝은 노란색을 띄는 배발생 캘러스를 선택하여 당 3∼6중량％, 및 2,4-D, BA 0.1∼1.0 mg/L 함유한 액체배지에서 배양한 후 망의 크기가 100∼150㎛인 체로 체세포배를 걸러내는 단계; 및
    (a4) 단계 a3에서 얻어진 체세포배를 온도 24±1℃, 광도 45∼55μ㏖/㎡s PPFD 이하로 유지되는 조건에서 DCR 고체배지나 GA3 0.5∼1.5mg/L 첨가된 1/2MS 고체배지에서 식물체로 배양하는 단계를 포함하여 제조됨을 특징으로 하는 대량생산방법
  6. 제 1항에 있어서, 단계 a의 기내무균식물체는
    (a1') 섬오갈피의 동아 또는 액아를 무균처리하는 단계;
    (a2') BA, NAA, IBA에서 선택된 적어도 1종이상의 식물생장물질을 0.1∼5.0mg/L 첨가한 MS 배지에 치상하여 다신초 및 줄기생장을 유도하는 단계; 및
    (a3') 생장된 줄기를 절단하여 IBA 0.1∼5.0mg/L가 첨가된 1/2MS 배지에 치상 및 발근시키는 단계를 포함하여 제조됨을 특징으로 하는 대량생산방법
  7. (a1-1) 섬오갈피조직을 무균처리하는 단계;
    무균처리된 조직을 2,4-D, NAA 또는 BA에서 선택되는 1종 또는 2종이상을 0.5∼2.0mg/L 함유하는 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;
    (a2-1) 생장속도가 빠르고 밝은 노란색을 띄는 배발생 캘러스를 선택하여 당 3∼6중량％, 및 2,4-D, BA 0.1∼1.0 mg/L 함유한 액체배지에서 배양한 후 망의 크기가 100∼150㎛인 체로 체세포배를 걸러내는 단계;
    (a3-1) 단계 a3-1에서 얻어진 체세포배를 온도 24±1℃, 광도 45∼55μ㏖/㎡s PPFD로 유지되는 조건에서 DCR 고체배지나 GA3 0.5∼1.5mg/L 첨가된 1/2MS 고체배지에서 식물체로 배양하는 단계; 및
    (a4-1) 식물체를 배양토에 이식하여 광도가 40∼55μ㏖/㎡s PPFD, 온도가 24±1℃로 유지되는 조건에서 순화시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 섬오갈피나무묘목의 생산방법
  8. (a1-2) 섬오갈피의 동아 또는 액아를 무균처리하는 단계;
    (a2-2) BA, NAA, IBA에서 선택된 적어도 1종이상의 식물생장물질을 0.1∼5.0mg/L 첨가한 MS 배지에 치상하여 다신초 및 줄기생장을 유도하는 단계;
    (a3-2) 생장된 줄기를 절단하여 IBA 0.1∼5.0mg/L가 첨가된 1/2MS 배지에 치상 및 발근시키는 단계; 및
    (a4-2) 단계 a3-2에서 얻어진 식물체를 배양토에 이식하여 광도가 40∼55μ㏖/㎡s PPFD, 온도가 24±1℃로 유지되는 조건에서 순화시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 섬오갈피나무묘목의 생산방법
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