KR100973839B1

KR100973839B1 - 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용한 캘러스의 대량증식방법및 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법

Info

Publication number: KR100973839B1
Application number: KR1020080046804A
Authority: KR
Inventors: 임종순; 김욱동; 전원찬; 박성호; 이정순
Original assignee: 경상북도(관련부서:경상북도산림생태과학원)
Priority date: 2008-05-20
Filing date: 2008-05-20
Publication date: 2010-08-04
Also published as: KR20090120813A

Abstract

본 발명은 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis) 캘러스의 대량증식방법 및 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편을 적출하는 단계; 적출된 잎 절편을 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 식물생장 호르몬 및 수크로오스(Sucrose)를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지에 접종하고 명조건의 진탕 배양기에서 배양하여 캘러스를 증식하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃 캘러스의 대량증식방법과, 증식된 캘러스로부터 신초를 유도하는 단계; 및 유도된 신초로부터 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하고 선택적으로 잎 절편을 적출하는 단계 이후에 적출된 잎 절편을 살균하는 단계; 또는 뿌리를 유도하는 단계 이후에 기내에서 분화된 식물체를 순화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법에 관한 것이다.

본 발명을 이용하는 경우 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편으로부터 한국 특산식물이며 멸종위기종으로 지정된 노랑무늬붓꽃을 쉽고 간단하게 대량분화시킬 수 있게 되어 유전자원보존에 기여할 수 있고, 본 발명을 이용하여 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)을 농산촌의 새로운 소득 화훼종으로 개발하는 경우 농산촌 소득증대에 기여할 수 있다.

노랑무늬붓꽃, 캘러스, 신초, 뿌리, 순화, 대량증식, 대량분화

Description

노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용한 캘러스의 대량증식방법 및 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법{Method for mass propagation of callus and method for mass division of Iris odaesanensis flower utilizing leaf segments of Iris odaesanensis}

본 발명은 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis) 캘러스의 대량증식방법 및 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편을 적출하는 단계; 적출된 잎 절편을 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 식물생장 호르몬 및 수크로오스(Sucrose)를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지에 접종하고 명조건의 진탕 배양기에서 배양하여 캘러스를 증식하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃 캘러스의 대량증식방법과, 증식된 캘러스로부터 신초를 유도하는 단계; 및 유도된 신초로부터 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하고 선택적으로 잎 절편을 적출하는 단계 이후에 적출된 잎 절편을 살균하는 단계; 또는 뿌리를 유도하는 단계 이후에 기내에서 분화된 식물체를 순화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법에 관한 것이 다.

21세기는 생물자원의 경쟁시대로 보다 많은 생물종을 확보하고, 보다 효과적으로 생물자원을 이용하는 국가가 일류국가로 성장할 것으로 예상된다. 이와 관련하여 생물자원으로부터의 천연물을 탐색하는 기술은 신약개발, 생물학적 활성 유효성분 발굴 등 고부가가치를 창출할 수 있는 새로운 연구분야로 각광받고 있다.

우리나라에는 현재 4,000여종의 식물자원이 분포하는 것으로 알려져 있으며, 그 중 400 여종은 우리나라에만 자생하는 한국 특산자원이다. 우리나라에만 자생하는 한국 특산자원 중 노랑무늬붓꽃은 백합목 붓꽃과의 다년생 야생화로서 서식지가 오대산, 대관령, 팔공산 등 일부 지역에 한정되어 있고, 개체수가 매우 적어서 환경부에서는 멸종위기 야생식물로 지정하여 보호하고 있다. 외형적 특성으로 잎은 호생하고 길이 35cm, 너비 1.3cm이고 10~14개의 맥이 있으며 밑 부분이 꽃줄기를 둘러싸고 있다. 꽃은 흰색 바탕에 노란색 무늬가 있고 지름은 2~2.5cm이며 5~6월에 개화하고, 꽃줄기는 가늘고 길며 끝에 각각 1개의 꽃이 달린다. 시원스러운 잎과 청결함이 돋보이는 꽃으로 관상용으로 가치가 있으며, 특히 군식 했을 때 돋보이므로 지피식물로 이용하거나 분화용으로도 좋다.

현재 노랑무늬붓꽃의 증식을 위하여 주로 분주법을 이용하고 있는데 분주법으로는 짧은 시간에 대량증식이 불가능하여 희귀 야생식물의 보존 및 증식에 어려움이 많다.

한편, 단기간에 대량증식을 통한 충분한 개체수를 확보하기 위하여 식물체 의 잎, 뿌리, 또는 기타 식물조직을 이용하는 식물조직배양기술이 많이 이용되고 있다. 식물조직배양기술은 유용물질의 대량생산, 식물체의 대량증식, 외부유전자가 도입된 형질전환 식물체 개발 등 다양한 분야에서 이용되고 있다. 이미 가뭄에 내성이 있는 유전자를 작물에 도입하여 가뭄이 심한 지역에서도 안정적으로 식량자원을 생산할 수 있는 품종이 개발되었고, 내병성 유전자를 도입하여 생산량을 증가시키는 품종도 개발되었다.

노랑무늬붓꽃의 증식과 관련된 종래의 식물조직배양기술로서 한국등록특허 제10-0491102호에는 붓꽃의 꽃자루(peduncle, 화경)으로부터 캘러스를 유도하고 증식하여 신초를 재분화하거나 눈(bud, 측아)로부터 신초를 재분화하는 붓꽃의 조직배양법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0775080호에는 노랑무늬붓꽃의 생장점을 적출하여 캘러스, 체세포배를 유도하고 체세포배로부터 지상부와 지하부를 재분화시키는 노랑무늬붓꽃의 대량생산방법이 개시되어 있다.

그러나 상기의 노랑무늬붓꽃의 증식과 관련된 종래의 식물조직배양기술은 노랑무늬붓꽃의 생장점, 꽃자루, 눈과 같이 노랑무늬붓꽃 개체에 그 양이 한정된 부분을 이용하고 있어서 노량무늬붓꽃의 대량증식에 한계가 있고, 이러한 부위를 적출하는 것이 번거롭다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃의 캘러스를 대량으로 증식할 수 있는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편을 적출하는 단계; 적출된 잎 절편을 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬 및 수크로오스(Sucrose)를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지에 접종하고 명조건의 진탕 배양기에서 배양하여 캘러스를 증식하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃 캘러스의 대량증식방법을 제공함으로써 달성할 수 있다.

또한 본 발명은 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃을 대량으로 분화하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편을 적출하는 단계; 적출된 잎 절편을 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 배지에 배양하여 신초를 유도하는 단계; 및 유도된 신초를 5mg/L의 IBA(Indole-3-Butyric Acid)와 1~3mg/L의 BA, 또는 5mg/L의 IAA (indole-3-acetic acid)와 1~3mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 배지에 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법을 제공함으로써 달성할 수 있다.

또한 본 발명의 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃을 대량으로 분화하는 방법을 제공하는 목적은 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편을 적출하는 단계; 적출된 잎 절편을 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬 및 수크로오스를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지에 접종하고 명조건의 진탕배양기에서 배양하여 캘러스를 증식하는 단계; 증식된 캘러스를 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 배양하여 신초를 유도하는 단계; 및 유도된 신초를 5mg/L의 IBA(Indole-3-Butyric Acid)와 1~3mg/L의 BA, 또는 5mg/L의 IAA (indole-3-acetic acid)와 1~3mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 슈크로즈, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 배지에 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법을 제공함으로써도 달성될 수 있다.

본 발명은 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃의 캘러스(Callus)를 대량으로 증식할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃의 캘러스를 대량으로 증식할 수 있는 방법은 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편을 적출하는 단계; 적출된 잎 절편을 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬 및 수크로오스(Sucrose)를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지에 접종하고 명조건의 진탕 배양기에서 배양하여 캘러스를 증식하는 단계;를 포함 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편을 적출하는 단계; 적출된 잎 절편을 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬 및 수크로오스(Sucrose)를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지에 접종하고 명조건의 진탕 배양기에서 배양하여 캘러스를 증식하는 단계;를 포함한다.

또한, 본 발명의 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃의 캘러스를 대량으로 증식할 수 있는 방법은 상기 잎 절편을 적출하는 단계 이후에 적출된 잎 절편을 1 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 살균하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

이하 본 발명의 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃의 캘러스를 대량으로 증식하는 방법에 대해 각 단계로 나누어 설명한다.

1) 잎 절편을 적출하는 단계

본 발명에서 사용되는 노랑무늬붓꽃의 잎 절편은 무균상태에서 생장한 노랑무늬붓꽃의 잎 절편 또는 외부환경에서 생육한 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 포함하 고 바람직하게는 외부환경에서 1년 이상 생육한 노랑무늬붓꽃을 잎 절편을 사용하는 것이 바람직하다. 노랑무늬붓꽃으로부터 잎 절편을 적출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 적출된 잎 절편은 증류수를 이용하여 잎 절편에 묻어있던 이물질을 제거한 후 사용하는 것이 바람직하다.

2) 살균단계

무균상태에서 생장한 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 사용하는 경우 살균단계를 거칠 필요가 없으나, 외부환경에서 1년 이상 생육한 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 사용하는 경우에는 살균단계를 거치는 것이 바람직하다. 살균단계는 명조건 또는 암조건에서 적출된 잎 절편을 1 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 20분간 2번에 걸쳐 살균하는 것을 특징으로 한다. 상기 살균된 잎 절편은 증류수로 세척한 후 적절한 크기로 잘라 캘러스를 유도하는 단계에서 사용된다.

3) 캘러스를 유도하는 단계

살균된 잎 절편으로부터 캘러스를 유도하는 단계는 살균된 잎 절편을 고체 배지에 치상한 후 암조건에서 배양하는 것으로 구성되며, 배양 온도는 특별히 제한되지 않으나, 25℃인 것이 바람직하다.

살균된 잎 절편으로부터 캘러스를 유도하는 단계의 배지는 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천(Agar)을 포함 하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지를 사용하고 바람직하게는 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬, 3 중량%의 수크로오스, 및 0.9 중량%의 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지를 사용한다.

4) 캘러스를 증식하는 단계

캘러스를 증식하는 단계는 고체배지에서 유도된 캘러스를 진턍배양기의 액체배지로 옮겨 명조건에서 배양하는 것으로 구성되며, 배양조건은 온도가 25℃이고 회전속도가 130rpm인 것이 바람직하다.

캘러스를 증식하는 단계의 액체 배지는 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬 및 수크로오스(Sucrose)를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지를 사용하고 수크로오스의 농도가 3 중량%인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 측면은 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃을 대량으로 분화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃을 대량으로 분화하는 방법은 노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)으로 잎 절편을 적출하는 단계; 적출된 잎 절편을 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 유도된 캘러스를 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 배지에 배양하여 신초(Shoot)를 유도하는 단계; 및 유도된 신초를 5mg/L의 IBA(Indole-3-Butyric Acid)와 1~3mg/L의 BA, 또는 5mg/L의 IAA (indole-3-acetic acid)와 1~3mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 배지에 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함한다.

또한, 본 발명의 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃을 대량으로 분화하는 방법은 상기 잎 절편을 적출하는 단계 이후에 적출된 잎 절편을 1 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 살균하는 단계; 또는 상기 캘러스를 유도하는 단계와 신초를 유도하는 단계 사이에 유도된 캘러스를 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬 및 수크로오스를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지에 접종하고 명조건의 진탕배양기에서 배양하여 캘러스를 증식하는 단계; 또는 상기 뿌리를 유도하는 단계 이후에 기내에서 분화된 식물체를 모래와 질석이 1:1로 섞인 배양토에 옮겨 심어 순화하는 단계;를 선택적으로 더 포함할 수 있다.

이하 본 발명의 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃을 대량으로 분화하는 방법에 대해 각 단계로 나누어 설명한다.

노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃을 대량으로 분화하는 방법 중 잎 절편을 적출하는 단계, 살균단계, 캘러스를 유도하는 단계, 캘러스를 증식하는 단계는 그 내용이 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃의 캘러스를 대량으로 증식하는 방법과 동일하므로 생략하기로 한다.

5) 신초를 유도하는 단계

신초를 유도하는 단계는 유도된 캘러스나 증식된 캘러스를 고체 배지에 치상한 후 명조건에서 배양하는 것으로 구성되며, 배양 온도는 특별히 제한되지 않으나, 25℃인 것이 바람직하다.

신초를 유도하는 단계의 배지는 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지를 사용하고 바람직하게는 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬, 3 중량%의 수크로오스, 및 0.9 중량%의 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지를 사용한다.

6) 뿌리를 유도하는 단계

뿌리를 유도하는 단계는 유도된 신초를 고체 배지에 치상한 후 배양하는 것으로 구성되고, 더욱 구체적으로는 신초 주위의 캘러스등 필요 없는 조직은 버리고 캘러스에서 다수로 발생한 신초를 여러 개의 신초로 나누어 각각의 배지에 계대배양하는 것으로 구성되며, 배양 온도는 특별히 제한되지 않으나, 25℃인 것이 바람직하다.

뿌리를 유도하는 단계의 배지는 5mg/L의 IBA(Indole-3-Butyric Acid)와 1~3mg/L의 BA, 또는 5mg/L의 IAA (indole-3-acetic acid)와 1~3mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 슈크로즈, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 배지를 사용하고 바람직하게는 5mg/L의 IBA와 1mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬, 3 중량%의 수크로오스, 및 0.9 중량%의 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지를 사용한다.

7) 기내에서 분화된 식물체를 순화하는 단계

기내에서 분화된 식물체를 순화하는 단계는 기내에서 분화된 식물체를 모래와 질석이 1:1로 섞인 배양토에 옮겨 심고 22~28℃의 온도와 60~90%의 상대습도를 유지하면서 1차 순화하는 단계;로 구성되며, 추가적으로 1차 순화하는 단계 이후에 15~25℃의 온도와 60~90%의 상대습도를 유지하면서 2차 순화하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

온도가 일정하고 습도 및 영양분이 최적인 기내에서 식물조직배양을 통하여 증식된 개체를 외부환경으로 옮기는 경우 대부분의 개체가 열악한 환경에 적응하지 못하고 고사하므로 조직배양 과정 중 순화처리도 중요한 부분을 차지한다.

본 발명은 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용하여 노랑무늬붓꽃의 캘러스를 대량으로 증식할 수 있는 방법과 노랑무늬붓꽃을 대량으로 분화하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명은 노랑무늬붓꽃 개체에 그 양이 풍부한 잎 절편을 이용하기 때문에 재료에 제한이 없고, 특히 캘러스로부터 신초를 유도하는 단계와 신초로부터 뿌 리를 유도하는 단계에서 신초 및 뿌리 형성률이 매우 우수한 효과를 가진다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 노랑무늬붓꽃으로부터 잎 절편의 적출

기청산 식물원에서 분양받아 비닐온실에 이식하여 관리중인 4~5분얼의 노랑무늬붓꽃으로부터 4월 하순에 잎을 채취하여 조직배양에 이용하였다. 본 실험에서는 노랑무늬붓꽃의 종자 미확보로 무균상태에서 생장한 식물대신 외부환경에서 1년 이상 생장한 노랑무늬붓꽃을 이용하였다. 채취한 잎을 3차 증류수로 3번 씻어서 잎에 묻어있던 이물질을 제거하였다.

2. 적출된 잎 절편의 살균

실시예 1

증류수에 의해 이물질이 제거된 잎 절편을 1 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 40분간 살균하였다. 살균된 잎 절편을 3차 증류수로 3번 씻고 0.5cm정도의 크기로 잘라서 3MM paper로 물기를 완전히 제거한 후 치상하였다.

비교예 1

증류수에 의해 이물질이 제거된 잎 절편을 0.5 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 40분간 살균하였다. 살균된 잎 절편을 3차 증류수로 3번 씻고 0.5cm정도의 크기로 잘라서 3MM paper로 물기를 완전히 제거한 후 치상하였다.

표 1은 상기 실시예 1과 비교예 1의 조건에 의해 조직배양 했을 때의 오염률을 나타내고 있고 도 1은 비교예 1의 조건인 0.5 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 살균하고 조직배양 했을 때의 오염 상태를 나타낸 그림이다.

[표 1]

번호	살균액 조성	오염 발생률(%)
실시예 1	0.1% Tween20 1.0% HClO	1
비교예 1	0.1% Tween20 0.5% HClO	73.2

표 1에서 보이는 바와 같이 0.5 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액으로 살균한 개체는 전체 개체수의 70%이상이 곰팡이로 오염된 반면, 1 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액으로 살균한 개체는 1%만이 오염되었다.

3. 캘러스 ( Callus ) 유도

실시예 2 및 비교예 2

MS 기본배지에 3%의 수크로오스(Sucrose) 및 옥신(AUxin)류 식물생장 호르몬인 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 사이토키닌(Cytokinin)류 식물생장 호르몬인 BA(6-benzyladenine)을 혼용하여 첨가한 후 1M 농도의 수산화나트륨(NaOH)으로 pH를 5.7~5.8로 조절하고, 한천(Agar)을 0.9%로 첨가한 후 고압 멸균한 고체 배지를 살균된 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 조직배양 하기 위한 배지로 사용하였다. 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건으로 한정된 실시예 2 및 비교예 2의 각 조건 당 살균된 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 25개씩 치상하고 25℃에서 배양하여 캘러스를 유도하였다. 광 조건 중 명조건은 16시간 일조 처리하였고, 암조건은 24시간 암처리 하였다. 실시예 2 및 비교예 2의 구체적인 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건을 표 2에 나타내었다.

표 2는 실시예 2와 비교예 2의 구체적인 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건과 치상 후 3개월이 지났을 때의 캘러스 형성률을 나타내고 있다.

[표 2]

번호	식물생장 호르몬 조건(mg/L)				광 조건	캘러스 형성률(%)
실시예 2	2,4-D	3	BA	5	암조건	28
	2,4-D	5		1	암조건	12
	NAA	3		5	암조건	20
	NAA	5		3	암조건	16
비교예 2	2,4-D	3	BA	5	명조건	고사
		5		3	명조건	고사
		5		3	암조건	0
		1		5	명조건	고사
		1		5	암조건	0
		5		1	명조건	고사
	NAA	3		5	명조건	고사
		5		3	명조건	고사
		1		5	명조건	고사
		1		5	암조건	0
		5		1	명조건	고사
		5		1	암조건	0

표 2에서 보이는 바와 같이 명조건에서는 모든 개체가 갈변되어 고사하였고실시예 2의 조건에서는 치상 후 1개월이 경과 하였을 때 치상된 잎 절편의 끝에서 캘러스가 유도되기 시작하였고 치상 후 3개월이 지나서는 캘러스 형성률 20% 수준에서 캘러스가 형성되었다. 실시예 2의 조건 중에서 암조건 및 2,4-D 3mg/L와 BA 5mg/L를 혼용하였을 때 총 25개체 중 7개체에서 캘러스가 유도되어 28%로 가장 높게 나타났고, 암조건 및 NAA 3mg/L와 BA 5mg/L를 혼용하였을 때 총 25개체 중 5개체에서 캘러스가 유도되었다.

도 2는 명조건에서 캘러스를 유도하는 경우 잎 절편의 갈변현상을 나타낸 그림이고, 도 3은 노랑무늬붓꽃의 잎 절편으로부터 유도된 캘러스를 나타낸 그림이다. 도 4의 (a), (b), (c), (d)는 각각 암조건 및 실시예 2의 식물생장 호르몬 조건인 (a) 2,4-D 3mg/L + BA 5mg/L, (b) 2,4-D 5mg/L + BA 1mg/L, (c) NAA 3mg/L + BA 5mg/L, (d) NAA 5mg/L + BA 3mg/L에서의 캘러스 유도를 나타낸 그림이다.

4. 액체 현탁 배양에 의한 캘러스 ( Callus ) 증식

실시예 3 및 비교예 3

MS 기본배지에 3%의 수크로오스(Sucrose) 및 옥신(AUxin)류 식물생장 호르몬인 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 사이토키닌(Cytokinin)류 식물생장 호르몬인 BA(6-benzyladenine)을 혼용하여 첨가한 후 1M 농도의 수산화나트륨(NaOH)으로 pH를 5.7~5.8로 조절하고 고압 멸균한 액체 배지를 캘러스 증식을 위한 배지로 사용하였다.

고체 배지에서 유도된 캘러스를 액체 배지로 옮기고 진탕 배양기에서 25℃의 온도, 130rpm의 회전속도로 배양하였다. 명조건과 암조건 모두의 광 조건에서 배양하였으며, 실시예 3 및 비교예 3의 구체적인 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건을 표 3에 나타내었다.

[표 3]

번호	식물생장 호르몬 조건(mg/L)				광 조건	캘러스 증식상태
실시예 3	NAA	3	BA	5	명조건	10배이상 증식
비교예 3	2,4-D	3	BA	5	명조건	증식 안함
	2,4-D	3		5	암조건	증식 한함
	NAA	3		5	암조건	증식 안함

표 3은 실시예 3과 비교예 3의 구체적인 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건과 액체 배양 후 캘러스의 증식상태를 나타내고 있다. 표 3에서 보이는 바와 같이 잎 절편으로부터 캘러스를 유도하는 경우 암조건에서만 유도되었기 때문에 액체 배지에서의 캘러스 증식도 암조건에서 더 효율적으로 이루어질 것으로 예상되었으나, 암조건에서는 전혀 증식이 이루어지지 않았고 오히려 명조건에서 급격한 증식을 보여주었고, NAA 3mg/L와 BA 5mg/L를 혼용한 식물생장 호르몬 조건에서만 캘러스의 증식을 보였다.

도 5는 액체 배지에서 증식된 캘러스를 나타낸 그림이다.

5. 신초 ( Shoot ) 유도

실시예 4 및 비교예 4

MS 기본배지에 3%의 수크로오스(Sucrose) 및 옥신(AUxin)류 식물생장 호르몬인 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 사이토키닌(Cytokinin)류 식물생장 호르몬인 BA(6-benzyladenine)을 혼용하여 첨가한 후 1M 농도의 수산화나트륨(NaOH)으로 pH를 5.7~5.8로 조절하고, 한천(Agar)을 0.9%로 첨가한 후 고압 멸균한 고체 배지를 캘러스로부터 신초를 유도하기 위한 배지로 사용하였다. 광 조건은 16시간 일조 처리한 명조건만을 실시하였고, 캘러스를 상기의 고체 배지에 치상하고 25℃에서 배양하여 신초를 유도하였다. 실시예 4 및 비교예 4의 구체적인 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건을 표 4에 나타내었다.

표 4는 실시예 4와 비교예 4의 구체적인 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건과 치상 후 5개월이 지났을 때의 발생된 신초 개체수를 나타내고 있다.

[표 4]

번호	식물생장 호르몬 조건(mg/L)				광 조건	신초 개체수
실시예 4	NAA	3	BA	5	명조건	127
실시예 4	NAA	5	BA	3	명조건	47
비교예 4	2,4-D	3	BA	5	명조건	28
비교예 4	2,4-D	5	BA	1	명조건	10

표 4에서 보이는 바와 같이 2,4-D와 BA를 혼용한 식물생장 호르몬 조건에서는 NAA와 BA를 혼용한 식물생장 호르몬 조건에 비하여 발생된 신초 개체수가 매우 작았다. 캘러스를 고체 배지에 치상 한 후 4개월이 경과되었을 때 캘러스로부터 신초가 분화되기 시작하였으며, 5개월이 경과되었을 때 실시예 4 및 비교예 4의 모든 조건하에서 신초가 발생하였다.

실시예 4 및 비교예 4의 모든 조건하에서 한 개의 잎 절편으로부터 유도된 캘러스 세포 덩이로부터 신초는 10개 이상 유도되었으며, 특히 NAA 3mg/L와 BA 5mg/L를 혼용한 식물생장 호르몬 조건에서 가장 많은 신초가 발생하였다.

도 6은 캘러스로부터 유도된 신초의 초기 형태를 나타낸 그림이고, 도 7은 캘러스로부터 다수의 신초가 분화된 형태를 나타낸 그림이다.

6. 뿌리의 유도

실시예 5 및 비교예 5

MS 기본배지에 3%의 수크로오스(Sucrose) 및 옥신(AUxin)류 식물생장 호르몬인 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA(1-Naphthaleneacetic acid), IBA(Indole-3-Butyric Acid), IAA (indole-3-acetic acid)와 사이토키닌(Cytokinin)류 식물생장 호르몬인 BA(6-benzyladenine)을 혼용하여 첨가한 후 1M 농도의 수산화나트륨(NaOH)으로 pH를 5.7~5.8로 조절하고, 한천(Agar)을 0.9%로 첨가한 후 고압 멸균한 고체 배지를 신초로부터 뿌리를 유도하기 위한 배지로 사용하였다. 광 조건은 16시간 일조 처리한 명조건만을 실시하였고, 신초를 상기의 고체 배지에 치상하고 25℃에서 배양하여 뿌리를 유도하였다.

하나의 캘러스 세포 덩이 중 캘러스 등 필요 없는 조직은 버리고 다발적으로 발생한 신초를 여러 개의 신초로 나누어 각각의 배지에 계대배양 하였으며, 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건으로 한정된 실시예 5 및 비교예 5의 각 조건 당 12개의 신초를 배양한 후 뿌리 형성률을 조사하였다. 실시예 5 및 비교예 5의 구체적인 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건을 표 5에 나타내었다.

표 5는 실시예 5와 비교예 5의 구체적인 식물생장 호르몬의 종류와 농도 및 광 조건과 신초를 뿌리 유도 배지로 옮긴 후 1개월이 지났을 때의 뿌리 형성률을 나타내고 있다.

[표 4]

번호	식물생장 호르몬 조건(mg/L)				광 조건	뿌리 형성률(%)
실시예 5	IBA	5	BA	1	명조건	83
	IBA	5		3	명조건	60
	IAA	5		1	명조건	44
	IAA	5		3	명조건	57
비교예 5	NAA	5	BA	1	명조건	0
	NAA	5		3	명조건	0
	2,4-D	5		1	명조건	0
	2,4-D	5		3	명조건	0

표 5에서 보이는 바와 같이 신초 유도 배지와 다르게 옥신류로 NAA와 2,4-D를 이용한 배지에서는 뿌리 발생이 전혀 일어나지 않았으며 IBA와 IAA를 이용한 배 지에서 왕성한 뿌리발생을 나타내었다. 또한 IBA를 이용한 배지에서는 뿌리 발생뿐만 아니라 캘러스의 증식과 새로운 신초의 유발도 왕성하게 나타남을 볼 수 있었다(도 10 참조). 신초를 IBA 5mg/L와 BA 1mg/L의 뿌리 발생 배지로 옮긴 후 2개월이 지났을 때에는 모든 개체에서 뿌리가 발생하였다(결과 미도시).

도 8은 신초로부터 유도된 뿌리의 형태를 나타낸 그림이고, 도 9는 신초로부터 다수의 뿌리가 유도된 상태를 나타낸 그림이며, 도 10은 신초로부터 뿌리를 유도할 때 발생된 뿌리 및 다발적으로 새롭게 발생된 신초를 나타낸 그림이다.

도 8 및 도 9에서 보이는 바와 같이 조직배양을 통해 발생한 노랑무늬붓꽃의 뿌리는 줄기처럼 경직화된 푸른색의 조직과 하얀 솜털이 조밀하게 발생한 뿌리의 형태를 가지고 있어서 일반적인 노랑무늬붓꽃의 뿌리와 외형적으로 확연한 차이를 보였다. 이렇게 형태학적으로 차이를 보이는 것은 뿌리 발생과정의 차이로 인하여 일어나는 것으로 판단되며, 기능적인 면을 판단할 때는 뿌리가 발생한 개체가 미발생 개체보다 왕성한 성장을 보였기 때문에 영양분과 수분 흡수 등 뿌리의 기능에는 문제가 없는 것으로 보였다.

7. 순화 처리

온도가 일정하고 습도 및 영양분이 최적인 기내에서 식물조직배양을 통하여 증식된 개체를 외부환경으로 옮길 때 대부분의 개체가 열악한 외부환경에 적응하지 못하고 고사하므로 조직배양 과정 중 순화처리도 중요한 부분을 차지하고 있다.

기내에서 뿌리까지 유도된 노랑무늬붓꽃의 순화를 위하여 모래와 질석을 1:1로 섞은 배양토에 옮겨 심은 후 22~28℃의 온도와 60~90%의 상대습도를 유지시켜 주면서 1개월 동안 1차 순화를 실시하였다. 도 11과 같이 1차 순화 단계에서 모든 개체가 안정적으로 성장하였다.

1차 순화 후 습도는 계속 유지하고 15~25℃의 온도의 실내에서 2차 순화하였을 때도 도 12와 같이 모든 개체가 안정적으로 생존하였다. 그러나, 수분공급을 하지 않은 대조구에서는 배양토의 수분이 완전히 고갈된 후 2일 정도 지나자 시들기 시작하였으며(결과 미도시), 이러한 결과로부터 순화과정에서 습도유지가 가장 중요한 요인임을 알 수 있었다.

도 1은 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 0.5 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 살균하고 조직배양 했을 때의 오염 상태를 나타낸 그림이다.

도 2는 명조건에서 캘러스를 유도하는 경우 잎 절편의 갈변현상을 나타낸 그림이고, 도 3은 노랑무늬붓꽃의 잎 절편으로부터 유도된 캘러스를 나타낸 그림이다.

도 4의 (a), (b), (c), (d)는 각각 식물생장 호르몬 조건인 (a) 2,4-D 3mg/L + BA 5mg/L, (b) 2,4-D 5mg/L + BA 1mg/L, (c) NAA 3mg/L + BA 5mg/L, (d) NAA 5mg/L + BA 3mg/L에서의 캘러스 유도를 나타낸 그림이다.

도 5는 액체 배지에서 증식된 캘러스를 나타낸 그림이다.

도 11은 기내에서 뿌리까지 유도된 노랑무늬붓꽃을 1차 순화한 후의 형태를 나타낸 그림이고 도 12는 1차 순화된 노랑무늬붓꽃을 2차 순화한 후의 형태를 나타낸 그림이다.

Claims

노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편을 적출하는 단계;

적출된 잎 절편을 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

유도된 캘러스를 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬 및 수크로오스(Sucrose)를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지에 접종하고 명조건의 진탕 배양기에서 배양하여 캘러스를 증식하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃 캘러스의 대량증식방법.
제 1항에 있어서,

상기 캘러스를 유도하는 단계의 배지의 식물생장 호르몬은 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃 캘러스의 대량증식방법.
제 1 또는 제 2항에 있어서,

상기 잎 절편을 적출하는 단계 이후에 적출된 잎 절편을 1 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 살균하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃 캘러스의 대량증식방법.
제 1 또는 제 2항에 있어서,

상기 배지의 수크로오스는 농도가 3 중량%인 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃 캘러스의 대량증식방법.
제 1 또는 제 2항에 있어서,

상기 캘러스를 증식하는 단계의 배양 조건은 온도가 25℃이고 회전속도가 130rpm인 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃 캘러스의 대량증식방법.
노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)의 잎 절편을 적출하는 단계;

적출된 잎 절편을 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1- Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

유도된 캘러스를 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어진 식물생장 호르몬 및 수크로오스를 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 액체 배지에 접종하고 명조건의 진탕배양기에서 배양하여 캘러스를 증식하는 단계;

증식된 캘러스를 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 배양하여 신초를 유도하는 단계; 및

유도된 신초를 5mg/L의 IBA(Indole-3-Butyric Acid)와 1~3mg/L의 BA, 또는 5mg/L의 IAA (indole-3-acetic acid)와 1~3mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 슈크로즈, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 배지에 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 6항에 있어서,

상기 캘러스를 유도하는 단계의 배지의 식물생장 호르몬은 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA로로 이루어지는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 6항에 있어서,

상기 신초를 유도하는 단계의 배지의 식물생장 호르몬은 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 6항에 있어서,

상기 뿌리를 유도하는 단계의 배지의 식물생장 호르몬은 5mg/L의 IBA와 1mg/L의 BA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 배지의 수크로오스는 농도가 3 중량%인 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 배지의 한천 농도가 0.9 중량%인 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 잎 절편을 적출하는 단계 이후에 적출된 잎 절편을 1 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 살균하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 뿌리를 유도하는 단계 이후에 기내에서 분화된 식물체를 모래와 질석이 1:1로 섞인 배양토에 옮겨 심고 22~28℃의 온도와 60~90%의 상대습도를 유지하면서 1차 순화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 13항에 있어서,

상기 1차 순화하는 단계 이후에 15~25℃의 온도와 60~90%의 상대습도를 유지하면서 2차 순화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
노랑무늬붓꽃(Iris odaesanensis)으로 잎 절편을 적출하는 단계;

적출된 잎 절편을 3mg/L의 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)와 5mg/L의 BA(6-benzyladenine), 5mg/L의 2,4-D와 1mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA(1-Naphthaleneacetic acid)와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스(Sucrose), 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS(Murashige & Skoog) 배지에 암조건에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

유도된 캘러스를 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA, 또는 3~5mg/L의 NAA와 3~5mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 배지에 배양하여 신초를 유도하는 단계; 및

유도된 신초를 5mg/L의 IBA(Indole-3-Butyric Acid)와 1~3mg/L의 BA, 또는 5mg/L의 IAA (indole-3-acetic acid)와 1~3mg/L의 BA로부터 선택되는 식물생장 호르몬, 수크로오스, 및 한천을 포함하고 pH 5.7~5.8로 조정된 MS 배지에 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 15항에 있어서,

상기 캘러스를 유도하는 단계의 배지의 식물생장 호르몬은 3mg/L의 2,4-D와 5mg/L의 BA로로 이루어지는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 15항에 있어서,

상기 신초를 유도하는 단계의 배지의 식물생장 호르몬은 3mg/L의 NAA와 5mg/L의 BA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 15항에 있어서,

상기 뿌리를 유도하는 단계의 배지의 식물생장 호르몬은 5mg/L의 IBA와 1mg/L의 BA로 이루어지는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 배지의 수크로오스는 농도가 3 중량%인 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 배지의 한천 농도가 0.9 중량%인 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 잎 절편을 적출하는 단계 이후에 적출된 잎 절편을 1 중량%의 하이포아염소산(hypochlorous acid)과 0.1 중량%의 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 살균액에 살균하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 15항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 뿌리를 유도하는 단계 이후에 기내에서 분화된 식물체를 모래와 질석이 1:1로 섞인 배양토에 옮겨 심고 22~28℃의 온도와 60~90%의 상대습도를 유지하면서 1차 순화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.
제 22항에 있어서,

상기 1차 순화하는 단계 이후에 15~25℃의 온도와 60~90%의 상대습도를 유지하면서 2차 순화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법.