KR101664031B1 - 참취의 조직 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (1) 참취(Aster scaber)의 조직 절편체를 NAA(naphthaleneacetic acid) 및 BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지에 치상하고 배양하여 캘러스를 유도 및 증식하는 단계; (2) 재분화 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초(shoot)를 재분화하는 단계; (3) 발근을 위한 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 참취 식물체 조직 유래의 캘러스를 이용하여 참취 유식물체를 대량으로 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 참취 유식물체에 관한 것이다.

Description

참취의 조직 배양 방법{Method for tissue culture of Aster scaber}
본 발명은 참취의 조직 배양 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (1) 참취(Aster scaber)의 조직 절편체를 NAA(naphthaleneacetic acid) 및 BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지에 치상하고 배양하여 캘러스를 유도 및 증식하는 단계; (2) 재분화 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초(shoot)를 재분화하는 단계; (3) 발근을 위한 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 참취 식물체 조직 유래의 캘러스를 이용하여 참취 유식물체를 대량으로 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 참취 유식물체에 관한 것이다.
국민소득이 증가함에 따라 건강식품 및 무공해 식품에 대한 관심과 인기가 국민들 사이에 점차적으로 높아가고 있다. 그 중 취나물이라고도 불리는 참취는 가장 대표적인 산채이다.
참취(취나물, Aster scaber)는 국화과에 속하는 쌍떡잎식물로 한국, 일본, 중국 등지에 자생하는 것으로 알려져 있으며, 전통적으로 타박상, 해독, 두통, 현기증 등의 치료 약재로도 사용되어 왔다. 참취에서는 트리테르펜 배당체(triterpene glycoside), 향기성분(volatile compound) 등이 분리 및 확인된 바가 있으며, 최근 연구에서는 참취에 항알츠하이머, 항산화, 항바이러스(HIV-1) 효능을 나타내는 다양한 약리활성물질이 함유된 것으로 확인되어 약리활성물질 개발 소재로 많은 관심을 받고 있다.
최근 들어 종자 발아 실험에서 저장, 분류 및 화학적 특성에 이르는 다양한 연구가 수행되었다. 참취는 가을에 파종하여 종자를 직파하거나, 가을이나 이른 봄에 나온 2~3개의 포기 나누기를 한다. 그러나 종자 채종부터 묘생산까지의 기간이 너무 길고 발아가 되더라도 휴면타파를 해야 되거나 2차 휴면을 하는 수도 있어 발아가 고르지 못하고 발아율 또한 높지 못하다. 따라서 지금까지 이용되고 있는 종자나 포기나누기 보다 생산성이 높고 조기출하나 주년생산이 가능한 기내배양을 이용한 번식방법의 가능성을 모색하고자 하였다.
식물조직배양은 약리활성물질의 대량생산, 유전자 조작을 통한 품종개량 등 다양한 생물공학적 응용산업에 활용가치가 높은 기술이지만, 현재까지 참취에 대한 조직배양계, 특히 체세포배분화를 경유한 조직배양계는 확립된 바가 없다.
한편, 한국등록특허 제1078283호에서는 '폐버섯배지를 함유하는 유기배지를 이용한 참취의 재배방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2007-0003653호에서는 '신선초의 조직 배양 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '참취의 조직 배양 방법'에 대해서는 알려진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 참취 잎 절편체로부터 캘러스의 유도 및 증식의 두 가지를 고려한 최적 조건을 정립하기 위해, 생장조절물질인 NAA 및 BA의 농도를 다르게 첨가하여 제조한 25종의 MS 고체배지를 이용하여 확인한 결과, 5μM NAA 및 0.05μM BA가 첨가된 경우, 고효율의 캘러스의 유도 및 증식이 이루어지는 것을 확인하였다. 또한, 고농도의 25μM NAA 및 25μM BA가 첨가된 MS 고체배지에서 신초의 재분화가 가장 잘 이루어졌으며, 생장조절물질 무첨가 배지에서 발근이 가장 잘 이루어지는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명자들은 참취의 조직 배양을 통해 참취 유식물체의 대량생산 체계를 확립함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
(1) 참취(Aster scaber)의 조직 절편체를 NAA(naphthaleneacetic acid) 및 BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지에 치상하고 배양하여 캘러스를 유도 및 증식하는 단계;
(2) 재분화 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초(shoot)를 재분화하는 단계;
(3) 발근을 위한 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 참취 식물체 조직 유래의 캘러스를 이용하여 참취 유식물체를 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 참취 유식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 3~10μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 0.01~0.2μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지를 유효성분으로 함유하는 참취의 조직 절편체로부터 캘러스를 유도 및 증식하기 위한 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 20~30μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 20~30μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지를 유효성분으로 함유하는 참취 캘러스로부터 신초를 재분화하기 위한 배지 조성물을 제공한다.
본 발명을 통해 참취의 조직 배양을 통해 참취 유식물체의 대량생산 체계를 확립함으로써, 참취를 이용한 식품 산업 및 의약 산업에 매우 유용하게 이용될 수 있어, 관련 분야에 크게 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 다양한 농도의 NAA와 BA를 단용 또는 혼용처리한 MS 기본배지에서 참취의 서로 다른 3가지 조직 절편(잎, 엽병, 뿌리)으로부터 캘러스 유도효율과 증식효율을 조사한 결과이다. A: 캘러스 유도효율, B: 캘러스 증식효율.
도 2는 참취의 서로 다른 3가지 조직 절편(잎, 엽병, 뿌리)으로부터 유도된 캘러스의 대표적인 5가지 형태를 나타낸다. A: 녹색이면서 딱딱한 것, B: 하얀색이면서 뿌리도 발생하고 부드러운 것, C: 하얀색이면서 부드러운 것, D: 갈색이면서 부드러운 것, E: 하얀색이면서 딱딱한 것. B와 C 캘러스가 배발생 캘러스로 분화가 잘 되는 캘러스임.
도 3은 참취 캘러스로부터 체세포배분화 과정을 거쳐 식물체가 재분화되는 전과정 및 순화과정을 거쳐 토양에서 성장하고 있는 식물체를 보여주는 결과이다. A: 분화능을 가진 캘러스, B: 배발생 캘러스에서 체세포배분화 과정을 거쳐 발생하는 신초(shoot), C: 캘러스에서 분화된 신초, D: 생장조절물질이 첨가되지 않은 식물에서 완전한 식물체가 유도된 결과, E: 순화과정을 거쳐 토양으로 옮겨지기 전 식물체, F: 순화과정을 거쳐 토양에서 성장하고 있는 식물체.
도 4는 잎 절편으로부터 체세포배분화 과정을 경유하여 완전한 식물체를 유도하는 전반적인 과정 및 적정 조건을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 참취(Aster scaber)의 조직 절편체를 NAA(naphthaleneacetic acid) 및 BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지에 치상하고 배양하여 캘러스를 유도 및 증식하는 단계;
(2) 재분화 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초(shoot)를 재분화하는 단계;
(3) 발근을 위한 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 참취 식물체 조직 유래의 캘러스를 이용하여 참취 유식물체를 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (1) 단계의 MS 고체배지에 첨가된 NAA 및 BA는 3~10μM NAA 및 0.01~0.2μM BA일 수 있고, 바람직하게는 5μM NAA 및 0.05μM BA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 캘러스의 유도 및 증식은 NAA의 농도가 너무 낮거나(0.5μM) 높으면(25μM) 엽병이나 뿌리에서 유도된 캘러스의 증식은 억제되며, 잎에서 유도된 캘러스의 경우는 NAA의 농도가 낮으면(0.5μM) 증식이 억제되는 것으로 나타났다.
또한, BA 농도가 높고 NAA 농도가 낮으면 캘러스가 딱딱해지는 경향을 보여 안 좋았고, NAA 농도가 너무 높으면 잎에서 유도된 캘러스와 뿌리에서 유도된 캘러스는 갈변되는 경향이 있었다. 결론적으로 신초 재분화가 잘 되는 하얀색이면서 부드러운 캘러스(뿌리가 발생하는 것도 포함)는 NAA 5.0μM + BA 0~0.5μM 첨가된 배지에서 가장 양호하게 형성되었다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (2) 단계의 재분화 배지는 20~30μM NAA 및 20~30μM BA가 첨가된 MS 고체배지일 수 있고, 바람직하게는 25μM NAA 및 25μM BA가 첨가된 MS 고체배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (3) 단계의 발근을 위한 배지는 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 재분화된 신초의 뿌리 유도에는 다양한 농도의 NAA를 사용한 경우, 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 기본배지를 사용하는 경우와 큰 차이가 없고, 오히려 새로운 캘러스가 유도되고 신초 생장을 지연하는 문제가 발생하여 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 기본배지를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 참취 조직 절편체는 참취 잎 조직 절편체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은
(1) 참취(Aster scaber)의 잎 조직 절편체를 3~10μM NAA 및 0.01~0.2μM BA가 첨가된 MS 고체배지에 치상하고 배양하여 캘러스를 유도 및 증식하는 단계;
(2) 20~30μM NAA 및 20~30μM BA가 첨가된 MS 고체배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초(shoot)를 재분화하는 단계;
(3) 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 8~10주 동안 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 참취 식물체 잎 조직 유래의 캘러스를 이용하여 참취 유식물체를 대량으로 생산하는 방법일 수 있고,
바람직하게는,
(1) 참취(Aster scaber)의 잎 조직 절편체를 5μM NAA 및 0.05μM BA가 첨가된 MS 고체배지에 치상하고 배양하여 캘러스를 유도 및 증식하는 단계;
(2) 25μM NAA 및 25μM BA가 첨가된 MS 고체배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초(shoot)를 재분화하는 단계;
(3) 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 8~10주 동안 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 참취 식물체 잎 조직 유래의 캘러스를 이용하여 참취 유식물체를 대량으로 생산하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 참취 유식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 3~10μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 0.01~0.2μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지를 유효성분으로 함유하는 참취의 조직 절편체로부터 캘러스를 유도 및 증식하기 위한 배지 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 3~10μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 0.01~0.2μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지를 포함하며, 상기 3~10μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 0.01~0.2μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지에서 참취의 조직 절편체를 배양함으로써 캘러스를 유도 및 증식할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 20~30μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 20~30μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지를 유효성분으로 함유하는 참취 캘러스로부터 신초를 재분화하기 위한 배지 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 20~30μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 20~30μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지를 포함하며, 상기 20~30μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 20~30μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지에서 참취 캘러스를 배양함으로써 신초를 재분화시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다
재료 및 방법
식물재료
조직배양에 사용한 식물은 기내에서 발아시킨 참취 유묘를 사용하였다. 기내발아 참취 유묘 제작과정은 다음과 같다. 참취 씨앗을 70% 에탄올 용액에 1분간 침지시킨 후, 살균액(상용 락스 5% + Tween 20 1% 용액)에 5시간 침지시켰다. 무균 배양대에 옮긴 후 다시 70% 에탄올에 2분간 침지시킨 후, 멸균수로 3회 정도 세척한 후 필터페이퍼 위로 옮겨 물기를 제거하고, 기본 MS 배지에 30g/L 수크로스, 8g/L 아가를 첨가하고, 1N KOH를 이용하여 pH를 6.0이 되도록 한 다음 고압증기멸균(121℃, 20분) 후 페트리디쉬에 분주하여 제조한 MS 기본배지에 치상하였다. 이를 암조건에서 2일간 배양 후 식물 생육실(12시간 동안 26℃/광주기 또는 24℃/암주기)로 옮겼다.
캘러스 유도
캘러스 유도 조건의 분석은 무균발아 5~6주 경과한 유묘의 잎, 엽병, 뿌리 3가지 조직절편(0.5~1.0cm 크기 단편)을 이용하였고, 배지는 MS 기본배지에 NAA와 BA가 다양한 농도로 단용 또는 혼용 처리된 배지를 사용하였다. MS 기본배지는 무균발아 식물을 제조할 때 사용한 배지와 같고, 배지에 첨가된 NAA와 BA의 농도는 표 1에 나타낸 것과 같다. 캘러스 유도효율은 같은 조직 절편 5개를 한 배지에 치상하는 방식으로 3 반복 수행하였고, 5주 동안 배양한 후 캘러스를 형성하는 단편의 수로 산출하였다. 5주 동안의 배양 조건은 12시간 동안 26℃/광주기 또는 24℃/암주기였다. 캘러스의 증식효율은 5주 동안 형성된 캘러스의 무게를 측정하여 산출하였다.
식물 재분화
신초(Shoot) 재분화 효율 검토를 위하여 5주 동안 유도된 캘러스를 각각의 배지에 계대배양하여 약 4주간 증식시킨 후 하얗고 부드러운 캘러스들만 모두 모아 혼합한 후 캘러스 유도조건 검토용 배지(표 1)에 치상하였다. 신초 재분화효율 검토는 배지 당 9개의 캘러스 덩어리(Cluster)를 치상하였고, 이를 3 반복 수행하였으며, 캘러스 덩어리 중 신초를 형성하는 덩어리 수를 이용하여 산출하였다. 단, 같은 캘러스 덩어리에서 여러 개의 신초가 형성되더라도 이를 하나로 카운트하였고, 신초 형성율이 그리 높지 않아 반복에 대한 평균과 편차를 산출하는 데에는 무리가 있어 총 27개 캘러스 덩어리에서 신초가 형성된 덩어리 수로 효율을 평가하였다. 재분화된 신초의 뿌리 유도에는 다양한 농도의 NAA를 사용하여 보았으나, 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 기본배지를 사용하는 경우와 큰 차이가 없고, 오히려 새로운 캘러스가 유도되고 신초 생장을 지연하는 문제가 발생하여 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 기본배지를 사용하였다.
재분화식물 순화 및 토양 이식
기내에서 재분화된 식물은 우선 무균 배양대에서 배양용기의 캡을 단계적으로 열어 순화시키는 과정을 3일간 수행하였다(1일차에는 1시간, 2일에는 2시간, 3일차에는 3시간). 3일 후에는 배양용기의 식물을 꺼내서 뿌리에 붙어 있는 배지를 흐르는 물로 잘 세척한 다음 MS 무기양분으로 촉촉이 적신 멸균된 토양에 옮겨 심었고, 식물체를 투명비닐팩으로 씌워서 습도가 잘 유지되도록 한 다음 식물생육실(12시간 동안 26℃/광주기 또는 24℃/암주기)에서 순화시켰다. 습도유지를 위해 씌웠던 투명 비닐팩은 1주일 후 순차적으로 열어주었으며, 2주 후에는 완전히 제거하였다. 물은 1주일 동안은 하루에 2회 공급하였고, 그 다음부터는 하루에 1회 공급하였다. 이렇게 하여 식물생육실에서 약 3~4주간 순화시킨 후에는 생육이 적당한 자연조건으로 옮겨 성장시켰다.
실시예 1. 캘러스 유도 및 증식 조건
각 조직 절편(잎, 엽병, 뿌리)을 캘러스 유도조건 검토 배지 25종에 치상하여 배양한 결과 캘러스는 1~2주 후에 유도되기 시작하였으며, 모든 조직 절편에서 65% 이상의 유도효율을 보이는 배지는 M14~M25 배지인 총 12종이었다(도 1A). 이 결과는 캘러스 유도에 있어 옥신(NAA)이 사이토키닌(BA)보다 더 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 결과이며, NAA가 5.0~25.0μM이면 BA의 농도와는 무관하게 캘러스 유도가 왕성하게 일어난다는 것을 보여주는 결과였다. BA도 NAA의 농도가 낮을 경우 캘러스 유도에 영향을 미치기는 하였다. M11~M15 배지에서 캘러스 유도율을 보면 같은 NAA(0.5μM)의 농도에서 BA 농도가 증가할수록 캘러스 유도율도 증가하는 것을 알 수 있었다. 하지만 BA는 NAA 농도가 높아지면 캘러스 유도에 거의 영향을 주지 못하였고, NAA 농도가 낮으면 BA의 농도가 높아도 캘러스는 거의 이루어지지 않았다(M1~M10). 결론적으로 캘러스 유도에는 고농도의 NAA(5.0~25.0μM)가 매우 중요하다는 것을 확인하였다.
캘러스 증식효율에 있어서는 NAA 5.0μM에 BA가 첨가되지 않았거나 소량 첨가된 M16~M18 배지가 우수한 것으로 확인되었으며, 5주 동안 약 300mg의 캘러스가 유도/증식되는 것으로 확인되었다(도 1B). 특이할만한 것은 NAA의 농도가 너무 낮거나(0.5μM) 높으면(25μM) 엽병이나 뿌리에서 유도된 캘러스의 증식은 억제된다는 것인데, 잎에서 유도된 캘러스의 경우는 NAA의 농도가 낮으면(0.5μM) 증식이 억제되는 반면 높아도(25μM) 증식이 크게 억제되지는 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 캘러스 증식에 있어서도 NAA의 농도가 중요하다는 것으로 보여주는 것이다. 결론적으로 캘러스의 유도와 증식 두 가지를 모두 고려해 보았을 때, 가장 최적의 배지는 M17(NAA 5.0μM + BA 0.05μM) 배지가 최적인 것으로 확인되었다.
실시예 2. 캘러스 형태
M14~M25 배지에서 유도, 성장한 배지는 크게 5가지 다른 형태를 보였다. 5가지 형태는 녹색이면서 딱딱한 것, 하얀색이면서 뿌리도 발생하고 부드러운 것, 하얀색이면서 부드러운 것, 갈색이면서 부드러운 것, 하얀색이면서 딱딱한 것이었다(도 2). 5가지 형태 중 신초 재분화가 잘되는 배발생 캘러스는 하얀색이면서 뿌리도 발생하고 부드러운 것, 하얀색이면서 부드러운 것 두 가지였다. 이러한 배발생 캘러스는 잎, 엽병, 뿌리 모든 조직절편에서 M16~M18 배지를 사용하는 경우에 잘 형성되었다. 참고로 BA 농도가 높고 NAA 농도가 낮으면(M14~M15, M19~M20, M25 배지) 캘러스가 딱딱해지는 경향을 보여 안 좋았고, NAA 농도가 너무 높으면 잎에서 유도된 캘러스(M21~M22)와 뿌리에서 유도된 캘러스(M21~M25)는 갈변되는 경향이 있었다. 결론적으로 신초 재분화가 잘 되는 하얀색이면서 부드러운 캘러스(뿌리가 발생하는 것도 포함)는 NAA 5.0μM + BA 0~0.5μM 첨가된 M16~M18 배지에서 가장 양호하게 형성되었다.
실시예 3. 신초 재분화
유도/증식된 하얀색이면서 부드러운 캘러스(뿌리가 발생하는 것도 포함)들을 모두 혼합하여 표준화한 다음 일정량의 덩어리(9X3)를 각 배지에 치상하여 배양한 결과, 약 8주가 경과하였을 때 신초가 형성되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3B 및 도 3C). 신초는 하얀색이면서 부드러운 캘러스가 연한 노란색, 배발생 캘러스로 분화된 이후에 이 캘러스로부터 형성되는 것을 확인할 수 있었다(도 3B).
그리고 형성되는 신초는 체세포 배분화의 전형적인 모양 중의 하나인 하트 모양과 자엽발생초기 모양을 보이는 것을 확인할 수 있어(도 3B), 신초 재분화는 체세포배분화를 경유하는 것으로 판단되었다. 이러한 신초 재분화의 적정 배지는 캘러스가 유도된 조직절편에 따라 다른 것으로 확인되었다. 잎에서 유도된 캘러스의 경우는 M23~M25와 같이 NAA와 BA 농도가 높은(NAA 25.0μM + BA 5.0~25.0μM) 배지에서 재분화효율이 10%보다 높은 것으로 확인되었고, 뿌리에서 유도된 캘러스도 M24 배지와 같이 NAA와 BA 농도가 높은 배지(NAA 25.0μM + BA 5.0μM)에서 재분화효율이 10% 보다 높은 것으로 확인되었다. 잎이나 뿌리에서 유도된 캘러스와는 달리 엽병에서 유도된 캘러스의 경우는 NAA 0.5μM + BA 25.0μM이 포함된 M15 배지에서 가장 높은 신초 재분화효율(11.1 %)을 보여 높은 농도의 NAA가 요구되지 않는 것으로 확인되었다. 종합적으로 보면 신초의 재분화효율은 캘러스가 유도된 조직이 어떤 조직이냐에 따라 다르기는 하지만 일반적으로 높은 BA 농도가 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었고, 잎이나 뿌리에서 유도된 캘러스는 NAA와 BA 두 성분의 농도가 높은 M25(NAA 25μM + BA 25μM) 또는 M24(NAA 25μM + BA 5μM) 배지가 각각 적당한 것으로 확인되었고, 엽병에서 유도된 캘러스는 NAA 농도가 낮고 BA 농도가 높은 M15(NAA 0.5μM + BA 25μM) 배지가 적당한 것으로 확인되었다.
Figure 112014079087943-pat00001
실시예 4. 뿌리 유도
뿌리 유도에는 옥신이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 다양한 농도의 NAA를 첨가한 배지와 생장조절물질이 처리되지 않은 배지에 재분화된 신초를 치상하여 뿌리 유도 효율을 비교하여 보았으나, 뿌리 유도효율에는 큰 차이가 없어 보였고, 오히려 NAA(0.05μM)를 첨가한 배지에서는 새로운 캘러스가 유도되고 신초 생장이 억제되는 결과를 보았다. 결론적으로 재분화된 신초의 뿌리 유도에는 생장조절물질이 첨가되지 않은 배지가 오히려 적당한 것으로 확인되었다(도 3D).
실시예 5. 재분화식물 순화
재분화된 식물체의 순화는 재료 및 방법에 언급한 바와 같은 방법으로 3~4주 동안 시행하여 완성할 수 있었으며, 이후 적정한 자연조건에서 키워 완전한 식물체로 성장시킬 수 있었다(도 3E 및 3F).

Claims (9)

  1. (1) 참취(Aster scaber)의 잎 조직 절편체를 3~10μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 0.01~0.2μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지에 치상하고 배양하여 캘러스를 유도 및 증식하는 단계;
    (2) 20~30μM NAA 및 20~30μM BA가 첨가된 MS 고체배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초(shoot)를 재분화하는 단계;
    (3) 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 참취 식물체 조직 유래의 캘러스를 이용하여 참취 유식물체를 대량으로 생산하는 방법.
  2. 삭제
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  6. 삭제
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  8. 3~10μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 0.01~0.2μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지를 유효성분으로 함유하는 참취의 조직 절편체로부터 캘러스를 유도 및 증식하기 위한 배지 조성물.
  9. 20~30μM NAA(naphthaleneacetic acid) 및 20~30μM BA(benzyladenine)가 첨가된 MS 고체배지를 유효성분으로 함유하는 참취 캘러스로부터 신초를 재분화하기 위한 배지 조성물.
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