CN115088617B - 用于多倍体蒲公英植物组织培养的培养基和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于多倍体蒲公英植物组织培养的培养基和方法，属于植物组织培养技术领域。本发明的培养基包括诱导培养基，本发明的诱导培养基能够以多倍体蒲公英的叶片为外植体，经过25～30d的诱导培养，可获得愈伤组织，愈伤组织诱导率可达到100％。诱导出的绝大多数愈伤组织状态、长势良好，呈比较湿润的颗粒状，并且愈伤组织在诱导培养基上自主分化形成从生芽，减少了分化步骤，从而有效缩短培养时间。本发明的培养基还包括增殖培养基和生根培养基。采用本发明的培养基经25～30d诱导培养、25d增殖培养及25～30d生根培养即可移栽。

Description

用于多倍体蒲公英植物组织培养的培养基和方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及用于多倍体蒲公英植物组织培养的培养基和方法。
背景技术
蒲公英，多年生草本植物，含有多种健康营养成分，耐寒、耐旱、耐阴能力良好，抗逆性强，对光照条件的要求宽泛，能在不同类型的土壤中生长。在我国各地分布广泛，大多都生长于山坡草地、路旁、河岸、沙地和田间，是一种常见的野生植物。
蒲公英风味独特，营养丰富，食用价值高，可以生食、炒、做汤或泡水喝，此外蒲公英已被开发成多种保健食品；在医药上有广泛的医疗保健作用，具有清热解毒、通淋利尿、健胃消炎、消肿散结等多种功效，还可用作兽药，此外，在养颜护肤方面也有较好的防皱效果，延缓皮肤衰老。近年来国内外对蒲公英的药理作用进行了大量研究，主要集中在抗炎、抗氧化、抗癌、抗高血糖、抗血栓形成、抑菌、抗真菌、抗病毒和保肝利胆等方面。蒲公英作为一种药食兼用植物，在医药、食品、工业等领域的应用价值高，有着广阔的发展前景，以至于人们对它的需求量也与日俱增，已经可以规模化人工栽培。蒲公英的开发利用完成了种植、管理、加工、产销的整体专业化生产，是山区人民致富的一个主要产业。
人们在进行蒲公英人工栽培的过程中培育出了一些优质栽培种，并且还成功培育出多倍体蒲公英。例如，通过三倍体加倍得到的六倍体蒲公英营养和药用成分较普通蒲公英含量多，具有更高的营养价值和药用价值，实现了以高营养、高药用价值为目的的新品种的育种目标。但是，多倍体植株普遍具有育性下降的特点，其发芽率和结籽率普遍较低且存在生根缓慢的现象，采用多倍体蒲公英种子做发芽实验后，发现种子败育率高，生根缓慢，基本上要一个月至两个月才开始生根，有的甚至不长根，生长也较缓慢，在生产上很难利用。因而，如何实现多倍体蒲公英的高效培育是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供用于多倍体蒲公英植物组织培养的培养基和方法，本发明的方法能够实现多倍体蒲公英的高效培育。
本发明提供了用于多倍体蒲公英植物组织培养的培养基，包括诱导培养基；所述诱导培养基以MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：1.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和0.01～0.2mg/L的TDZ。
优选的，所述诱导培养基中TDZ的浓度为0.05～0.1mg/L。
优选的，所述培养基还包括生根培养基，所述生根培养基以MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：0.5mg/L的NAA和0.5～2mg/L的IBA。
优选的，所述生根培养基中IBA的浓度为1～1.5mg/L。
优选的，所述生根培养基还包括活性炭，所述生根培养基中活性炭的浓度为0.6～0.8g/L。
优选的，所述培养基还包括增殖培养基，所述增殖培养基以MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和0.01～0.03mg/L的TDZ。
本发明还提供了一种基于上述方案所述培养基的多倍体蒲公英植物组织培养方法，包括以下步骤：
1)将多倍体蒲公英的叶片置于诱导培养基中，进行诱导培养，得到丛生芽；
2)将所述丛生芽接种于生根培养基，进行生根培养，得到再生苗。
优选的，在得到再生苗后，还包括对所述再生苗进行炼苗后，移栽于基质中进行壮苗培养，得到多倍体蒲公英幼苗。
优选的，所述基质包括蛭石和菜园土；所述蛭石和菜园土的体积比为(1～2)：1。
优选的，所述壮苗培养的环境湿度为80％～90％。
本发明提供了用于多倍体蒲公英植物组织培养的培养基，包括诱导培养基，所述诱导培养基以MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：1.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和0.01～0.2mg/L的TDZ。本发明的诱导培养基能够以多倍体蒲公英的叶片为外植体，经过25～30d的诱导培养，可获得愈伤组织，愈伤组织诱导率可达到100％，诱导出的绝大多数愈伤组织状态、长势良好，呈比较湿润的颗粒状，并且愈伤组织在诱导培养基上能自主分化形成从生芽，减少了分化步骤，从而有效缩短培养时间。本发明的培养基能够进一步完善多倍体蒲公英高频再生体系，提高多倍体蒲公英的利用价值，进而满足人们在临床、食品、医药等方面对多倍体蒲公英的应用需求，为多倍体蒲公英的研究和产品开发提供一定的理论依据。
附图说明
图1为不同TDZ的浓度对外植体表现的影响；其中：A、B、C、D、E为12d时外植体的状态；1、2、3、4、5为25d时外植体的状态；
图2为蒲公英的增殖分化情况；其中：A、B、C为增殖分化10d时TDZ为0.01mg/L、0.03mg/L、0.05mg/L的培养情况；D、E、F为25d时TDZ为0.01mg/L、0.03mg/L、0.05mg/L的培养情况；
图3为蒲公英生根情况；其中A、B、C为生根培养10d时IBA为1mg/L、1.5mg/L、2mg/L的生根情况；D、E、F为70d后从瓶中取出的再生苗。
具体实施方式
本发明提供了用于多倍体蒲公英植物组织培养的培养基，包括诱导培养基；所述诱导培养基以MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：1.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和0.01～0.2mg/L的TDZ，进一步优选以MS为基础培养基，还只含有以下浓度的组分：1.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和0.01～0.2mg/L的TDZ。
多倍体蒲公英叶片在本发明的诱导培养基中培养能够形成明显的愈伤组织，且诱导出的愈伤组织状态、长势良好，呈比较湿润的颗粒状态。在本发明中，所述诱导培养基中TDZ的浓度优选为0.05～0.1mg/L，在这一浓度范围内，多倍体蒲公英叶片可直接分化产生丛生芽，且分化产生丛生芽的数量多、长势良好。低浓度TDZ更易产生芽的自主分化，随着TDZ的浓度的升高，由于TDZ的促进细胞分裂作用，更多是趋向于愈伤组织的产生，更易形成愈伤组织，愈伤组织的大小、质地也随之变的更佳。
在本发明中，所述培养基优选的还包括生根培养基，所述生根培养基以MS为基础培养基，优选的还包括以下浓度的组分：0.5mg/L的NAA和0.5～2mg/L的IBA；进一步优选以MS为基础培养基，还只含有以下浓度的组分：进一步优选以MS为基础培养基，还只含有以下浓度的组分。在本发明中，所述生根培养基中IBA的浓度优选为1～1.5mg/L。在本发明中，所述生根培养基优选的还包括活性炭，所述生根培养基中活性炭的浓度优选为0.6～0.8g/L；所述活性炭有利于诱导生根，进行根分化培养。本发明的生根培养基生根频率高，生根频率达90.5％，最早在7d能生根，10d时能观察到明显的根系。本发明的生根培养基对蒲公英根的诱导能力强，利于根的分化生长。
在本发明中，所述培养基优选的还包括增殖培养基，所述增殖培养基以MS为基础培养基，优选的还包括以下浓度的组分：1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和0.01～0.03mg/L的TDZ；进一步优选以MS为基础培养基，还只含有以下浓度的组分：1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和0.01～0.03mg/L的TDZ。在本发明中，所述增殖培养基能够有效诱导愈伤组织分化为丛生芽，且形成的芽数多，株粗壮，长势好。本发明通过合理设置TDZ的浓度，实现了较好的增殖分化效果，且材料生理状态的下降速度相对较慢。
本发明还提供了一种基于上述方案所述培养基的多倍体蒲公英植物组织培养方法，包括以下步骤：
1)将多倍体蒲公英的叶片置于诱导培养基中，进行诱导培养，得到丛生芽；
2)将所述丛生芽接种于生根培养基，进行生根培养，得到再生苗。
本发明首先将多倍体蒲公英的叶片置于诱导培养基中，进行诱导培养，得到丛生芽。
在本发明中，所述多倍体蒲公英优选为六倍体蒲公英。在本发明中，所述多倍体蒲公英的叶片优选为生长良好的幼嫩蒲公英材叶片，更优选为剪去头尾和边缘部分的的幼嫩蒲公英材叶片，促进产生更多的愈伤组织和丛生芽。在本发明中，所述叶片优选的经过切割处理；切割后的每块叶片的大小优选为0.5～1.5cm2，更优选为1cm2。
本发明将多倍体蒲公英的叶片置于诱导培养基前，优选的还包括对所述叶片进行清洗和灭菌；所述清洗优选的包括冲洗；所述冲洗的时间优选为30min，所述冲洗的目的是洗去叶片表面的灰尘等杂物；所述灭菌优选的包括依次进行的第一灭菌、第二灭菌和第三灭菌；所述第一灭菌优选的包括采用质量浓度为0.5％的多菌灵溶液对所述叶片进行浸泡，所述浸泡的时间优选为20～25min；所述浸泡过程优选的伴随震荡处理；所述第二灭菌优选的包括采用质量浓度为3％的次氯酸钠溶液进行浸泡，所述浸泡的时间优选为5～8min，更优选为6min；在所述第二灭菌后，优选的还包括采用无菌水对第二灭菌后的材料进行冲洗，所述冲洗的次数优选为3～4次，每次冲洗的时间优选为1min；所述第三灭菌优选的包括采用体积浓度为75％的酒精进行浸泡，所述浸泡的时间优选为20～60s，更优选为30～40s；在所述第三灭菌后，优选的还包括采用无菌水对所述第三灭菌后的材料进行冲洗，所述冲洗的次数优选为3～4次，每次冲洗的时间优选为1min。
在本发明中，所述诱导培养的时间优选为25～30d，更优选为28d。
得到丛生芽后，本发明将所述丛生芽接种于生根培养基，进行生根培养，得到再生苗。
本发明优选的还包括将没有分化为丛生芽的愈伤组织接种于增殖培养基，进行增殖分化培养，得到更多的丛生芽。本发明将所述愈伤组织接种于增殖培养基前，优选的还包括将愈伤组织切下，分割成小块。在本发明中，所述增殖分化培养的时间优选为25～35d，更优选为30d。
得到丛生芽后，本发明将所述丛生芽接种于生根培养基，进行生根培养，得到再生苗。
在将所述丛生芽接种于生根培养基前，本发明优选的还包括将丛生芽从基部切割为多株，选择生长状态较好的材料来进行切割，切割后的丛生芽块的大小优选为0.5cm*0.5cm，经过切割便于快速生根。在本发明中，所述生根培养的时间优选为25～30d，更优选为28d。
在得到再生苗后，本发明优选的还包括对所述再生苗进行炼苗后，移栽于基质中进行壮苗培养，得到多倍体蒲公英幼苗。
在本发明中，所述基质优选包括蛭石和菜园土；所述蛭石和菜园土的体积比优选为(1～2)：1。
在本发明中，所述壮苗培养的环境湿度优选为80％～90％，更优选为85％。
在本发明中，用于进行炼苗的再生苗优选为生长根系较多且生长良好的苗；所述炼苗优选的包括将承装有再生苗的培养瓶从培育室中取出，松动瓶盖，于室内进行第一炼苗，再完全揭去盖，进行第二炼苗；所述第一炼苗的时间优选为1～2d；所述第二炼苗的时间优选为2～3d；在所述炼苗后，优选的还包括将炼苗后的瓶苗从瓶中取出，清洗干净培养基；所述壮苗培养优选的于阴凉通风处进行。
在得到多倍体蒲公英幼苗后，本发明优选的还包括将多倍体蒲公英幼苗移栽至大田。
如无特殊说明，本发明对所用原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
1、材料
供试材料：叶片采自宜宾学院临港校区盆栽的蒲公英，材料为通过三倍体加倍而得到的六倍体蒲公英。本试验所有供试材料均来自同一株蒲公英，每次试验所用叶片采用随机选取原则，最好剪取生长状态较好的幼嫩叶片作为外植体，且外植体的接种也要随机进行。
组培试剂：MS培养基(20倍大量、20倍钙盐、100倍微量、100倍铁盐、100倍有机、100倍肌醇)、6-BA、NAA、TDZ、IBA、多菌灵、次氯酸钠、无水乙醇、无菌水、蔗糖、琼脂。
2、方法
1)培养基的配制和培养条件
配置基本培养基MS，加入蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L，灭菌后备用。整个组培过程在培养室中进行，培养条件为温度25±3℃，光照时间每天16h，光照强度1000～1500Lux。诱导培养基：MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.05mg/LTDZ。
2)培养基灭菌
将配置好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅，按照正确使用操作进行培养基的灭菌工作，灭菌完毕后关闭机器，将培养基转移至超净工作台上，喷洒消毒酒精，再进行紫外灯消毒20～30min，为后续接种工作做准备。
3)外植体消毒
剪取生长良好的幼嫩蒲公英材叶片，剪去头尾和边缘部分，然后将剩余部分剪成大小合适的小块，将其放入三角瓶中并用纱布包住瓶口，流水冲洗30min，洗去表面的灰尘等杂物；接着将0.5％多菌灵溶液倒入三角瓶，放振荡器震荡，处理25min，后转入3％次氯酸钠溶液中，灭菌大约6min，取出材料，并用无菌水反复冲洗3～4次，每次1min；最后用体积浓度为75％的酒精进行消毒，处理30s，再次用无菌水冲洗3～4次即可。
4)诱导培养
外植体消毒处理之后，在干净无菌的超净工作台上将其切割成大小相近的小块，大小约1cm2左右，然后接种在诱导培养基中。接种30个外植体，25d后统计再生外植体数以及产生愈伤的外植体数，并观察外植体有无自主分化产生芽。
实施例2
除诱导培养基中TDZ的浓度为0.01mg/L以外，其余和实施例1相同。
实施例3
除诱导培养基中TDZ的浓度为0.1mg/L以外，其余和实施例1相同。
实施例4
除诱导培养基中TDZ的浓度为0.2mg/L以外，其余和实施例1相同。
对比例1
除诱导培养基中TDZ的浓度为0以外，其余和实施例1相同。
实施例5
采用实施例1的方法对外植体诱导出愈伤组织后，将愈伤组织切下，分割成小块，接种到增殖培养基中(增殖培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.03mg/LTDZ)，定期观察其生长情况。接种30个外植体，增殖培养30d。
Figure BDA0003706954480000071
实施例6
除增殖培养基中TDZ的浓度为0.01mg/L以外，其余和实施例5相同。
实施例7
除增殖培养基中TDZ的浓度为0.05mg/L以外，其余和实施例5相同。
实施例8
将实施例5增殖分化产生的芽从基部切割为多株，尽量选择生长状态较好的材料来进行切割，可以稍微切小一点，大小要均匀，以便于快速生根。切好的材料接种到生根培养基中进行生根培养(生根培养基：1/2MS+0.5mg/LNAA+1mg/LIBA)，每瓶接种4个材料，培养时还需加入0.8g/L的活性炭，有利于诱导生根，进行根分化培养。接种后放置培养室内进行培养，记录材料的生根情况，统计生根频率。
Figure BDA0003706954480000081
实施例9
除生根培养基中IBA的浓度为1.5mg/L以外，其余和实施例8相同。
实施例10
除生根培养基中IBA的浓度为2mg/L以外，其余和实施例8相同。
实施例11
炼苗与移栽
挑选出生长根系较多且生长良好的苗，将其从培育室中取出，松动瓶盖1d，置于室内进行炼苗，然后部分开盖1d，最后完全揭去盖。2d后将瓶苗从瓶中取出，清洗干净上面的培养基，然后移栽到蛭石和菜园土体积比为2∶1的培养盒中，放置在阴凉通风处，湿度在80％～90％的环境中，最后移栽至大田。
结果分析
1、不同浓度TDZ对蒲公英组培诱导的影响
实施例1～4和对比例1以MS为基本培养基，均添加6-BA、NAA、TDZ这三种植物激素，添加6-BA和NAA浓度为1.5mg/L和0.5mg/L，以TDZ为单因素设浓度梯度，以此观察各浓度TDZ对蒲公英组培诱导的影响。外植体数以及产生愈伤的外植体数，统计结果见表1。诱导25天后的培育结果如图1所示，其中，为外植体分别在TDZ的浓度为0mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L的诱导培养基上的培育情况。观察发现：将外植体切块接种到愈伤组织诱导培养基上以后，4～5d左右切段开始出现膨胀，外植体的两端开始愈伤化，8d左右就可以看见切口处长出明显的愈伤组织。各组诱导培养基均可诱导出愈伤组织，其中诱导培养基1(对比例1)的愈伤组织诱导率较其他组别要稍低，且诱导出的愈伤组织状态、长势一般；而在诱导培养基5中，诱导出的绝大多数愈伤组织状态、长势良好，呈比较湿润的颗粒状。
表1TDZ对蒲公英组培诱导的影响
Figure BDA0003706954480000091
外植体接种后，观察蒲公英组培诱导情况，发现各组培养基均在诱导完愈伤组织之后有一部分是自主分化产生了芽的。诱导培养基2中，自主分化产生的芽的宽度和高度在所有组别中为最优，但产生芽的数量不多；诱导培养基3中，大部分外植体是在诱导出愈伤组织之后再自主分化产生了芽的，有一小部分外植体是直接分化产生了芽，在所有组别中分化产生芽的数量最多，且长势良好；诱导培养基4、5的自主分化产生芽的数量较诱导培养基3要少，且产生的芽较小；而诱导培养基1分化出芽的数量则显著低于其他培养基，且产生的芽也较小。
2、增殖分化
经过30d的培养，蒲公英的丛生苗数目明显增加。增殖培养开始生成愈伤组织和分化形成不定芽之后，不定芽数逐渐增多并不断生长。通过观察发现，TDZ的浓度为0.01mg/L组的芽呈卷曲、细长状；TDZ的浓度为0.03mg/L的形成芽数多，株高较其他组别更高，长势最好；高浓度组别TDZ的浓度为0.05mg/L的由于TDZ的促进细胞分裂作用，易形成更多颗粒状、质地疏松的愈伤组织但分化出的不定芽较低浓度TDZ更少。0.05mg/L浓度的培养基如果没有及时进行转接，很容易褐化死亡。
3、生根培养与移栽
结果参见图3。试验在培养基中添加一定浓度的植物生长调节剂吲哚丁酸(IBA)能够加速根的分化，并增加根数、根长及根粗，生根效果明显。结果表明：在MS基本培养基中添加0.5mg/L的NAA和适宜浓度的IBA这两种植物生长调节剂，能有效诱导试管苗生根，诱导的根短而粗，生根时间最早在7d能生根。
由表2可知：在添加了0.5mg/L的NAA并添加一定浓度的IBA对其根的诱导能力强，有利于蒲公英生根，在添加IBA浓度为1.0mg/L时生根频率最高，可达90.5％。可见，蒲公英丛生芽生根与植物生长调节剂的种类和浓度有密切的关系。
表2不同IBA浓度下对生根的影响
Figure BDA0003706954480000101
移栽结果：移栽成活率基本可以达到90％以上。
由此可见，本发明的培养基和方法有效缩短了培养时间，提高了多倍体蒲公英组培诱导和增殖分化步骤中的愈伤组织诱导率、自主分化产生了芽的数量及愈伤组织的生理状态。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (7)

1.一种多倍体蒲公英植物组织培养方法，包括以下步骤：
1)将多倍体蒲公英的叶片置于诱导培养基中，进行诱导培养，得到丛生芽；2)将所述丛生芽接种于生根培养基，进行生根培养，得到再生苗；
所述诱导培养基以MS为基础培养基，还添加了以下浓度的组分：1.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和0.05～0.1mg/L的TDZ；
所述生根培养基以MS为基础培养基，还添加了以下浓度的组分：0.5mg/L的NAA和0.5～2mg/L的IBA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基中IBA的浓度为1～1.5mg/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基还包括活性炭，所述生根培养基中活性炭的浓度为0.6～0.8g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括增殖培养基，所述增殖培养基以MS为基础培养基，还仅添加以下浓度的组分：1.0mg/L的6-BA、0.5mg./L的NAA和0.01～0.03mg/L的TDZ。
5.根据权利要求1所述的多倍体蒲公英植物组织培养方法，其特征在于，在得到再生苗后，还包括对所述再生苗进行炼苗后，移栽于基质中进行壮苗培养，得到多倍体蒲公英幼苗。
6.根据权利要求5所述的多倍体蒲公英植物组织培养方法，其特征在于，所述基质包括蛭石和菜园土；所述蛭石和菜园土的体积比为(1～2):1。
7.根据权利要求5所述的多倍体蒲公英植物组织培养方法，其特征在于，所述壮苗培养的环境湿度为80％～90％。
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