CN114532226A - 一种仙茅组织培养快繁的培养基组合及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域。本发明提供了一种仙茅组织培养快繁的培养基组合及方法，所述培养基组合包括初代愈伤组织诱导培养基、继代愈伤组织诱导培养基、芽诱导培养基、芽分化培养基、叶片生长培养基、生根诱导培养基、根系驯化培养基。本发明的方法操作简便，成本低、见效快，生长周期短，可以较容易地通过组织培养快速繁殖技术获得大量仙茅小苗，为仙茅规模化生产提供种源。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种仙茅组织培养快繁的培养基组合及方法。
背景技术
自古以来，人们对植物的认识，都是伴随着对它们的应用与开发，尤其是野生植物资源。这些植物一旦被认为存在某种价值之后，就会被人为栽种，随之而来的是展开观察与研究。伴随着认识的深入，大规模的、科学化的栽培与应用也接踵而至。比如仙茅科(APG分类系统)植物，近几十年来，人们对它们在识别、栽培和药用价值上的研究非常多，也取得了很好的进展，但仅局限在仙茅属植物(Curculigo Gaertn.)的研究上。对此科的另外一个属小金梅草属(HypoxisL.)的研究，国内并不多见，但是其价值却不容忽视。究其原因，可能国内这个属的植物并不多，没有引起足够的重视。但是，小金梅草属植物的药用价值和其他用途却受到了世界上很多国家的广泛关注。
小金梅草属(HypoxisL.)约有植物100种，广泛分布于热带地区，我国仅1种。该属植物具球茎，可以在地下躲过恶劣的冬季或旱季，到下一个生长季节继续生长。球茎切面呈现白色或黄色(有的为橙色)，具粘液，切口(或切片)暴露在空气中，很快就会被氧化变黑。本属的大多数种类，叶基生呈线形，分两列；花呈亮黄色。小金梅草属植物具有广泛的药用价值，尤其在非洲大陆具有悠久的药用历史，如Hypoxis hemerocallidea和Hypoxiscolchicifolia是南非传统的药物，可制作药酒，Hypoxis hemerocallidea被用作艾滋病毒/艾滋病患者的免疫助推器，等等；此外，小金梅草属植物由于多年生且观赏性较强，也是很多园林地被植物的选择之一。
非洲仙茅(Hypoxis obtusa)是非洲特有药用植物，在非洲大陆具有悠久的药用历史，目前在南非用于初级卫生保健，作为艾滋病毒/艾滋病患者的免疫增强剂，因此具有经济价值。从非洲仙茅提取的分析药用活性成分，将有助于开发一系列的保健品和药品。到目前为止，现有技术中还没有专门针对非洲仙茅组织培养的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供提供一种仙茅组织培养快繁的培养基组合及方法；本发明所述方法操作简便，成本低、见效快，本发明所述的培养基组合和快繁方法可以较容易地通过组织培养快速繁殖技术获得大量仙茅苗，从而为规模化生产仙茅提供种源。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种仙茅组织培养快繁的培养基组合，包括初代愈伤组织诱导培养基、继代愈伤组织诱导培养基、芽诱导培养基、芽分化培养基、叶片生长培养基、生根诱导培养基、根系驯化培养基；
所述初代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括1.5～1.7mg/L的6-BA、0.9～1.0mg/L的IBA、0.09～0.11mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述继代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括0.7～0.9mg/L 6-BA、0.08～0.12mg/L的IBA、0.09～0.11mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述芽诱导培养基以MS为基础培养基，还包括0.09～0.11mg/L的NAA、2.8～3.2mg/L的6-BA、0.8～1.2g/L的花宝1号、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述芽分化培养基以MS为基础培养基，还包括0.04～0.06mg/L的NAA、0.35～0.45mg/L的6-BA、0.4～0.6g/L的花宝1号、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述叶片生长培养基以MS为基础培养基，还包括0.35～0.45mg/L的6-BA、0.08～0.12mg/L的IBA、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述生根诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括0.4～0.6mg/L的IBA、质量百分含量为0.25％～0.35％的活性炭、10～20g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述根系驯化培养基以1/2MS为基础培养基液，还包括1～2mg/L的IBA、15～30g/L的蔗糖。
作为优选，所述初代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括1.55～1.65mg/L的6-BA、0.95mg/L的IBA和0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
作为优选，所述继代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括0.75～0.85mg/L的6-BA、0.09～0.11mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
作为优选，所述芽诱导培养基以MS为基础培养基，还包括0.1mg/L的NAA、2.9～3.1mg/L的6-BA、0.9～1.1g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
作为优选，所述芽分化培养基以MS为基础培养基，还包括0.05mg/L的NAA、0.4mg/L的6-BA、0.5g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
作为优选，所述叶片生长培养基以MS为基础培养基，还包括0.4mg/L的6-BA、0.09～0.11mg/L的IBA、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
作为优选，所述生根诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括0.5mg/L IBA、质量百分含量为0.3％的活性炭、15g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
作为优选，所述根系驯化培养基以1/2MS为基础培养基液，还包括1.5mg/L的IBA、20g/L的蔗糖。
本发明还提供了所述组织培养快繁仙茅的方法，包括如下步骤：
(1)将花苞消毒后接种到初代愈伤组织诱导培养基中培养10～20天，得到萌动的花苞；
(2)将萌动的花苞切开后接种到继代愈伤组织诱导培养基，培养得到球茎愈伤组织；
(3)将球茎愈伤组织接入芽诱导培养基，培养15～25天后转入芽分化培养基中，培养得到带芽球茎；
(4)将带芽球茎接入叶片生长培养基，培养15～25天后转入生根诱导培养基，生根后得到仙茅苗生根苗；
(5)将仙茅苗生根苗接入根系驯化无菌培养介质上，培养55～65天后得到根系发达叶片壮硕的仙茅苗驯化苗。
作为优选，所述花苞为三月中旬至四上旬的花苞。
作为优选，所述消毒的方法为：先用70～80％酒精消毒30～90s，再用0.05～0.15％的升汞消毒8～10min，用无菌水冲洗8～10次。
本发明提供了一种仙茅组织培养快繁的培养基组合及方法，所述培养基组合包括初代愈伤组织诱导培养基、继代愈伤组织诱导培养基、芽诱导培养基、芽分化培养基、叶片生长培养基、生根诱导培养基、根系驯化培养基。本发明的方法操作简便，成本低、见效快，生长周期短，可以较容易地通过组织培养快速繁殖技术获得大量仙茅小苗，为规模化生产仙茅提供种源。
附图说明
图1为花苞愈伤组织膨大的照片；
图2为球状丛生芽横切后挨着空气的球面照片；
图3为球状丛生芽横切后培养基内部的球面照片；
图4为球状丛生芽横切面位置的照片；
图5为丛生苗的照片；
图6为生根诱导培养基上发生的白色根点的照片；
图7为根系驯化培养基质上培养15天根的照片；
图8为带芽球茎接入生根诱导培养基上培养15天根的照片；
图9为仙茅生根苗接入根系驯化培养基上培养7天的照片。
具体实施方式
本发明提供了一种仙茅组织培养快繁的培养基组合，包括初代愈伤组织诱导培养基、继代愈伤组织诱导培养基、芽诱导培养基、芽分化培养基、叶片生长培养基、生根诱导培养基、根系驯化培养基。
在本发明中，所述初代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，优选还包括1.5～1.7mg/L的6-BA、0.9～1.0mg/L的IBA、0.09～0.11mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶，进一步优选为1.55～1.65mg/L的6-BA、0.95mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、28～32g/L的蔗糖、1.2～1.8g/L的明胶，再进一步优选为1.6mg/L的6-BA、0.95mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
在本发明中，所述继代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，优选还包括0.7～0.9mg/L的6-BA、0.08～0.12mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶，进一步优选为0.75～0.85mg/L的6-BA、0.09～0.11mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、28～32g/L的蔗糖、1.2～1.8g/L的明胶，再进一步优选为0.8mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
在本发明中，所述芽诱导培养基以MS为基础培养基，优选还包括0.09～0.11mg/L的NAA、2.8～3.2mg/L的6-BA、0.8～1.2g/L的花宝1号、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶，进一步优选为0.1mg/L的NAA、2.9～3.1mg/L的6-BA、0.9～1.1g/L的花宝1号、28～32g/L的蔗糖、1.2～1.8g/L的明胶，再进一步优选为0.1mg/L的NAA、3mg/L的6-BA、1g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
在本发明中，所述芽分化培养基以MS为基础培养基，优选还包括0.04～0.06mg/L的NAA、0.35～0.45mg/L的6-BA、0.4～0.6g/L的花宝1号、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶，进一步优选为0.05mg/L的NAA、0.4mg/L的6-BA和0.5g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
在本发明中，所述叶片生长培养基以MS为基础培养基，优选还包括0.35～0.45mg/L的6-BA、0.08～0.12mg/L的IBA、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶，进一步优选为0.4mg/L的6-BA、0.09～0.11mg/L的IBA、28～32g/L的蔗糖、1.2～1.8g/L的明胶，再进一步优选为0.4mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
在本发明中，所述生根诱导培养基以1/2MS为基础培养基，优选还包括0.4～0.6mg/LIBA、质量百分含量为0.25％～0.35％的活性炭、10～20g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶，进一步优选为0.5mg/L的IBA、质量百分含量为0.3％的活性炭、15g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
在本发明中，所述所述根系驯化培养基以1/2MS为基础培养基液，还包括1～2mg/L的IBA、15～30g/L的蔗糖，进一步优选为1.5mg/L的IBA、20g/L的蔗糖。
在本发明中，所述所述根系驯化培养基使用时添加到细蛭石、椰糠、泥炭按照体积比2～4:0.5～1.5:0.5～1.5制成的混合培养介质中，进一步优选为添加到细蛭石、椰糠、泥炭按照体积比3:1:1制成的混合培养介质中。
在本发明中，所述初代愈伤组织诱导培养基、继代愈伤组织诱导培养基、芽诱导培养基、芽分化培养基、叶片生长培养基、生根诱导培养基、根系驯化培养基的pH值优选为5.4～6.2，进一步优选为5.6～6.0，再进一步优选为5.8
在本发明中，所述6-BA为6-苄氨基腺嘌呤。
在本发明中，所述NAA为α-萘乙酸。
在本发明中，所述IBA为吲哚丁酸。
在本发明中，所述TDZ为噻苯隆。
本发明还提供了所述组织培养快繁仙茅的方法，包括如下步骤：
(1)将花苞消毒后接种到初代愈伤组织诱导培养基中培养10～20天，得到萌动的花苞；
(2)将萌动的花苞切开后接种到继代愈伤组织诱导培养基，培养得到球茎愈伤组织；
(3)将球茎愈伤组织接入芽诱导培养基，培养15～25天后转入芽分化培养基中，培养得到带芽球茎；
(4)将带芽球茎接入叶片生长培养基，培养15～25天后转入生根诱导培养基，生根后得到仙茅苗生根苗；
(5)将仙茅苗生根苗接入根系驯化无菌培养介质上，培养55～65天后得到根系发达叶片壮硕的仙茅苗驯化苗。
在本发明中，所述步骤(1)中培养时间优选为12～18天，进一步优选为15天。
在本发明中，所述步骤(1)中培养的温度优选为20～30℃，进一步优选为23～27℃，再进一步优选为25℃。
在本发明中，所述步骤(1)中培养时的光照时间优选为10～14h/d，进一步优选为11～13h/d，再进一步优选为12h/d。
在本发明中，所述步骤(1)中培养时的光照强度优选为1500～2500lx，进一步优选为1800～2200lx，再进一步优选为2000lx。
在本发明中，所述步骤(2)中的萌动的花苞切开时优选用四刀切成八块。
在本发明中，所述步骤(3)中培养时间优选为18～22天，进一步优选为20天。
在本发明中，所述步骤(3)中的球茎愈伤组织优选在接入芽诱导培养基前切开。
在本发明中，所述切开的方法优选为将球茎愈伤组织切成单个芽。
在本发明中，所述步骤(4)中培养时间优选为18～22天，进一步优选为20天。
在本发明中，所述步骤(5)中培养时间优选为55～65天，进一步优选为60天。
在本发明中，所述花苞优选为三月中旬至四上旬的花苞。
在本发明中，所述消毒的方法优选为：先用70～80％酒精消毒30～90s，再用0.05～0.15％的升汞消毒8～10min，用无菌水冲洗8～10次，进一步优选为先用75％酒精消毒60s，再用0.1％的升汞消毒9min，用无菌水冲洗9次。
在本发明中，所述步骤(4)中得到的仙茅苗长度优选为14～16cm，进一步优选为15cm。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)培养基配制：
初代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括1.5mg/L的6-BA、0.9mg/L的IBA、0.09mg/L的TDZ、25g/L的蔗糖、1g/L的明胶，pH调节为5.4；
继代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.7mg/L的6-BA、0.08mg/L的IBA和0.1mg/L的TDZ、25g/L的蔗糖、1g/L的明胶，pH调节为5.4；
芽诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.09mg/L的NAA、2.8mg/L的6-BA、0.8g/L的花宝1号、25g/L的蔗糖、1g/L的明胶，pH调节为5.4；
芽分化培养基：以MS为基础培养基，还包括0.04mg/L的NAA、0.35mg/L的6-BA、0.4g/L的花宝1号、25g/L的蔗糖、1g/L的明胶，pH调节为5.4；
叶片生长培养基：以MS为基础培养基，还包括0.35mg/L的6-BA、0.08mg/L的IBA、25g/L的蔗糖、1g/L的明胶pH调节为5.4；
生根诱导培养基：以1/2MS为基础培养基，还包括0.4mg/L的IBA、质量百分含量为0.25％的活性炭、10g/L的蔗糖、1g/L的明胶，pH调节为5.5；
根系驯化诱导培养基：以1/2MS为基础培养基液，还包括1mg/L的IBA、15g/L的蔗糖；
将根系驯化诱导培养基添加到以细蛭石、细椰糠、细泥炭体积比2:1.5:1.5制成的混合培养介质中，pH调节为5.5；
(2)在3月11日采集仙茅花苞，先用70％酒精消毒90s，再用0.05％的升汞消毒10min，用无菌水冲洗8次，得到消毒后的花苞；
(3)将消毒后的花苞接种到初代愈伤组织诱导培养基中培养10天，外植体开始膨大，花瓣开始张开花蕊开始萌动，得到萌动的花苞；
(4)将萌动的花苞用四刀切成八块后接种到继代愈伤组织诱导培养基，培养得到球茎愈伤组织；
(5)将球茎愈伤组织接入芽诱导培养基，培养15天后转入芽分化培养基中，培养得到带芽球茎；
(6)将带芽球茎分割成单个的芽，将其接入叶片生长培养基，培养15天后转入生根诱导培养基，生根后得到带浅根系的仙茅苗生根苗；
(7)将带浅根系根仙茅苗接入根系驯化无菌培养介质上，培养2个月后得到根系发达叶片壮硕的仙茅苗驯化苗；
(8)仙茅苗驯化苗长至14cm时进行炼苗与移栽，炼苗时先去除封口膜放置15d，待叶片长出瓶口后，将带有培养基质的驯化苗移栽至小盆；所用基质为1.5：0.5的腐殖质和蛭石，高温灭菌后使用；移栽后将基质浇透水以后不用浇水保持通风干燥，一个月后再浇透一次。
实施例2
(1)培养基配制：
初代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括1.7mg/L的6-BA、1.0mg/L的IBA、0.11mg/L的TDZ、35g/L的蔗糖、2g/L的明胶，pH调节为6.2；
继代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.9mg/L的6-BA、0.12mg/L的IBA和0.11mg/L的TDZ、35g/L的蔗糖、2g/L的明胶，pH调节为6.2；
芽诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.11mg/L的NAA、3.2mg/L的6-BA、1.2g/L的花宝1号、35g/L的蔗糖、2g/L的明胶，pH调节为6.2；
芽分化培养基：以MS为基础培养基，还包括0.06mg/L的NAA、0.45mg/L的6-BA、0.6g/L的花宝1号、35g/L的蔗糖、2g/L的明胶，pH调节为6.2；
叶片生长培养基：以MS为基础培养基，还包括0.45mg/L的6-BA、0.12mg/L的IBA、35g/L的蔗糖、2g/L的明胶，pH调节为6.2；
生根诱导培养基：以1/2MS为基础培养基，还包括0.6mg/L的IBA、质量百分含量为0.35％的活性炭、20g/L的蔗糖、2g/L的明胶，pH调节为6.0；
根系驯化诱导培养基：以1/2MS为基础培养基液，还包括2mg/L的IBA、30g/L的蔗糖；
将根系驯化诱导培养基添加到以细蛭石、细椰糠、细泥炭体积比4:0.5:0.5制成的混合培养介质中，pH调节为5.8；
(2)在3月30日采集仙茅花苞，先用80％酒精消毒30s，再用0.15％的升汞消毒8min，用无菌水冲洗10次，得到消毒后的花苞；
(3)将消毒后的花苞接种到初代愈伤组织诱导培养基中培养20天，外植体开始膨大，花瓣开始张开花蕊开始萌动，得到萌动的花苞；
(4)将萌动的花苞用四刀切成八块后接种到继代愈伤组织诱导培养基，培养得到球茎愈伤组织；
(5)将球茎愈伤组织接入芽诱导培养基，培养25天后转入芽分化培养基中，培养得到带芽球茎；
(6)将带芽球茎分割成单个的芽，将其接入叶片生长培养基，培养15天后转入生根诱导培养基，生根后得到带浅根系的仙茅苗生根苗；
(7)将带浅根系根仙茅苗接入根系驯化无菌培养介质上，培养2个月后得到根系发达叶片壮硕的仙茅苗驯化苗；
(8)仙茅苗驯化苗长至14cm时进行炼苗与移栽，炼苗时先去除封口膜放置15d，待叶片长出瓶口后，将带有培养基质的驯化苗移栽至小盆；所用基质为1.5：0.5的腐殖质和蛭石，高温灭菌后使用；移栽后将基质浇透水以后不用浇水保持通风干燥，一个月后再浇透一次。
实施例3
(1)培养基配制：
初代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括1.6mg/L的6-BA、0.95mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶，pH调节为5.8；
继代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.8mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶，pH调节为5.8；
芽诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.1mg/L的NAA、3.0mg/L的6-BA、1g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶，pH调节为5.8；
芽分化培养基：以MS为基础培养基，还包括0.05mg/L的NAA、0.4mg/L的6-BA、0.5g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶，pH调节为5.8；
叶片生长培养基：以MS为基础培养基，还包括0.4mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶，pH调节为5.8；
生根诱导培养基：以1/2MS为基础培养基，还包括0.5mg/L的IBA、质量百分含量为0.3％的活性炭、15g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶，pH调节为5.8；
根系驯化诱导培养基：以1/2MS为基础培养基液，还包括1.5mg/L的IBA、20g/L的蔗糖；
将根系驯化诱导培养基添加到以细蛭石、细椰糠、细泥炭体积比3:1:1制成的混合培养介质中，pH调节为5.8；
(2)在4月10日采集仙茅花苞，先用75％酒精消毒40s，再用0.1％的升汞消毒9min，用无菌水冲洗9次，得到消毒后的花苞；
(3)将消毒后的花苞接种到初代愈伤组织诱导培养基中培养15天，外植体开始膨大，花瓣开始张开花蕊开始萌动，得到萌动的花苞；
(4)将萌动的花苞用四刀切成八块后接种到继代愈伤组织诱导培养基，培养得到球茎愈伤组织；
(5)将球茎愈伤组织接入芽诱导培养基，培养20天后转入芽分化培养基中，培养得到带芽球茎；
(6)将带芽球茎分割成单个的芽，将其接入叶片生长培养基，培养15天后转入生根诱导培养基，生根后得到带浅根系的仙茅苗生根苗；
(7)将带浅根系根仙茅苗接入根系驯化无菌培养介质上，培养3个月后得到根系发达叶片壮硕的仙茅苗驯化苗；
(8)仙茅苗驯化苗长至14cm时进行炼苗与移栽，炼苗时先去除封口膜放置15d，待叶片长出瓶口后，将带有培养基质的驯化苗移栽至小盆；所用基质为1.5：0.5的腐殖质和蛭石，高温灭菌后使用；移栽后将基质浇透水以后不用浇水保持通风干燥，一个月后再浇透一次。
对比例1
(1)培养基配制：
初代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括1.5mg/L的6-BA、0.9mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
继代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.7mg/L的6-BA、0.08mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
芽诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.09mg/L的NAA、2.8mg/L的6-BA、0.8g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
芽分化培养基：以MS为基础培养基，还包括0.04mg/L的NAA、0.35mg/L的6-BA和0.4g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
叶片生长培养基：以MS为基础培养基，还包括0.35mg/L的6-BA、0.08mg/L的IBA、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
生根诱导培养基：以1/2MS为基础培养基，还包括0.4mg/L的IBA、质量百分含量为0.25％的活性炭、20g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
根系驯化诱导培养基：以1/2MS为基础培养基液，还包括1.5mg/L的IBA、20g/L的蔗糖；
将根系驯化诱导培养基添加到以细蛭石、细椰糠、细泥炭体积比3:1:1制成的混合培养介质中，pH调节为5.8；
(2)在5月20日采集仙茅花苞，先用70％酒精消毒90s，再用0.05％的升汞消毒10min，用无菌水冲洗8次，得到消毒后的花苞；
(3)将消毒后的花苞接种到初代愈伤组织诱导培养基中培养10天，外植体开始膨大，花瓣开始张开花蕊开始萌动，得到萌动的花苞；
(4)将萌动的花苞用四刀切成八块后接种到继代愈伤组织诱导培养基，培养得到球茎愈伤组织；
(5)将球茎愈伤组织接入芽诱导培养基，培养15天后转入芽分化培养基中，培养得到带芽球茎；
(6)将带芽球茎分割成单个的芽，将其接入芽伸长培养基，培养15天后转入根伸长培养基，生根后得到仙茅苗；
(7)仙茅苗长至14cm时进行炼苗与移栽，炼苗时先去除封口膜放置15d，待叶片长出瓶口后，将带有培养基质的驯化苗移栽至小盆；所用基质为1.5：0.5的腐殖质和蛭石，高温灭菌后使用；移栽后将基质浇透水以后不用浇水保持通风干燥，一个月后再浇透一次。
对比例2
(1)培养基配制：
初代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括1.5mg/L的6-BA、0.9mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
继代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.7mg/L的6-BA、0.08mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
芽诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.09mg/L的NAA、2.8mg/L的6-BA、0.8g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
芽分化培养基：以MS为基础培养基，还包括0.04mg/L的NAA、0.35mg/L的6-BA、0.4g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
叶片生长培养基：以MS为基础培养基，还包括0.35mg/L的6-BA、0.08mg/L的IBA、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
生根诱导培养基：以1/2MS为基础培养基，还包括0.4mg/LIBA、质量百分含量为0.25％的活性炭、20g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
根系驯化诱导培养基：以1/2MS为基础培养基液，还包括1.5mg/L的IBA、20g/L的蔗糖；
将根系驯化诱导培养基添加到以细蛭石、细椰糠、细泥炭体积比3:1:1制成的混合培养介质中，pH调节为5.8；
(2)在3月11日采集仙茅球茎，先用70％酒精消毒90s，再用0.05％的升汞消毒10min，用无菌水冲洗8次，得到消毒后的球茎；
(3)将消毒后的球茎接种到初代愈伤组织诱导培养基中培养15天，外植体开始膨大；
(4)将膨大的愈伤组织切块后接种到继代愈伤组织诱导培养基，培养得到原球茎愈伤组织；
(5)将原球茎愈伤组织接入芽诱导培养基，培养30天后转入芽分化培养基中，培养得到带芽球茎；
(6)将带芽球茎分割成单个的芽，将其接入芽伸长培养基，培养15天后转入根伸长培养基，生根后得到仙茅苗；
(7)仙茅苗长至14cm时进行炼苗与移栽，炼苗时先去除封口膜放置15d，待叶片长出瓶口后，将带有培养基质的驯化苗移栽至小盆；所用基质为1.5：0.5的腐殖质和蛭石，高温灭菌后使用；移栽后将基质浇透水以后不用浇水保持通风干燥，一个月后再浇透一次。
对比例3
(1)培养基配制：
初代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括1.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的IBA、0.2mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
继代愈伤组织诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.7mg/L 6-BA、0.08mg/L的IBA和0.2mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
芽诱导培养基：以MS为基础培养基，还包括0.09mg/L的NAA、2.8mg/L的6-BA、0.8g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
芽分化培养基：以MS为基础培养基，还包括0.04mg/L的NAA、0.35mg/L的6-BA、0.4g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
叶片生长培养基：以MS为基础培养基，还包括0.35mg/L的6-BA、0.08mg/L的IBA、30g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
生根诱导培养基：以1/2MS为基础培养基，还包括0.4mg/L IBA、质量百分含量为0.25％的活性炭、20g/L的蔗糖、5.5g/L的琼脂，pH调节为5.8；
根系驯化诱导培养基：以1/2MS为基础培养基液，还包括1.5mg/L的IBA、20g/L的蔗糖；
将根系驯化诱导培养基添加到以细蛭石、细椰糠、细泥炭体积比3:1:1制成的混合培养介质中，pH调节为5.8；
(2)在3月11日采集仙茅须根，先用70％酒精消毒90s，再用0.05％的升汞消毒10min，用无菌水冲洗8次，得到消毒后的须根；
(3)将消毒后的须根接种到初代愈伤组织诱导培养基中培养15天，外植体两端开始膨大，形成愈伤组织；
(4)将膨大的愈伤组织切块后接种到继代愈伤组织诱导培养基，培养得到原球茎愈伤组织；
(5)将原球茎愈伤组织接入芽诱导培养基，培养30天后转入芽分化培养基中，培养得到带芽球茎；
(6)将带芽球茎分割成单个的芽，将其接入芽伸长培养基，培养15天后转入根伸长培养基，生根后得到仙茅苗；
(7)仙茅苗长至14cm时进行炼苗与移栽，炼苗时先去除封口膜放置15d，待叶片长出瓶口后，将带有培养基质的驯化苗移栽至小盆；所用基质为1.5：0.5的腐殖质和蛭石，高温灭菌后使用；移栽后将基质浇透水以后不用浇水保持通风干燥，一个月后再浇透一次。
结果分析
对上述实施例的愈伤组织诱导率、愈伤组织增殖率、不定芽诱导率、丛生芽增殖率、生根率进行统计；
愈伤组织诱导率于接种15d后统计，计算公式：
愈伤组织诱导率＝形成愈伤组织的外植体数/(接种的外植体总数-污染的外植体数)×100％。
愈伤组织增殖率于接种15d后统计，计算公式：
愈伤组织增殖率＝(愈伤组织的鲜重-接种时愈伤组织的鲜重)/接种时愈伤组织的鲜重×100％。
不定芽诱导率于接种15d后统计，计算公式：
不定芽诱导率＝形成不定芽的愈伤组织数/愈伤组织接种数×100％。
丛生芽增殖率于接种15d后统计，计算公式：
丛生芽增殖系数＝增殖的芽数量/接种时芽的数量。
生根率于接种30d后统计，计算公式：
生根率＝生根苗数/接种苗数×100％。
成活率于无菌苗移栽180天后进行统计，计算公式：
成活率＝成活数/萌发数×100％。
实验结果如下表1：
表1仙茅培养基诱导及种植情况
结论：对比例1～3分别从外植体不同选材时间，不同选材部位对各项诱导的影响进行数据佐证，早春选择未打开刚萌动的花苞诱导效果最佳，随着温度升高后续取花苞作为诱导材料诱导率明显降低污染率显著提高等，且早春取材地下球茎和根系作为外植体同样具有污染率高诱导率低的不良结果。
由以上实施例可知，本发明提供了一种仙茅组织培养快繁的培养基组合及方法，所述培养基组合包括初代愈伤组织诱导培养基、继代愈伤组织诱导培养基、芽诱导培养基、芽分化培养基、芽伸长培养基、根伸长培养基。本发明的方法操作简便，成本低、见效快，生长周期短，可以较容易地通过组织培养快速繁殖获得大量仙茅小苗，为规模化生产提供种源。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种仙茅组织培养快繁的培养基组合，其特征在于，包括初代愈伤组织诱导培养基、继代愈伤组织诱导培养基、芽诱导培养基、芽分化培养基、叶片生长培养基、生根诱导培养基、根系驯化培养基；
所述初代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括1.5～1.7mg/L的6-BA、0.9～1.0mg/L的IBA、0.09～0.11mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述继代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括0.7～0.9mg/L的6-BA、0.08～0.12mg/L的IBA、0.09～0.11mg/L的TDZ、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述芽诱导培养基以MS为基础培养基，还包括0.09～0.11mg/L的NAA、2.8～3.2mg/L的6-BA、0.8～1.2g/L的花宝1号、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述芽分化培养基以MS为基础培养基，还包括0.04～0.06mg/L的NAA、0.35～0.45mg/L的6-BA、0.4～0.6g/L的花宝1号、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述叶片生长培养基以MS为基础培养基，还包括0.35～0.45mg/L的6-BA、0.08～0.12mg/L的IBA、25～35g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述生根诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括0.4～0.6mg/L的IBA、质量百分含量为0.25％～0.35％的活性炭、10～20g/L的蔗糖、1～2g/L的明胶；
所述根系驯化培养基以1/2MS为基础培养基液，还包括1～2mg/L的IBA、15～30g/L的蔗糖。
2.根据权利要求1所述的仙茅组织培养快繁的培养基组合，其特征在于，所述初代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括1.55～1.65mg/L的6-BA、0.95mg/L的IBA和0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
3.根据权利要求2所述的仙茅组织培养快繁的培养基组合，其特征在于，所述继代愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括0.75～0.85mg/L的6-BA、0.09～0.11mg/L的IBA、0.1mg/L的TDZ、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
4.根据权利要求3所述的仙茅组织培养快繁的培养基组合，其特征在于，所述芽诱导培养基以MS为基础培养基，还包括0.1mg/L的NAA、2.9～3.1mg/L的6-BA、0.9～1.1g/L的花宝1号、30g/L的蔗糖、1.5g/L的明胶。
5.根据权利要求4所述的仙茅组织培养快繁的培养基组合，其特征在于，所述芽分化培养基以MS为基础培养基，还包括0.05mg/L的NAA、0.4mg/L的6-BA、0.5g/L的花宝1号、30g/L蔗糖、1.5g/L明胶。
6.根据权利要求5所述的仙茅组织培养快繁的培养基组合，其特征在于，所述叶片生长培养基以MS为基础培养基，还包括0.4mg/L的6-BA、0.09～0.11mg/L的IBA、30g/L蔗糖、1.5g/L明胶。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的仙茅组织培养快繁的培养基组合，其特征在于，所述生根诱导培养基以1/2MS为基础培养基，还包括0.5mg/LIBA、质量百分含量为0.3％的活性炭、15g/L蔗糖、1.5g/L明胶；
所述根系驯化培养基以1/2MS为基础培养基液，还包括1.5mg/L的IBA、20g/L的蔗糖。
8.一种采用权利要求1～7任意一项所述培养基组合组织培养快繁仙茅的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将花苞消毒后接种到初代愈伤组织诱导培养基中培养10～20天，得到萌动的花苞；
(2)将萌动的花苞切开后接种到继代愈伤组织诱导培养基，培养得到球茎愈伤组织；
(3)将球茎愈伤组织接入芽诱导培养基，培养15～25天后转入芽分化培养基中，培养得到带芽球茎；
(4)将带芽球茎接入叶片生长培养基，培养15～25天后转入生根诱导培养基，生根后得到仙茅苗生根苗；
(5)将仙茅苗生根苗接入根系驯化无菌培养介质上，培养55～65天后得到根系发达叶片壮硕的仙茅苗驯化苗。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述花苞为三月中旬至四上旬的花苞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述消毒的方法为：先用70～80％酒精消毒30～90s，再用0.05～0.15％的升汞消毒8～10min，用无菌水冲洗8～10次。
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|---|---|---|---|---|
| CN115088617A (zh) * | 2022-06-22 | 2022-09-23 | 宜宾学院 | 用于多倍体蒲公英植物组织培养的培养基和方法 |
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