CN110278871A - 利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，包括如下步骤：(1)选择带叶的叶柄作为外植体；(2)将外植体接种于成种培养基中培养形成珠芽和/或顶芽，待其成熟后，发育形成小苗；所述成种培养基的配方为：1/2MS+IBA 1.3～1.7mg/L+NAA 0.2～0.8mg/L+TDZ 0.05～0.15mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％。以荆半夏组培丛生苗的带叶叶柄作为外植体且采用特制的培养基，有利于珠芽和顶芽结构的形成，珠芽和顶芽结构类似于种子结构，待珠芽和顶芽成熟后，可发育形成正常的小苗，出愈率和萌发率高且不需要炼苗，直接拿去播种，存活率达到100％，保证种苗质量，实现规模化生产。

Description

利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法
技术领域
本发明涉及苗木无性繁殖技术领域，特别涉及一种利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法。
背景技术
半夏属天南星科半夏属植物，以干燥块茎入药，是一种重要的中药材，半夏块茎含挥发油、烟碱、谷氨酸、谷甾醇等化学成分。具有降逆止吐、燥湿化痰、消痞散结等功能，多用于治疗痰喘咳、恶心呕吐、眩晕等。古之《神龙本草经》称半夏为守田、水玉，其为多年生草本植物，多为夏秋两季采挖，其块茎成圆球形或扁圆形，喜沙性土壤，是一味应用广泛、疗效确切的大宗传统中药材。原荆州尤江陵、潜江盛产，且品质优良，俗称“荆半夏”。因其品质优良、药效特佳而成为半夏入药首选。令人无奈的是，如今市场上供给的荆半夏越来越少，现时多用的半夏为“水半夏”，虽都有半夏之称，“水半夏”在上世纪八十年代却是属于查处、没收、罚款的药材，药性与荆半夏大不相同，药价有天壤之别。为什么曾经的被查处的“水半夏”如今能替代半夏大行其道呢？由于半夏药用和出口需求量大，造成野生资源日益枯竭难以满足要求，价格持续上扬，居高不下。目前，虽有人工栽培种植荆半夏可以缓解市场压力，但由于荆半夏生长要求阴湿环境，在灾害性天气较多的年份，会造成收获量不足的情况，这对荆半夏的生产造成极大限制。另外，半夏连作种植易导致病毒侵染，种性退后，产量和品质下降。因此，考虑使用植物组培快繁技术进行荆半夏种苗生产并进行人工种植是解决荆半夏资源短缺的有效途径。
荆半夏虽然人工种植成功，但扩大种植仍存在障碍：其一，繁殖方法依然局限于块茎繁殖和珠芽繁殖，种子繁殖在实际生产中很少运用或几乎不运用；其二，病虫防治技术与生产不匹配，病毒病、腐烂病、疫病等对生产影响较大；其三，块茎作种，种植成本高；其四，规模化种植面积较少。而组织培养体系的建立，对于荆半夏连作病害的控制有重要作用，脱毒苗的种植能够大大减少其病害的发生率，提高“荆半夏”的品质以及产量，并保持其优良品质，使“荆半夏”实现大面积种植，供应市场需求，让人民群众生活水平得以提高。
对比文件1：文献“灵发素诱导半夏体细胞胚胎发生机理的研究”记载了灵发素对体胚诱导有一定作用，但是其出愈率和萌发率偏低，且灵发素价格较高，整体成本较高。
对比文件2：申请号为“CN102228005 A”，名称为“半夏组织培养一步成种法”公开的方法中成苗需要50天，而且还需要30-40天才能形成小块茎，才能进行移栽，在成苗过程中，还需要加入液体培养基，所需成本和时间都较长，成苗过程繁琐且成苗时间过长，难以满足市场的需求。
因而，如何开发一种以荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，成苗过程简单且成苗时间短以满足市场需求，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，以荆半夏组培丛生苗的带叶叶柄作为外植体且采用特制的培养基，在该培养基下有利于珠芽和顶芽结构的形成，珠芽和顶芽结构类似于种子结构，待珠芽和顶芽成熟后，可以发育形成正常的小苗，出愈率和萌发率高且不需要炼苗，直接拿去播种，存活率达到100％，保证种苗质量，实现规模化生产，满足了生产上的需要。
本发明是这样实现的：
本发明提供一种利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，具体包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择：取半夏的种子，经消毒处理后，进行催芽形成丛生芽，选择带叶的叶柄作为组培用的外植体；
步骤2、将外植体接种于成种培养基中培养形成珠芽和/或顶芽，待珠芽和/或顶芽成熟后，发育形成小苗；所述成种培养基的配方为：1/2MS+IBA 1.3～1.7mg/L+NAA 0.2～0.8mg/L+TDZ 0.05～0.15mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一种利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，经本发明人大量的创新性实验发现采用该配方的培养基1/2MS+IBA 1.3～1.7mg/L+NAA 0.2～0.8mg/L+TDZ0.05～0.15mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％，选用叶柄为外植体只需15天即可快速成苗，且保障了荆半夏苗的种苗质量。采用本发明所述的培养方法及培养基有利于珠芽和顶芽结构的形成，珠芽和顶芽结构类似于种子结构，待珠芽和顶芽成熟后，可以发育形成正常的小苗，不需要炼苗，直接拿去播种，存活率达到100％，保证种苗质量，实现规模化生产，满足了生产上的需要。
附图说明
图1为实施例1中形成的愈伤组织的图片；
图2为实施例1中形成的珠芽和/或顶芽结构的图片；
图3为实施例1中叶柄较短时形成的珠芽和/或顶芽结构的图片；
图4为实施例1中叶柄较长时形成的珠芽和/或顶芽结构的图片；
图5为实施例1中珠芽和/或顶芽结构形成一周后形成的块茎的图片；
图6为实施例1中块茎形成后，叶片枯萎，形成的小苗的照片。
具体实施方式
实施例1
(1)种子预处理：每年6-7月份或者10-11月份，收集成熟的荆半夏种子，去除外果皮，35度水浴3-4天。
(2)催芽并选择外植体：在超净工作台上，取无菌培养皿，培养皿为两层无菌滤纸，用无菌水润湿，把消毒后的种子置于培养皿上，种子消毒方式为0.1％高锰酸钾消毒25min，然后75％乙醇消毒5min，最后0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗4-5次，每次3min左右，避光，25℃催芽，待胚轴长度2-3cm时，选择带叶的叶柄作为组培用的外植体。
(3)一步成种培养：将外植体接种于成种培养基中置于光照/黑暗＝12h/12h，25℃培养室中进行培养形成珠芽和/或顶芽，，待珠芽和/或顶芽成熟后，发育形成小苗；所述成种培养基配方为：
1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％。
如图1所示，10天左右，在叶柄位置形成较多类似珠芽的结构。
如图2所示，部分叶柄形成的愈伤组织较小，根系生成较少，偏重于类似珠芽结构的形成。
如图3所示，叶柄较短时，愈伤组织块较小，根系分化也不明显，但叶片上生成较多的顶芽。
如图4所示，叶柄较长时，叶柄上形成较多类似珠芽的结构，而叶片上形成顶芽结构较少.
如图5和图6所示，培养一个周后，块茎形成，叶片枯萎后，可直接用于田地生产。注意：这个珠芽或顶芽结构形成后，没有休眠就直接发芽成苗。
实施例2
该实施例中所述成种培养基的配方为：1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.05mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％；其他操作步骤均与所述实施例1相同。
实施例3
该实施例中所述成种培养基的配方为：1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.15mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％；其他操作步骤均与所述实施例1相同。
实施例4
该实施例中所述成种培养基的配方为：1/2MS+IBA 1.3mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％；其他操作步骤均与所述实施例1相同。
实施例5
该实施例中所述成种培养基的配方为：1/2MS+IBA 1.7mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％；其他操作步骤均与所述实施例1相同。
实施例6
该实施例中所述成种培养基的配方为：
1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L+TDZ 0.1mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％；其他操作步骤均与所述实施例1相同。
实施例7
该实施例中所述成种培养基的配方为：1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.8mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％；其他操作步骤均与所述实施例1相同。
对比例1
该对比例中所用的培养基的配方为：
1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.2mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％；其他操作步骤均与所述实施例1相同。
对比例2
该对比例中所用的培养基的配方为：
1/2MS+IBA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.1mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％；其他操作步骤均与所述实施例1相同。
实验例1
以上实施例1-实施例7以及对比实施例1-对比例2中均同时至少重复3次，
分别观察并计算以上实施例1-实施例7以及对比实施例1-对比例2中荆半夏生长情况并统计如下：
表1
对比例1中，与实施例1相比，仅将TDZ的浓度改为0.2mg/L，形成的根系较快，在愈伤组织不明显的时候，就分化出根，虽然形成根，但愈伤组织还进一步形成，但增长速度低。由此可知在培养基的其他成分不变的情况下，TDZ的浓度至关重要，将TDZ的浓度改为0.2mg/L时会先分化出根，后长芽而成苗；而本发明的成种培养基的配方中TDZ的浓度为0.05～0.15mg/L时，发育方向完全不一样，是利于珠芽和顶芽结构的形成(珠芽和顶芽结构类似于种子结构，待珠芽和顶芽成熟后，可以发育形成正常的小苗，不需要炼苗，直接拿去播种，存活率达到100％)。
对比例2中，与实施例1相比，仅将IBA的浓度改为1mg/L，对比例1一样也是先分化出根，后长芽而成苗，且愈伤组织形成的速度低，形成的愈伤组织较小，根系生成较少。
由上表1可知，采用本发明所述的培养方法及培养基有利于珠芽和顶芽结构的形成(珠芽和顶芽结构类似于种子结构，待珠芽和顶芽成熟后，可以发育形成正常的小苗，不需要炼苗，直接拿去播种，存活率达到100％，保证种苗质量，实现规模化生产，满足了生产上的需要。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择：取半夏的种子，经消毒处理后，进行催芽形成丛生芽，选择带叶的叶柄作为组培用的外植体；
步骤2、将外植体接种于成种培养基中培养形成珠芽和/或顶芽，待珠芽和/或顶芽成熟后，发育形成小苗；所述成种培养基的配方为：1/2MS+IBA 1.3～1.7mg/L+NAA 0.2～0.8mg/L+TDZ 0.05～0.15mg/L+蔗糖3％+琼脂0.7％。
2.如权利要求1所述的利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，其特征在于，所述IBA的终浓度为1.5mg/L。
3.如权利要求1所述的利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，其特征在于，所述NAA的终浓度为0.5mg/L。
4.如权利要求1所述的利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，其特征在于，所述TDZ的终浓度为0.1mg/L。
5.如权利要求1所述的利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，其特征在于，所述步骤1中消毒的具体步骤为：高锰酸钾消毒25min，然后乙醇消毒5min，最后升汞消毒10min，无菌水冲洗4-5次。
6.如权利要求5所述的利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，其特征在于，所述高锰酸钾的浓度为0.1％，酒精的浓度为75％，升汞的浓度为0.1％。
7.如权利要求1所述的利用荆半夏组培丛生苗一步成种的组培方法，其特征在于，所述步骤1中催芽的步骤为：在超净工作台上，取无菌培养皿，培养皿为两层无菌滤纸，用无菌水润湿，把消毒后的种子置于培养皿上避光，常温下催芽。
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