CN113142054B - 一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法 - Google Patents

一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法，涉及中药组培快繁技术领域。本发明通过诱导愈伤组织、愈伤组织增殖分化培养和生根培养，从而周年获得大量纯正膜荚黄芪的种苗。利用本发明所述的组培快繁方法得到的膜荚黄芪丛生芽增殖系数达到13～15倍，丛生芽健壮，接种到开放式生根培养基上容易生根，生根率达90％以上，且后期移栽成活率90％以上，获得优质膜荚黄芪种苗。本发明不受时间和空间限制，可周年实现工厂化培育，满足生产需要。

Description

一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法
技术领域
本发明属于中药组培快繁技术领域，具体涉及一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法。
背景技术
膜荚黄芪(Astragalus membranaceus(fisch.)Bunge)为豆科多年生草本植物，国家3级保护植物，是药典黄芪的正品，产于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆、山东及四川，生长于林缘或灌丛疏林下，黄芪原名黄耆，始载于《神农本草经》，宋《图经本草》载：“今出原州(宁夏固原)及华原(陕西耀县)者也佳”。宁夏六盘山地区是“原州黄芪”主产区，当地人民有长期人工驯化种植野生黄芪的历史。膜荚黄芪为黄芪上品，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿等功效；为历代医家常用的中药材，市场需求量极大，近年来由于人工采挖，其野生资源在全国已濒临灭绝，目前，人工栽培的膜荚黄芪多与蒙古黄芪混杂，很难获得纯正的膜荚黄芪种苗，因此需要通过组培快繁方式和工厂化育苗技术培育出无性状分离、生长一致、品质纯正的膜荚黄芪种苗。目前还未见到关于膜荚黄芪组培快繁及工厂化育苗的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法，可解决膜荚黄芪种苗种源不清、品种混杂，缺乏纯正膜荚黄芪种苗的现状，并且可周年实现工厂化培育，满足生产需求。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法，包括以下步骤：(1)以膜荚黄芪的幼嫩组织为外植体，将所述外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤诱导培养，得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以Ms培养基为基本培养基，还包括以下浓度的组分：1.0～3.0mg/L 2,4-D、0.3～0.5mg/L6-BA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉，pH值为5.5～5.8；
(2)将所述愈伤组织接种到增殖分化培养基上进行增殖分化培养，得丛生芽；所述增殖分化培养基以Ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：1.0～2.0mg/L 6-BA、0.2～0.4mg/L NAA、0.1～0.2mg/L IAA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉，pH值为5.5～5.8；
(3)将所述丛生芽分割成单芽，接种到开放式生根培养基上进行生根培养，得膜荚黄芪组培快繁苗；所述开放式生根培养基以1/2Ms培养基为基本培养基，还包括以下浓度的组分：0.3～0.5mg/L IBA、0.5～1.0mg/L IAA、1.0～2.0ml/L抑菌剂、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉。
优选的，步骤(1)所述幼嫩组织包括幼嫩的叶片和茎段。
优选的，步骤(1)所述外植体在接种前，还包括预处理，所述预处理包括用流动的清水冲洗所述外植体30min，用质量百分含量为2％的次氯酸钠水溶液处理10min，无菌水冲洗3～4次，再用0.1％的升汞溶液浸泡6min，无菌水冲洗3～4次。
优选的，步骤(1)所述愈伤诱导培养的温度为21～23℃，先暗培养10～14d，再光照培养7～10d；所述光照培养时每天的光照时间为14h，光照强度为2000～3000Lux。
优选的，步骤(2)所述增殖分化培养的温度为23～25℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000～3000Lux；所述增殖分化培养每21d继代培养1次，继代培养2～3次。
优选的于，步骤(2)所述增殖分化培养后还包括将丛生芽接种到丛生芽增殖培养基上进行丛生芽增殖培养，所述丛生芽增殖培养基以Ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：0.5～1.0mg/L 6-BA、0.2～0.4mg/L NAA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉，pH值为5.5～5.8。
优选的，所述丛生芽增殖培养的温度为23～25℃，光照时间为16h/d，光照强度为4000～5000Lux，每21d继代培养1次。
优选的，步骤(3)所述抑菌剂包括以下重量百分含量的有效成分：0.5％卡松、1％～2％山梨酸钾和0.1％～0.2％次氯酸钠。
优选的，步骤(3)所述生根培养的温度为23～25℃，光照时间为16h/d，光照强度为3000Lux，培养15～18d。
优选的，在步骤(3)得到所述膜荚黄芪组培快繁苗后，还包括炼苗和移栽。
本发明提供了一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法，通过诱导愈伤组织、愈伤组织增殖分化培养和生根培养，从而周年获得大量纯正膜荚黄芪的种苗。利用本发明所述的组培快繁方法得到的膜荚黄芪丛生芽增殖系数达到13～15倍，丛生芽健壮，接种到开放式生根培养基上容易生根，生根率达90％以上，且后期移栽成活率90％以上，获得优质膜荚黄芪种苗。本发明不受时间和空间限制，可周年实现工厂化培育，满足生产需要。
附图说明
图1为实施例1中愈伤组织诱导图片；
图2为实施例1中丛生芽分化图片；
图3为实施例1中丛生芽增殖图片；
图4为实施例1中生根培养图片；
图5为实施例1中穴盘移栽图。
具体实施方式
本发明提供了一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法，包括以下步骤：(1)以膜荚黄芪的幼嫩组织为外植体，将所述外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤诱导培养，得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以Ms培养基为基本培养基，还包括以下浓度的组分：1.0～3.0mg/L 2,4-D、0.3～0.5mg/L6-BA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉，pH值为5.5～5.8；
(2)将所述愈伤组织接种到增殖分化培养基上进行增殖分化培养，得丛生芽；所述增殖分化培养基以Ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：1.0～2.0mg/L 6-BA、0.2～0.4mg/L NAA、0.1～0.2mg/L IAA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉，pH值为5.5～5.8；
(3)将所述丛生芽分割成单芽，接种到开放式生根培养基上进行生根培养，得膜荚黄芪组培快繁苗；所述开放式生根培养基以1/2Ms培养基为基本培养基，还包括以下浓度的组分：0.3～0.5mg/L IBA、0.5～1.0mg/L IAA、1.0～2.0ml/L抑菌剂、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉。
本发明以膜荚黄芪的幼嫩组织为外植体，将所述外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤诱导培养，得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以Ms培养基为基本培养基，还包括以下浓度的组分：1.0～3.0mg/L 2,4-D、0.3～0.5mg/L 6-BA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉，pH值为5.5～5.8。本发明所述幼嫩组织优选包括幼嫩的叶片和茎段。本发明所述外植体在接种前，优选还包括预处理，所述预处理优选包括用流动的清水冲洗所述外植体30min，用质量百分含量为2％的次氯酸钠水溶液处理10min，无菌水冲洗3～4次，再用0.1％的升汞溶液浸泡6min，无菌水冲洗3～4次。
本发明将经过预处理的外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤诱导培养，所述愈伤诱导培养的温度优选为21～23℃，先暗培养10～14d，再光照培养7～10d；所述光照培养时每天的光照时间优选为14h，光照强度优选为2000～3000Lux。本发明所述愈伤组织诱导培养基中2,4-D的浓度优选为2.0mg/L；所述浓度的2,4-D可促进外植体切口端形成愈伤组织。本发明所述愈伤组织诱导培养基中6-BA的浓度优选为0.5mg/L；所述浓度的6-BA可促进非胚性愈伤组织转变成胚性愈伤。本发明所述愈伤组织诱导培养基可促进愈伤组织形成。本发明对所述愈伤组织诱导培养基的制备方法并没有特殊限定，优选按照上述配比混合后，置高压灭菌锅温度121℃、压力0.11～0.12MPa下灭菌15min，完全冷却后即可接种。
得愈伤组织后，本发明将所述愈伤组织接种到增殖分化培养基上进行增殖分化培养，得丛生芽；所述增殖分化培养基以Ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：1.0～2.0mg/L 6-BA、0.2～0.4mg/LNAA、0.1～0.2mg/L IAA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉，pH值为5.5～5.8。本发明所述增殖分化培养的温度优选为23～25℃，光照时间优选为14h/d，光照强度优选为2000～3000Lux；所述增殖分化培养优选每21d继代培养1次，继代培养2～3次。本发明所述增殖分化培养基中6-BA的浓度优选为2.0mg/L；所述浓度的6-BA可促进愈伤组织分化。本发明所述增殖分化培养基中NAA的浓度优选为0.3mg/L；所述浓度的NAA可促进丛生芽迅速生长。本发明所述增殖分化培养基中IAA的浓度优选为0.1mg/L；所述浓度的IAA可促进丛生芽分化。本发明对所述增殖分化培养基的制备方法并没有特殊限定，优选按照上述配比混合后，置高压灭菌锅温度121℃、压力0.11～0.12MPa下灭菌15min，完全冷却后即可接种。利用本发明所述增殖分化培养基，愈伤组织增殖系数达3.8倍，获得绿色丛生芽。
本发明得所述丛生芽后，优选还包括将所述丛生芽接种到丛生芽增殖培养基上进行丛生芽增殖培养，所述丛生芽增殖培养基以Ms为基本培养基，还包括以下浓度的组分：0.5～1.0mg/L 6-BA、0.2～0.4mg/LNAA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉，pH值为5.5～5.8。本发明所述丛生芽增殖培养的温度优选为23～25℃，光照时间优选为16h/d，光照强度优选为4000～5000Lux，每21d继代培养1次。本发明所述丛生芽增殖培养基中6-BA的浓度优选为1.0mg/L；所述浓度的6-BA可促进丛生芽快速增殖。本发明所述丛生芽增殖培养基中NAA的浓度优选为0.3mg/L；所述浓度的NAA可促进丛生芽迅速增长。本发明对所述丛生芽增殖培养基的制备方法并没有特殊限定，优选按照上述配比混合后，置高压灭菌锅温度121℃、压力0.11～0.12MPa下灭菌15min，完全冷却后即可接种。利用本发明所述丛生芽增殖培养基，每21d继代培养1次，丛生芽增殖系数达13.5倍。
得丛生芽后，本发明将所述丛生芽分割成单芽，接种到开放式生根培养基上进行生根培养，得膜荚黄芪组培快繁苗；所述开放生式根培养基以1/2Ms培养基为基本培养基，还包括以下浓度的组分：0.3～0.5mg/L IBA、0.5～1.0mg/L IAA、1.0～2.0ml/L抑菌剂、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉。本发明所述开放式生根培养基中IBA的浓度优选为0.5mg/L；所述浓度的IBA可促进单芽生根。本发明所述开放式生根培养基中IAA的浓度优选为1.0mg/L；所述浓度的IAA可促进单芽迅速生长。本发明所述开放式生根培养基中抑菌剂的浓度优选为1.0ml/L。本发明所述抑菌剂优选包括以下重量百分含量的有效成分：0.5％卡松、1％～2％山梨酸钾和0.1％～0.2％次氯酸钠。本发明对所述开放式生根培养基的制备方法并没有特殊限定，由于所述抑菌剂的添加，生根培养基无需高压灭菌，待分装的培养基冷却后可直接接种。本发明所述生根培养的温度优选为23～25℃，光照时间优选为16h/d，光照强度优选为3000Lux，培养时间优选为15～18d。利用本发明所述开放式生根培养基，在所述条件下进行生根培养，15～18d就能得到完整的带根苗，生根率达90％以上。
本发明在得到所述膜荚黄芪组培快繁苗后，优选还包括炼苗和移栽。本发明在进行所述炼苗时，优选将上述带根的膜荚黄芪组培快繁苗移至工厂化炼苗棚，打开培养瓶(盒)盖，遮光70％，每2h喷雾加湿1次，空气相对湿度60～75％，温度25～29℃，炼苗5～7d后取出生根苗，清洗干净，移栽育苗基质中进行育苗，所述育苗基质优选包括草炭、蛭石和珍珠岩，且所述草炭、蛭石和珍珠岩的体积比优选为4:1:1。本发明在所述移栽后，优选置遮阴50％，温度25～28℃，每2h喷雾加湿，空气湿度70％，移栽14d后撤去遮阴网，移栽25d后喷施0.2％磷酸二氢钾叶面肥，7～10d喷施叶面肥1次，移栽成活率达90％以上，移栽60天即可出圃移栽大田。
下面结合实施例对本发明提供的一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法，进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、膜荚黄芪试管苗的获得，具体步骤如下：
1.外植体选择、处理
5月下旬，野生膜荚黄芪刚刚长出10～15cm新发枝，选取生长健壮的优良单株，剪取新发嫩枝，用湿报纸包裹，装入取样冷藏保温箱，尽快带回组培室进行前处理。
取出带回的膜荚黄芪嫩枝，用流动清水冲洗表面0.5h，用柔软毛笔蘸洗洁精水清洗嫩枝和叶片，清水冲洗干净，分成4～5cm带叶片小段。
2.外植体消毒：
在超净工作台里，将分割好的外植体装入无菌带盖玻璃瓶中，加入2％的次氯酸钠至浸没外植体，滴入1～2滴吐温20，期间不断用手摇动玻璃容器，处理8min，倾去次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗4～5遍，加入0.1％升汞，不断用手轻轻摇动，处理5min，倒出溶液，然后用无菌水冲洗4～5遍，取出嫩枝，放入装有灭菌滤纸的培养皿中，用滤纸吸干表面水分。
3.愈伤组织诱导培养
将嫩枝条上的叶片剪下，将叶片和茎段分开，叶片用手术刀片切掉周边叶缘部分，茎段用手术刀片切割为1.0cm的茎段，将叶片和茎段分别接种于配制好的愈伤组织诱导培养基上，于22±1℃光照培养箱中暗培养10-14d后转至14h/d光照下，光照强度2000～3000Lux，继续培养7-10d，诱导得到愈伤组织(图1)；所述愈伤组织诱导培养基为Ms+2,4-D2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂粉4.58g/L，pH值为5.5～5.8；
4.愈伤组织增殖分化培养
将从膜荚黄芪叶片和茎段诱导获得的愈伤组织切割下来，转接到增殖分化培养基上，培养温度23±1℃，光照14h/d，光照强度2000-3000Lux，每21d继代培养1次，继代培养2-3次即可得到健壮丛生芽(图2)，所述增殖分化培养基为Ms+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+IAA 0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂粉4.58g/L，pH值为5.5～5.8；
5.丛生芽增殖培养
将得到的丛生芽组织块切割下来，转接到配制好的丛生芽增殖培养基上，培养温度23±1℃，光照强度4000Lux，增殖培养21天，获得健壮的丛生芽苗(图3)，所述丛生芽增殖培养基为Ms+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂粉4.58g/L，pH值为5.5～5.8；
6.生根培养
将得到的健壮丛生芽分成单芽接种于开放式生根培养基(图4)，培养条件：温度24±1℃，光照16h/d，光强3000Lux，培养15～18d，得到完整的带根试管苗，所述开发式生根培养基为1/2Ms+IBA0.5 mg/L+IAA 1.0mg/L+专用抑菌剂(0.5％卡松、2％山梨酸钾和0.2％次氯酸钠)1.0mL/L+蔗糖30.0g/L+琼脂粉4.58g/L，pH值为5.5～5.8；
二、膜荚黄芪试管苗的炼苗移栽技术，包括如下步骤：
1.炼苗
将培养生根试管苗的培养瓶(盒)转移到控温、控湿的智能化温室中，打开瓶(盒)盖，70％遮光，每3小时喷雾加湿，空气相对湿度75％，温度25℃，炼苗6d，待试管苗叶片适应空气环境后从培养瓶(盒)中取出试管苗，用清水冲洗干净试管苗根系上的琼脂。
2.移栽
将清洗干净的试管苗移栽到装有混合育苗基质的穴盘中(如图5所示)，智能化育苗温室采用间歇式喷雾装置，每2h喷雾1次，保持空气湿度70％左右，遮光50％，移栽14d后撤去遮阴网，移栽25d后喷施0.2％磷酸二氢钾叶面肥，10天喷施叶面肥1次，移栽成活率达90％以上，移栽60天即可出圃移栽大田，所述混合育苗基质为草炭∶蛭石∶珍珠岩＝4∶1∶1。
上述步骤中Ms培养基和1/2Ms培养基均为青岛日水生物科技有限公司生产。
上述炼苗和移栽步骤中培养温度白天25±2℃，夜晚18±2℃，光照强度1000～1500Lux，光照时间16h/d。
经多次试验，使用本发明所述方法，膜荚黄芪丛生芽增殖系数达13.5倍，生根率达90％以上，移栽成活率在90％以上，种苗生长健壮，生长均一，可以高效开展濒危中药材膜荚黄芪工厂化育苗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种膜荚黄芪的工厂化组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以膜荚黄芪的幼嫩组织为外植体，将所述外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤诱导培养，得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、1.0~3.0mg/L 2,4-D、0.3~0.5mg/L 6-BA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉组成，pH值为5.5~5.8；所述幼嫩组织包括幼嫩的叶片和茎段；所述愈伤诱导培养的温度为21~23℃，先暗培养10~14d，再光照培养7~10d；所述光照培养时每天的光照时间为14h，光照强度为2000~3000Lux；
（2）将所述愈伤组织接种到增殖分化培养基上进行增殖分化培养，得丛生芽；所述增殖分化培养基由MS培养基、1.0~2.0mg/L 6-BA、0.2~0.4 mg/L NAA、0.1~0.2mg/L IAA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉组成，pH值为5.5~5.8；所述增殖分化培养的温度为23~25℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000~3000Lux；所述增殖分化培养每21d继代培养1次，继代培养2~3次；所述增殖分化培养后还包括将丛生芽接种到丛生芽增殖培养基上进行丛生芽增殖培养，所述丛生芽增殖培养基由MS培养基、0.5~1.0mg/L 6-BA、0.2~0.4mg/L NAA、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉组成，pH值为5.5~5.8
（3）将所述丛生芽分割成单芽，接种到开放式生根培养基上进行生根培养，得膜荚黄芪组培快繁苗；所述开放式生根培养基由1/2MS培养基、0.3~0.5mg/L IBA、0.5~1.0mg/L IAA、1.0~2.0ml/L抑菌剂、30.0g/L蔗糖和4.58g/L琼脂粉组成；所述生根培养的温度为23~25℃，光照时间为16h/d，光照强度为3000Lux，培养15~18d；所述抑菌剂包括以下重量百分含量的有效成分：0.5%卡松、1%~2%山梨酸钾和0.1%~0.2%次氯酸钠。
2.根据权利要求1所述组培快繁方法，其特征在于，步骤（1）所述外植体在接种前，还包括预处理，所述预处理包括用流动的清水冲洗所述外植体30min，用质量百分含量为2%的次氯酸钠水溶液处理10min，无菌水冲洗3~4次，再用0.1%的升汞溶液浸泡6min，无菌水冲洗3~4次。
3.根据权利要求1所述组培快繁方法，其特征在于，所述丛生芽增殖培养的温度为23~25℃，光照时间为16h/d，光照强度为4000~5000Lux，每21d继代培养1次。
4.根据权利要求1所述组培快繁方法，其特征在于，在步骤（3）得到所述膜荚黄芪组培快繁苗后，还包括炼苗和移栽。
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