CN110169359B - 天女木兰的快速繁育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种天女木兰的快速繁育方法。本发明选取天女木兰的种胚作为外植体，利用组织培养技术提高天女木兰种子萌发率，使天女木兰出苗速度以及萌发率远高于常规播种育苗，为天女木兰组织培养快速繁殖提供参考，对挽救和保护这个珍稀濒危树种也具有重要意义。

Description

天女木兰的快速繁育方法
技术领域
本发明涉及一种天女木兰的快速繁育方法。
背景技术
天女木兰(Magnolia sieboldii)是世界上稀有的珍贵树种之一，又叫小花木兰、天女花等，树高可达10m，为落叶小乔木。原产于辽宁，是我国唯一的国家三级重点保护野生木兰属濒危植物，主要分布在辽宁吉林两省相邻的山区和华东及华南地区的局部山区，天女木兰喜欢温润、凉爽的环境以及肥沃、深厚的土壤。适合在沙壤土或林下腐殖土、pH5.5-7.0，梳林阴坡下长势良好，能耐-30℃低温。天女木兰为特种稀有名花，具有非常高的观赏价值，亦被广泛使用在各行各业，是增香剂制品的原料。花和叶片是重要的香精植物资源，可以提取芳香油；花蕾可入药，还可以制作浸膏；种子为日用化工的重要材料，并含有19种稀有成分，可用来制作肥皂；木材可制作器具、雕刻及农具，还可以用做建筑物内装修以及家具等。
天女木兰现有的培育技术主要为无性繁殖、有性繁殖和播种繁殖，无性繁殖对天女木兰的育苗效果不佳，生根率也不高，有性繁殖需要对其进行变温层积催芽，播种繁殖的树苗死亡率较高。
天女木兰种子常用外源激素处理+变温层积催芽的处理方式，但是仍然萌发率很低，如用种子播种，外种皮和中种皮质厚且坚硬，对种胚的活性要求极高，种子做外植体时，去掉外种皮后由于中种皮坚硬，仍很难使胚吸收到营养物质。
组织培养技术是在人为创造的无菌条件下将生活的离体器官(如根、茎、叶、茎段、原生质体)、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。
发明内容
本发明的的目的是通过天女木兰种胚快速繁殖无菌苗，解决天女木兰种子休眠时间长萌发率低的问题。
本发明首先保护一种天女木兰的组织培养方法，包括如下步骤：(A)将天女木兰种胚作为外植体接种于种胚培养基中培养至种胚萌发；所述种胚培养基中含有100-500mg/LGA3；(B)培养步骤(A)萌发的种胚直至获得天女木兰幼苗。
所述种胚培养基为含有100-500mg/L GA3的MS培养基。
所述种胚培养基中含有300mg/L GA3。
所述培养分为两个阶段；第一阶段为3-5天，培养条件为：20℃暗培养；第二阶段为第一阶段结束至种胚萌发，培养条件为：25℃、光照强度2000Lux、8h光处理/16h暗处理循环。
所述方法还步骤(2)：将步骤(A)萌发后的种胚转接至所述种胚培养基中进行继代培养至获得高度为1cm的胚芽。
所述继代培养的培养条件为：25℃、光照强度2000Lux、8h光处理/16h暗处理。
所述方法还包括步骤(3)：将步骤(2)获得的胚芽接种于生根培养基中进行生根培养至生根条数大于5且根长达到2cm；所述生根培养基中含有0.5mg/LNAA和1mg/L IBA。
所述生根培养基为含有0.5mg/LNAA和1mg/L IBA的1/2MS培养基。
所述生根培养的培养条件为：25℃、光照强度2000Lux、8h光处理/16h暗处理。
所述方法还包括步骤(4)：完成步骤(3)后进行炼苗并将生根苗移栽至幼苗培养基中培养直至获得天女木兰幼苗；所述幼苗培养基为4体积份泥炭、3体积份珍珠岩和3体积份蛭石的混合物。
所述步骤(4)具体可为：完成步骤(3)后，移到室外遮阴炼苗3天，然后将培养容器瓶口打开，自然光下进行开瓶炼苗3天，然后将生根苗放入浓度为0.1％多菌灵溶液中浸泡，并把根部多余的培养基清洗干净，然后移栽到幼苗培养基。
炼苗期的温度控制在20-25℃、湿度65-75％。
移栽后将生根苗在遮阴网下进行管理，第一周采用浓度为0.1％多菌灵溶液进行喷灌，第二周每天用水喷灌一次，保持基质湿润透气。待生根苗抽生出新芽之后即可移出遮阴网。
所述方法还包括对接种前种胚进行消毒的步骤；所述消毒方法如下：将种胚用75％酒精消毒30s，使用2％(质量百分含量)次氯酸钠水溶液中消毒消毒8min，消毒后将种胚用无菌水冲洗一次。
所述种胚的制备方法包括如下步骤：(a)种子的预处理：取天女木兰种子，用常温蒸馏水浸泡48h，剥去红色外种皮，清水冲洗以去除种皮残渣；(b)将步骤(a)预处理的种子进行消毒；所述消毒方法如下：将种子使用75％酒精中消毒30s，然后使用2％(质量百分含量)次氯酸钠水溶液中消毒25min，每次消毒后用灭菌的蒸馏水冲洗3-5遍；(c)完成步骤(b)后，将种子置于培养皿中，用剪刀剪开种子的两侧，用镊子扒开黑色中种皮，剥出完整的种胚。
本发明还保护以上任一所述的方法在提高天女木兰种子萌发率中的应用。
本发明还保护以上任一所述的方法在天女木兰繁育中的应用。
本发明还保护一种用于天女木兰繁育的试剂盒，包括以上任一所述的种胚培养基、生根培养基和幼苗培养基。
本发明选取天女木兰的种胚作为外植体，利用组织培养技术提高天女木兰种子萌发率，使天女木兰出苗速度以及萌发率远高于常规播种育苗，为天女木兰组织培养快速繁殖提供参考，对挽救和保护这个珍稀濒危树种也具有重要意义。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
MS培养基：PhytoTechnology Laboratories，商品名称为：MURASHIGE&SKOOG(MS)BASAL MEDIUM w/VITAMINS(MS基本培养基含维生素)。
实施例1、采用种胚作为外植体通过组织培养实现天女木兰的繁育
一、种子的预处理
取天女木兰种子，用常温蒸馏水浸泡48h，剥去红色外种皮，清水冲洗数次以去除种皮残渣。
二、培养基配置
配置含有不同浓度(100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L或500mg/L)GA3的MS培养基，进行高温高压灭菌处理。每个接种瓶25ml培养基。
三、组织培养
本步骤需在无菌环境中进行，使用的材料(如溶液、培养基、剪刀等)均经过灭菌处理，材料和操作台在使用前开紫外灯照射20min。
1、将步骤一预处理的种子使用75％酒精中消毒30s，然后使用2％(质量百分含量)次氯酸钠水溶液中消毒25min，每次消毒后用灭菌的蒸馏水冲洗3-5遍。
2、完成步骤1后，将种子置于培养皿中，用剪刀剪开种子的两侧，用镊子扒开黑色中种皮，剥出完整的种胚待消毒使用。
平均每剥开5个种胚，双手及操作台喷洒酒精进行消毒，同时用红外灭菌器对剪刀和镊子进行消毒。
3、完成步骤2后，将种胚使用75％酒精消毒30s，使用2％(质量百分含量)次氯酸钠水溶液中消毒消毒8min，无菌水冲洗3-5次，然后接种于装有步骤二制备的培养基的培养瓶中(每25ml培养基中接种3个种胚)。
4、完成步骤3后，将培养瓶封口膜封好，放入GTOP-500YD人工气候箱，前三至五天20℃暗处理，然后以8h光处理/16h暗处理为循环，光照强度2000Lux条件下，25℃恒温培养，湿度50％，观察记录。
接种20天后，统计种胚萌发情况，使用含有不同浓度GA3的MS培养基培养的种胚萌发率统计结果见表1。其中，当GA3的浓度达到300mg/l时，种胚萌发率最高，为75％。
表1
GA<sub>3</sub>浓度(mg/l) 100 200 300 400 500.
萌发率(％) 55.3 69 75 62.5 60
5、将步骤4中采用含有300mg/l GA3MS培养基培养的天女木兰无菌外植体接种于含有300mg/l GA3的MS培养基中进行继代培养，培养条件为：8h光处理/16h暗处理为循环，光照强度2000Lux条件下，25℃恒温培养，湿度50％。
6、完成步骤5后，选择生长健壮，高度大于1cm的芽(从萌发开始生长时间起计算大约35天)，接种与含有0.5mg/LNAA和1mg/L IBA的1/2MS培养基中进行生根培养，培养条件为：8h光处理/16h暗处理为循环，光照强度2000Lux条件下，25℃恒温培养，湿度50％。
7、完成步骤6后，大约18天当组培苗平均生根5条以上，根长度达到2.0cm后，移到室外遮阴炼苗3天，然后将培养容器瓶口打开，自然光下进行开瓶炼苗3天，将生根苗从培养基中取出，放入浓度为0.1％多菌灵溶液中浸泡1min，并把根部多余的培养基清洗干净，然后移栽到幼苗营养钵中，培养基质配方为：泥炭：珍珠岩：蛭石＝4:3:3(体积比)。
炼苗期的温度控制在20-25℃、湿度65-75％。
移栽苗的管理方式为：移栽后将生根苗在遮阴网下进行管理，第一周采用浓度为0.1％多菌灵溶液进行喷灌，第二周每天用水喷灌一次，保持基质湿润透气。待生根苗抽生出新芽之后即可移出遮阴网。
移栽后培养3-4周可抽生出新芽，成活率在95％以上。

Claims (3)

1.一种天女木兰的组织培养方法，包括如下步骤：（A）将天女木兰种胚作为外植体接种于种胚培养基中培养至种胚萌发；所述种胚培养基为含有300mg/L GA3的MS培养基；（B）培养步骤（A）萌发的种胚直至获得天女木兰幼苗；
所述步骤（A）中，培养分为两个阶段；第一阶段为3-5天，培养条件为：20℃暗培养；第二阶段为第一阶段结束至种胚萌发，培养条件为：25℃、光照强度2000Lux、8h光处理/16h暗处理循环；
所述方法还包括步骤（2）：将步骤（A）萌发后的种胚转接至所述种胚培养基中进行继代培养至获得高度为1cm的胚芽；
所述方法还包括步骤（3）：将步骤（2）获得的胚芽接种于生根培养基中进行生根培养至生根条数大于5且根长达到2cm；所述生根培养基中含有0.5mg/L NAA和1mg/L IBA；
所述方法还包括步骤（4）：完成步骤（3）后进行炼苗并将生根苗移栽至幼苗培养基中培养直至获得天女木兰幼苗；所述幼苗培养基为4体积份泥炭、3体积份珍珠岩和3体积份蛭石的混合物。
2.权利要求1所述的方法在提高天女木兰种子萌发率中的应用。
3.权利要求1所述的方法在天女木兰繁育中的应用。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
不同处理对天女木兰种子发芽的影响;张辉等;《学术园地》;20141231(第10期);第11页第2.2节，表1 *
天女木兰的离体培养和快速繁殖;周凌娟等;《植物生理学通讯》;20041231;第40卷(第6期);第710页第3-4.5节 *

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