CN113854151A - 一种油梨组织培养与快速繁殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，包括如下步骤：(1)种子消毒，种子无开裂：采用体积浓度70～80％乙醇溶液消毒处理，或种子开裂：采用体积浓度70～80％乙醇溶液和含有1‑2滴吐温的质量浓度0.2～0.8％次氯酸钠溶液消毒处理；(2)切割种子，取出种胚，去除种胚外的其他组织，得外植体；(3)将外植体接种诱导培养基中，依次进行黑暗和光照培养，得不定芽；(4)将不定芽切成芽块，增殖培养后，包括采用过渡培养基进行阶段的梯度培养、以及生根培养基进行生根培养，得组培苗；(5)炼苗移栽。本发明实现了油梨离体的快速组培和繁育的方法，不仅增加了油梨种苗繁殖系数，还可解决油梨生根困难等问题，组培苗壮实且成活率高。

Description

一种油梨组织培养与快速繁殖的方法

技术领域

本发明涉及植物繁殖技术领域，特别涉及一种油梨组织培养与快速繁殖的方法。

背景技术

油梨(Persea americana Mill)，又名鳄梨、牛油果，原产于中美洲及墨西哥湿润地区，是著名的热带、亚热带水果，也是木本油料树种之一。我国的海南、贵州、广东、广西、云南等省(区)均适宜栽培。油梨是营养价值极高的水果，含多种维生素、脂肪酸、蛋白质和矿质元素，其中80％的脂肪酸为亚油酸和亚麻酸等人体必需的不饱和脂肪酸，人体吸收率高达93.7％，被美誉为“森林黄油”。油梨也是高能食品，已被称为“水果粮食”。油梨具有的营养和保健价值，一直为消费者所热衷和追捧。近几十年来，世界油梨种植面积和产量增长迅速，消费量与日俱增，在国际市场上长期处于供不应求状态。

而制约油梨产业化发展主要重要因素健康种苗快速繁育，现在适合油梨种植的各个产区种植区急速扩大种植面积，但种苗缺乏严重制约种植面积。现在国内主要依靠种子作为砧木繁殖，存在繁殖材料的单一性和局限性，没法快速、大规模地生产健康的油梨种苗。油梨为木本果树，制约组培苗快速繁育，主要是多芽体诱导率低、不定芽长势弱以及组培苗生根效果差等问题，导致种苗育种周期长和成活率低。在前期研究和以前技术中，主要问题是无法生长或者生根效率不高，因此，油梨离体快速繁育种苗技术是急需解决的卡脖子问题。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提出一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，解决上述问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)消毒：取种子，去除种皮，根据种子开裂情况选择消毒方法：

种子无开裂：采用体积浓度70～80％乙醇溶液消毒处理；

种子开裂：采用体积浓度70～80％乙醇溶液和含有1-2滴吐温的质量浓度0.2～0.8％次氯酸钠溶液消毒处理；

(2)处理：切割步骤(1)消毒的种子，取出种胚，去除种胚外的其他组织，得外植体；其中，外植体还可以选择腋芽或顶芽；

(3)诱导培养：将外植体接种至诱导培养基中，先进行黑暗培养，随后转入光照培养，得不定芽；

(4)增殖和生根培养：将不定芽切成芽块，接种至增殖培养基中，进行增殖培养，待长至叶片数≥4片时，转入配方为1/2MS+0.20-0.30mg/L NAA+0.5-1.5g/L活性炭+8-12％椰子水+7.5-8.5％琼脂粉+25-35g/L蔗糖的生根培养基中，pH值为5.5～6.0，进行生根培养，得组培苗；以MS培养基为基础培养基，NAA为萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid，简称NAA)，椰子水可提供特殊营养物质，其内涵激素物质也可促进根部诱导和生长，活性炭可起到防止培养基褐变的作用，调节配方组分的特定比例可有效促进油梨种苗生根，并缩短生根时间；

(5)炼苗移栽：待组培苗的苗高≥3cm，不定根数≥3根和根长≥5cm后，进行炼苗，炼苗后，采用蛭石、椰糠和营养土进行移栽培养，待苗株的叶片展开4～5片，完成炼苗移栽。

进一步说明，步骤(1)中，种子无开裂的消毒方法为：先用水冲洗2～4min，再用体积浓度75％乙醇溶液冲洗10～20s，最后用无菌水冲洗4～5次；种子开裂的消毒方法为：先用水冲洗8～12min，用体积浓度75％乙醇溶液冲洗10～20s，无菌水冲洗4～5次，用含有1-2滴吐温的质量浓度0.5％次氯酸钠溶液冲洗12～18min，再用无菌水冲洗4～5次，再用体积浓度75％乙醇溶液冲洗8～12s，最后用无菌水冲洗4～5次。

进一步说明，步骤(3)中，诱导培养基的配方为MS+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂粉8％+蔗糖30g/L，pH值为5.7；6-BA是6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，简称6-BA)，别名：6-苄氨基嘌呤、细胞分裂素，KT为激动素(kinetin，简称KT)，6-BA可提高增殖倍数，并加快生长速度，但过高浓度则使茎叶玻璃化，谷氨酰胺可提供各种氨基酸，进一步促进增殖倍数，椰子水可促进增殖，提供营养物质；

进一步说明，步骤(3)中，先进行黑暗培养1～2d，培养温度为21～25℃，随后转入光照培养，光照培养的条件为：培养温度为21～25℃，每天光照时间为12～16h，光照强度为30～40μmoL·m^-2·s^-1。

进一步说明，步骤(4)中，增殖培养基的配方为MS+VB1 0.2mg/L+6-BA 1mg/L+谷氨酰胺400mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L+10％椰子水，pH值为5.7；VB1为维生素B1(VitaminB1，简称VB1)；

进一步说明，步骤(4)中，在转入生根培养基之前，还包括过渡培养，所述过渡培养为5-7d的第一阶段过渡培养和/或5-10d的第二阶段过渡培养；在增殖培养结束后，可根据组培苗的适应状态选择不同阶段过渡培养进行生根培育。

进一步说明，过渡培养的条件为：培养温度为21～25℃，每天光照时间为12～16h，光照强度为30～40μmoL·m^-2·s^-1。

进一步说明，步骤(4)中，第一阶段过渡培养的培养基配方为1/2MS+VB1 0.1mg/L+6-BA 0.05mg/L+谷氨酰胺200mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L+10％椰子水；第二阶过渡培养的培养基配方为1/2MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.25mg/L+谷氨酰胺100mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L+10％椰子水；本发明采用梯度式的过渡培养基，根据组培苗的适应状态调整VB1、6-BA、谷氨酰胺和NAA用量配比，可有效促进生根发育，缩短生根时间，并改善组培苗的品质。

进一步说明，步骤(4)中，增殖培养和生根培养的条件为：培养温度为21～25℃，每天光照时间为12～16h，光照强度为30～40μmoL·m^-2·s^-1。

进一步说明，步骤(4)中，生根培养基的配方为1/2MS+0.25mg/L NAA+1.00g/L活性炭+10％椰子水+8％琼脂粉+30g/L蔗糖，pH值为5.7。

进一步说明，步骤(5)中，炼苗的方法为：21～25℃闭瓶炼苗3d，松瓶炼苗3d，最后开瓶光照炼苗2d。

进一步说明，步骤(5)中，蛭石、椰糠和营养土的质量比为1：1：0～100。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明利用种胚、腋芽和顶芽为外植体，经科学组合消毒后，可诱导产生多芽体，并通过增殖、壮苗和生根等培养，结合特定的炼苗方式，不仅解决油梨生根困难和繁育周期长的问题，还增加了油梨种苗的繁殖系数，为油梨种苗的快速繁育提供核心技术。

(2)本发明通过处理种胚，根据种子紧闭开裂情况，科学选择特定组合的消毒方式，可降低污染率，结合科学配比的诱导培养基和增殖培养基，进一步提高多芽体的诱导率，并且缩短诱导时间，还可提高多芽体的不定芽数量，进而为后续不定芽的生长和组培苗的生根奠定物质基础。

(3)本发明通过优化生根培养基的配方，并采用梯度式的过渡培养基并结合生根培养基进行培育，能够有效地解决组培苗的生根问题，不仅提高了组培苗的生根率和缩短生根时间，而且还可使根系变粗壮、不定根数量增多，进而改善组培苗的生根情况，有效地避免多芽体诱导和增殖后无法生长或生长低下等问题，增加油梨种苗的繁殖系数，实现快速组培繁育的目的。

(4)此外，本发明结合特定的培养和炼苗移栽条件，进一步提高油梨种苗的成活率，促进种苗的生长发育，实现种苗的快速繁育。

附图说明

图1为本发明实施例的油梨组织培养与繁殖的过程；注：A为外植体初培养；B为外植体诱导丛生芽；C为丛生芽增殖；D为丛生芽增殖；E为油梨组培苗生根；F为可移栽的油梨生根组培苗；G为油梨组培苗生根根系；H为油梨组培苗移栽。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)消毒：选择成熟或接近成熟的种子，去除种皮，清洗，种子无开裂：先用水冲洗3min，再用体积浓度70％乙醇溶液冲洗10s，最后用无菌水冲洗4次；

(2)处理：将步骤(1)消毒的种子，置于无菌纸上，采用消毒的手术刀切割种子，取出种胚，去除种胚外的其他组织，得外植体；

(3)诱导培养：将外植体接种至配方为MS+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂粉8％+蔗糖30g/L的诱导培养基中，pH值为5.5，先进行黑暗培养1d，培养温度为21℃，随后转入光照培养，光照培养的条件为：培养温度为21℃，每天光照时间为12h，光照强度为30μmoL·m^-2·s^-1，光照培养结束，得不定芽；

(4)增殖和生根培养：将不定芽切成2个芽块，接种至配方为MS+VB1 0.2mg/L+6-BA1mg/L+谷氨酰胺400mg/L+琼脂粉8％+蔗糖30g/L+10％椰子水的增殖培养基中培养，pH值为5.7，增殖培养条件为：培养温度为21℃，每天光照时间为12h，光照强度为30μmoL·m^-2·s^-1，待长至4片叶时，转入配方为1/2MS+0.20mg/L NAA+0.5g/L活性炭+8％椰子水+7.5％琼脂粉+25g/L蔗糖的生根培养基中，pH值为5.5，进行生根培养，得组培苗；其中，生根培养的条件为：培养温度为21℃，每天光照时间为12h，光照强度为30μmoL·m^-2·s^-1；

(5)炼苗移栽：待组培苗的苗高≥3cm，不定根数≥3根和根长≥5cm后，采用21℃闭瓶炼苗3d，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，松瓶炼苗3d，打走瓶盖，正常灯光直照下培养炼苗2d后，流水小心将残留的琼脂冲洗干净，采用质量比为1：1的蛭石和椰糠进行移栽培养，株距2厘米以上，用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保湿，室内温度控制在24℃，3天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开4-5叶后即可带土移栽至大田。

实施例2

一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)消毒：选择成熟或接近成熟的种子，去除种皮，清洗，种子开裂：先用水冲洗8min，用体积浓度70％乙醇溶液冲洗10s，无菌水冲洗5次，用含有2滴吐温的质量浓度0.2％次氯酸钠溶液冲洗12min，再用无菌水冲洗5次，再用体积浓度70％乙醇溶液冲洗8s，最后用无菌水冲洗5次；

(2)处理：将步骤(1)消毒的种子，置于无菌纸上，采用消毒的手术刀切割种子，取出种胚，去除种胚外的其他组织，得外植体；

(3)诱导培养：将外植体接种至配方为MS+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂粉8％+蔗糖30g/L的诱导培养基中，pH值为6.0，先进行黑暗培养2d，培养温度为25℃，随后转入光照培养，光照培养的条件为：培养温度为25℃，每天光照时间为16h，光照强度为40μmoL·m^-2·s^-1，光照培养结束，得不定芽；

(4)增殖和生根培养：将不定芽切成3个芽块，接种至配方为MS+VB1 0.2mg/L+6-BA1mg/L+谷氨酰胺400mg/L+琼脂粉8％+蔗糖30g/L+10％椰子水的增殖培养基中培养，pH值为5.7，增殖培养条件为：培养温度为25℃，每天光照时间为16h，光照强度为40μmoL·m^-2·s^-1，待长至6片叶时，转入配方为1/2MS+VB1 0.1mg/L+6-BA 0.05mg/L+谷氨酰胺200mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L+10％椰子水的第一阶段过渡培养的培养基中，进行第一阶段过渡培养；培养7d后，根据组培苗适应状态决定，转入配方为1/2MS+0.30mg/L NAA+1.5g/L活性炭+12％椰子水+8.5％琼脂粉+35g/L蔗糖的生根培养基中，pH值为6.0，进行生根培养，得组培苗；其中，第一阶段过渡培养和生根培养的条件均为：培养温度为25℃，每天光照时间为16h，光照强度为40μmoL·m^-2·s^-1；

(5)炼苗移栽：待组培苗的苗高≥3cm，不定根数≥3根和根长≥5cm后，采用25℃闭瓶炼苗3d，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，松瓶炼苗3d，打走瓶盖，正常灯光直照下培养炼苗2d后，流水小心将残留的琼脂冲洗干净，采用质量比为1：1：100的蛭石、椰糠和营养土进行移栽培养，株距2厘米以上，用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保湿，室内温度控制在24℃，3天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开4-5叶后即可带土移栽至大田。

实施例3

一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)消毒：选择成熟或接近成熟的种子，去除种皮，清洗，种子开裂：先用水冲洗12min，用体积浓度80％乙醇溶液冲洗20s，无菌水冲洗5次，用含有1滴吐温的质量浓度0.8％次氯酸钠溶液冲洗18min，再用无菌水冲洗5次，再用体积浓度80％乙醇溶液冲洗12s，最后用无菌水冲洗5次；

(2)处理：将步骤(1)消毒的种子，置于无菌纸上，采用消毒的手术刀切割种子，取出种胚，去除种胚外的其他组织，得外植体；

(3)诱导培养：将外植体接种至配方为MS+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂粉8％+蔗糖30g/L的诱导培养基中，pH值为5.5，先进行黑暗培养1d，培养温度为23℃，随后转入光照培养，光照培养的条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为14h，光照强度为35μmoL·m^-2·s^-1，光照培养结束，得不定芽；

(4)增殖和生根培养：将不定芽切成3个芽块，接种至配方为MS+VB1 0.2mg/L+6-BA1mg/L+谷氨酰胺400mg/L+琼脂粉8％+蔗糖30g/L+10％椰子水的增殖培养基中培养，pH值为5.7，增殖培养条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为14h，光照强度为35μmoL·m^-2·s^-1，待长至4片叶时，转入配方为1/2MS+VB1 0.1mg/L+6-BA0.05mg/L+谷氨酰胺200mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L+10％椰子水的第一阶段过渡培养的培养基中，进行第一阶段过渡培养；培养5d后，根据组培苗适应状态决定，转入配方为1/2MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.25mg/L+谷氨酰胺100mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L+10％椰子水的第二阶段过渡培养的培养基中，进行第二阶段过渡培养；培养5d后，根据组培苗适应状态决定，转入配方为1/2MS+0.25mg/L NAA+1.00g/L活性炭+10％椰子水+8％琼脂粉+蔗糖30g/L的生根培养基中，pH值为5.7，进行生根培养，得组培苗；其中，第一阶段过渡培养、第二阶段过渡培养和生根培养的条件均为：培养温度为23℃，每天光照时间为14h，光照强度为35μmoL·m^-2·s^-1；

(5)炼苗移栽：待组培苗的苗高≥3cm，不定根数≥3根和根长≥5cm后，采用21℃闭瓶炼苗3d，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，松瓶炼苗3d，打走瓶盖，正常灯光直照下培养炼苗2d后，流水小心将残留的琼脂冲洗干净，采用质量比为1：1：10的蛭石、椰糠和营养土进行移栽培养，株距2厘米以上，用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保湿，室内温度控制在24℃，3天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开4-5叶后即可带土移栽至大田。

实施例4

根据实施例3油梨组织培养与快速繁殖的相同方法，其区别在于：消毒：选择成熟或接近成熟的种子，去除种皮，清洗，种子开裂：先用水冲洗10min，用体积浓度75％乙醇溶液冲洗20s，无菌水冲洗4次，用含有2滴吐温的质量浓度0.5％次氯酸钠溶液冲洗15min，再用无菌水冲洗4次，再用体积浓度75％乙醇溶液冲洗10s，最后用无菌水冲洗5次。

实施例5

根据实施例3油梨组织培养与快速繁殖的相同方法，其区别在于：种子消毒：选择成熟或接近成熟的种子，去除种皮，清洗，种子无开裂：先用水冲洗3min，再用体积浓度75％乙醇溶液冲洗15s，最后用无菌水冲洗5次。

实施例6-不同消毒方法对紧闭无开裂种子的影响

不同消毒方法对紧闭无开裂种子的影响结果如表1：

表1

由表1可见，不使用体积浓度70％乙醇溶液消毒，则会降低污染率，使用75％乙醇消毒可以明显降低污染率，同时使用75％乙醇消毒时间达到15s以上可以控制污染率1％以下；与增加含有1滴吐温的0.5％次氯酸钠消毒15min或含有1滴吐温的0.1％氯化汞消毒15min的效果几乎相同，综合考虑投入和环境影响等问题，种子禁闭无开裂的消毒方法为：自来水冲洗3分钟→体积浓度75％乙醇15s→无菌水冲洗4-5次。

实施例7-不同消毒方法对开裂种子的影响

不同消毒方法对开裂种子的影响结果如表2：

表2

由表2可见，只是使用体积浓度70％乙醇消毒，对污染率降低效果不好。采用含有1滴吐温的质量浓度0.5％次氯酸钠消毒15min或含有1滴吐温的0.1％氯化汞消毒15min，可明显增强消毒效果，降低污染率，并随着使用时间增加显著地降低污染率。综合考虑消毒效果、投入和环境影响等问题，种子开裂消毒方法选择为：流动自来水冲洗10分钟→体积浓度75％乙醇15s→无菌水冲洗4-5次→含有1-2滴吐温的质量浓度0.1％氯化汞消毒15min→无菌水冲洗4-5次→体积浓度75％乙醇10s→无菌水冲洗4-5次。

实施例8-种胚残留不同程度的其他组织对诱导的影响

预处理1、预处理2和预处理3分别为其他组织残留面积占种胚面积的100％、50％和1％，种胚预处理对褐变率和丛生芽诱导的影响结果如表3：

表3

预处理	褐变率	丛生芽诱导率
			预处理1	8％	95％
预处理2	40％	60％
			预处理3	80％	10％

由表3可见，完整种胚有利于丛生芽的诱导率，同时，非种胚组织的增加体积，将导致褐化程度，进而影响诱导。切剥完整的种胚，同时减少其他组织有利于提高诱导率。

实施例9-不同外植体对多芽体诱导的影响

将种胚、腋芽、顶芽和叶片等不同外植体分别接种至配方为MS+6-BA 2.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L，pH值为5.7的诱导培养基中培养，不同外植体对诱导多芽体的结果如表4：

表4

由表4可见，种胚、腋芽、顶芽和叶片等不同组织诱导多芽体的效率存在很大差异，可诱导出的多芽体的不定芽数量也存在较大差异，其中种胚的诱导率和不定芽数量高。

实施例10-诱导培养基的不同配方对诱导的影响

诱导培养基的不同配方对多芽体诱导的影响结果如表5：

表5

处理组	配方	诱导时间	诱导芽数
				处理组1	6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L	7d	7
处理组2	6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L	12d	4
				处理组3	KT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L	12d	5
处理组4	6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L	13d	4
				处理组5	VB1 0.4mg/L+肌醇100mg/L+0.1mg/L NAA	12d	4
处理组6	VB1 0.4mg/L+肌醇100mg/L+0.4μmol/L毒莠定	13d	5

注：处理组1-6的琼脂粉为8％、蔗糖为30g/L，pH值为5.7。

如表5，6-BA、KT和NAA提高了多芽体诱导率，只有达到相随平衡的比例才可提高诱导率，提高外植体可诱导出的芽个数，并缩短诱导时间。处理组5和6可以诱导多芽体的产生，但时间和效率都较差。

实施例11-增殖培养基的不同配方对不定芽增殖的影响

增殖培养基的不同配方对不定芽增殖的影响结果如表6：

表6

如表6，6-BA浓度的增加提高了增殖倍数和加快生长速度，但过高浓度带来的来是茎叶的玻璃化。谷氨酰胺和椰子水有利于提高增殖倍数和促进不定芽的生长。

实施例12-生根培养基的不同配方对生根的影响

生根培养基的不同配方对生根的影响结果如表7：

表7

由表7可知，处理组1的生根率为100％，组培苗生长好，表明本发明采用科学配制的生根培养基，可使生根率为100％，不仅缩短生根的时间，还可使组培苗壮实，生成的根又壮又长，且形成的不定根数量多，侧根还壮长，有利于组培苗的炼苗移栽，提高成活率。

处理组4未添加任何激素，生根率最低，与处理组4相比，处理组3添加NAA后生根率明显升高；处理组5生根时间较长，表明适当低浓度的MS有利于组培苗的生根，因为可促进其从异养转化为自养，故虽然添加NAA后不同MS浓度的培养基均可诱导组培苗全部生根，但是生根时间和苗生长还是有差距，表现浓度为50％的MS生根最快，过高则会延迟生根时间；处理组6的NAA浓度较低，各方面都不太好；处理组7的NAA浓度较高，组培苗的根则变短变粗。

实施例13-不同阶段过渡培养对生根的影响

不同阶段过渡培养对生根的影响结果如表8：

表8

从表8可看出，本发明采用梯度式的过渡培养阶段进行生根培育，能够有效地解决组培苗的生根问题，不仅进一步缩短生根时间，同时还可提高组培苗的苗高，并扩大其根系的吸收面积，进一步增强根系的吸收能力，从而改善组培苗的生长发育，提高其移栽成活率和大田成活率。

实施例14-不同蛭石、椰糠和营养土添加量对成活率的影响

分别计算组培苗移栽至蛭石、椰糠和营养土培养30天后的移栽成活率，以及种苗移栽至大田种植30天后的大田成活率，结果如表9：

表9

蛭石：椰糠：营养土	移栽成活率	大田成活率
			1:1:0	90％	85％
1:1:1	95％	90％
			1:1:10	98％	96％
1:1:20	97％	97％
			1:1:100	90％	98％

从表9可看出，营养土中加适量蛭石、椰糠可提高移栽成活率，因为蛭石可起到保水和保肥作用，椰糠可提高提升通气性，但过多的蛭石、椰糠对移栽成活率并无提高，同时影响大田移栽的成活率；高比例营养土虽然可以提高大田种植成活率，但影响移栽成活率；故综合考虑到移栽和大田种植的成活率，选择蛭石：椰糠：营养土为1：1：10的比例。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)消毒：取种子，去除种皮，根据种子开裂情况选择消毒方法：

种子无开裂：采用体积浓度70～80％乙醇溶液消毒处理；

种子开裂：采用体积浓度70～80％乙醇溶液和含有1-2滴吐温的质量浓度0.2～0.8％次氯酸钠溶液消毒处理；

(2)处理：切割步骤(1)消毒的种子，取出种胚，去除种胚外的其他组织，得外植体；

(3)诱导培养：将外植体接种至诱导培养基中，先进行黑暗培养，随后转入光照培养，得不定芽；

(4)增殖和生根培养：将不定芽切成芽块，接种至增殖培养基中，进行增殖培养，待长至叶片数≥4片时，转入配方为1/2MS+0.20-0.30mg/L NAA+0.5-1.5g/L活性炭+8-12％椰子水+7.5-8.5％琼脂粉+25-35g/L蔗糖的生根培养基中，pH值为5.5～6.0，进行生根培养，得组培苗；

(5)炼苗移栽：待组培苗的苗高≥3cm，不定根数≥3根和根长≥5cm后，进行炼苗，炼苗后，采用蛭石、椰糠和营养土进行移栽培养，待苗株的叶片展开4～5片，完成炼苗移栽。

2.根据权利要求1的一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子无开裂的消毒方法为：先用水冲洗2～4min，再用体积浓度75％乙醇溶液冲洗10～20s，最后用无菌水冲洗4～5次；所述种子开裂的消毒方法为：先用水冲洗8～12min，用体积浓度75％乙醇溶液冲洗10～20s，无菌水冲洗4～5次，用含有1-2滴吐温的质量浓度0.5％次氯酸钠溶液冲洗12～18min，再用无菌水冲洗4～5次，再用体积浓度75％乙醇溶液冲洗8～12s，最后用无菌水冲洗4～5次；步骤(1)中，所述外植体还包括腋芽或顶芽。

3.根据权利要求1的一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述诱导培养基的配方为MS+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂粉8％+蔗糖30g/L，pH值为5.7。

4.根据权利要求1的一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述增殖培养基的配方为MS+VB1 0.2mg/L+6-BA 1mg/L+谷氨酰胺400mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L+10％椰子水，pH值为5.7；步骤(4)中，所述生根培养基的配方为1/2MS+0.25mg/L NAA+1.00g/L活性炭+10％椰子水+8％琼脂粉+30g/L蔗糖，pH值为5.7。

5.根据权利要求1的一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述先进行黑暗培养1～2d，培养温度为21～25℃，随后转入光照培养，光照培养的条件为：培养温度为21～25℃，每天光照时间为12～16h，光照强度为30～40μmoL·m^-2·s^-1；步骤(4)中，所述增殖培养和生根培养的条件为：培养温度为21～25℃，每天光照时间为12～16h，光照强度为30～40μmoL·m^-2·s^-1。

6.根据权利要求1的一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(4)中，在转入生根培养基之前，还包括过渡培养，所述过渡培养为5-7d的第一阶段过渡培养和/或5-10d的第二阶段过渡培养。

7.根据权利要求6的一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述第一阶段过渡培养的培养基配方为1/2MS+VB1 0.1mg/L+6-BA 0.05mg/L+谷氨酰胺200mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L+10％椰子水；所述第二阶过渡培养的培养基配方为1/2MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.25mg/L+谷氨酰胺100mg/L+8％琼脂粉+蔗糖30g/L+10％椰子水。

8.根据权利要求6的一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，所述过渡培养的条件为：培养温度为21～25℃，每天光照时间为12～16h，光照强度为30～40μmoL·m^-2·s^-1。

9.根据权利要求1的一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述炼苗的方法为：21～25℃闭瓶炼苗3d，松瓶炼苗3d，最后开瓶光照炼苗2d。

10.根据权利要求1的一种油梨组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述蛭石、椰糠和营养土的质量比为1：1：0～100。

Images