CN115281092B - 一种利用七子花种子胚的繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用七子花种子胚的繁育方法，属于植物育苗技术领域。为了解决现有的种子繁育成活率低的问题，提供一种利用七子花种子胚的繁育方法，该方法包括采摘筛选出成熟、外形饱满的七子花果实，将筛选的七子花果实进行清洗消毒处理；将经过消毒处理后的七子花果实去除外果皮，取出种子，再将种子进行清洗灭菌处理后，全部切除种皮，取出去皮后干净的种子；将去皮后干净的种子接种到无激素MS培养基并控制温度在20℃～30℃进行初次培养一段时间；再将初次培养后无污染的种子进行切开，取出胚接种到无激素MS培养基中进行再次培养至生长成幼苗。本发明的繁育方法能够有效实现利用种子进行繁育，且具有成活率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用七子花种子胚的繁育方法，属于植物育苗技术领域。
背景技术
七子花为落叶灌木或小乔木，属于忍冬科七子花属的唯一种类，为优良的观赏植物，是我国特有的单型属植物，其分布范围狭窄，仅分布在我国浙江及安徽省南部，且其种群日趋缩小，现有个体数量很少，濒危程度日益加重，是我国首批二级濒危保护植物之一和中国生物多样性保护行动计划中优先保护的物种。急需对七子花进行切实有效的保护，并增加其个体数量，且迄今国内外对于七子花快速繁育方面的研究和报道都很少，寻找出适合七子花的培养和生物多样化担保更多的选择。
七子花是虫媒花，但是昆虫的传粉效率低，七子花结实率低，且胚发育不完全，果实脱落时，大多数种子只有心形或马蹄形的胚，有些七子花种群出现不结果的现象，种子体积小，且外有较厚的果皮包被，胚未完全成熟等因素影响，使得七子花种子的萌发率极低，仅有5％至10％。因此，七子花有性繁育作用不明显，种群内很难看到七子花的实生苗，也很难看到由实生苗长成的幼树。所以，为了提高种群的数量，利用无性方式进行培育，是一种可行的方法，如采用插接的方式进行繁育，现有技术中如中国专利文献(公开号：CN110558130B)公开的一种七子花扦插方法，在5月中旬或6月中旬，选择阴雨天或早上露水未干时，剪取七子花一年生的粗壮、芽眼饱满的木质等消毒后，插穗在促生根的生根液中里进行浸泡，再配制扦插基质，将经过促生根处理的插穗插入到上述基质中进行压实浇水后，培养、移栽后繁育成相应的幼苗。但是，目前对于七子花的繁育大多是采用插扦等方式进行繁育，目前还没有发现通过利用种子进行人工培育繁育的方式。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种利用七子花种子胚的繁育方法，解决的问题是提供一种新的利用种子胚进行繁育的方式，且具有高成活率。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种利用七子花种子胚的繁育方法，该方法包括以下步骤：
A、筛选：采摘筛选出成熟、外形饱满的七子花果实，将筛选的七子花果实进行清洗消毒处理；
B、将经过消毒处理后的七子花果实去除外果皮，取出种子，再将种子进行清洗灭菌处理后，全部切除种皮，取出去皮后干净的种子；
C、将去皮后干净的种子接种到无激素MS培养基并控制温度在20℃～30℃进行初次培养一段时间；
D、再将初次培养后无污染的种子进行切开，取出胚接种到无激素MS培养基中进行再次培养至生长成幼苗；所述再次培养温度控制在20℃～30℃；
步骤C和步骤D中所述无激素MS培养基各自独立的包括以下成分的质量浓度：
MS：4.5～5.0g/L；蔗糖：20～25g/L；琼脂：6～7g/L；
且所述无激素MS培养基体系的pH值调节为6.0～6.5。
通过将七子花的种子取出后先将整颗种子接种到无激素MS培养基中无进行培养一段时间，能够促进种子中胚的生命力，而后再对种子进行切开，切除其中的胚乳并取出其中的胚接种到无激素MS培养基中进行培养，且使该培养基中含有上述成分的含量和pH体系下，能够有效的促进胚的生长，且具有高成活率的优点；同时，通过情况下，对于植物种子的培养，通过激素的作用下能够更有利于促进其生长，而本发明在长期的研究开发中发现，针对七子花的种子胚进行培养的过程中，通过采用上述无激素MS培养基进行培养，更有利于七子花的胚的生长，能够高效且快速的生长成七子花的幼苗，保证其在培养过程中的高成活率的特性。上述步骤C和步骤D中的无激素MS培养基可以采用相同或不同的成分组成，在二次培养中各自独立选择相应的无激素MS培养基，及体系的pH值要求。
在上述利用七子花种子胚的繁育方法中，作为优选，步骤C中所述初次培养的光照时间为每天光照时间12～14小时；培养时间为10～13天。通过在初次培养的过程中控制光照时间和温度，能够更有效的保证种子的萌发和生长，有利于后期切取的胚后续培养的成活率。先经过步骤C的种子培养一段时间后，能够促进种子中胚的生命力，而后再对种子进行切开，切除其中的胚乳并取出其中的胚接种到无激素MS培养基中进行培养，且使该培养基中含有上述成分的含量和pH体系下，能够有效的促进胚的生长，且具有高成活率的优点；作为进一步的优选，所述光照的强度为2000-4000lux，光暗交替对幼胚生长有利。
在上述利用七子花种子胚的繁育方法中，作为优选，步骤D中所述再次培养的光照时间为每天光照时间12～14小时；培养时间为30～35天。在将七子花的胚取出后接种到无激素培养基中，并控制上述光照时间和温度条件，在培养一定天数后，能够有效的生长成七子花幼苗，且成活率高，能够达到100％的成活率，大大的提升了七子花的繁育方式，更有利于种群内形成生物多样化。作为更进一步的优选，所述光照的强度为2000-4000lux，光照太弱苗会细弱和徒长，太强则会使苗灼伤，均不利于幼苗的生长，光暗交替对幼胚生长有利。
在上述利用七子花种子胚的繁育方法中，作为优选，步骤D中将种子进行切开具体为：
取经过无污染初次培养后无污染的种子，用经过消毒后的手术刀沿种子纵向且从种子小头向大头方向切开五分之四左右，再用镊子顺着切口左右拉开，用手术刀切除胚乳，取出相应的胚接种到无激素MS培养基。通过上述切开方式，能够有效的避免在切开过程中对种子内的胚造成损伤，保持胚的完整性，有利于后续培养过程中提升成活性。
在上述利用七子花种子胚的繁育方法中，作为优选，步骤C中所述初次培养中将整粒种子的大头部分朝上接种到无激素MS培养基中，且插入整粒种子的三分之一左右。先经过上述方式的种子培养一段时间后，能够促进种子中胚的生命力，能够有效的促进胚的生长。
在上述利用七子花种子胚的繁育方法中，作为优选，步骤B中所述洗清灭菌处理具体为：将种子加入无菌水，再加入几滴洗洁精，清洗结束后，再加入0.1％的升汞溶液进行浸泡处理，完成清洗消毒。能够更好的清洗洁净，且通过0.1％的升汞溶液进行浸泡，有效的实现灭菌的作用，保证种子是无菌下操作，提升后续的培养成活率。
在上述利用七子花种子胚的繁育方法中，所述无激素MS培养基中的MS采用如下的成分浓度的配方：
硝酸钾：1800～2000mg/L；硝酸铵：1600～1700mg/L；磷酸二氢钾：160～180mg/L；硫酸镁：360～380mg/L；氯化钙：420～460mg/L；
碘化钾：0.8～0.9mg/L、硼酸：6.2～6.5mg/L；硫酸锰：22～25mg/L；硫酸锌：8～10mg/L；钼酸钠：0.2～0.3mg/L、硫酸铜：0.02～0.04mg/L；氯化钴：0.02～0.04mg/L；
乙二胺四乙酸二钠：37～39mg/L；硫酸亚铁：27～29mg/L；
肌醇：90～110mg/L；甘氨酸：1.0～3.0mg/L；盐酸硫胺素：0.1～0.3mg/L；盐酸吡哆醇：0.5～1.0mg/L；烟酸：0.5～1.0mg/L。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
通过将取出的种子先在无激素MS培养基中培养一定时间，再将其中的胚取出接种到无激素MS培养基中进行培养方式，能够有效的提升七子花的胚的成活率，有效实现培养成幼苗的效果。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
采摘并筛先出成熟的，颜色呈金黄色、形状饱满且用手指揉捏上去硬度较好的七子花果实；
在超净工作台上进行操作，将选取的七子花果实放入清洁容器中，加入无菌水，然后加入2-3滴的洗洁精，轻轻摇晃1min，倒掉水；再重复上述过程清洗三次，加入0.1％的升汞溶液浸泡5min，倒掉升汞溶液后，再用无菌水清洗三次。
然后，取用经过75％乙醇溶液消毒的镊子和手术刀，用手术刀和镊子配合把七子花的果皮去除，取出其中的种子，再把种子的种皮割开，切除全部种皮，然后把干净的种子接入到无激素MS培养基里进行初次培养，上述接种时将去种皮后的种子尖头的部分向下插入到上述无激素MS培养基上，插入整粒种子的三分之一左右，使种子的粗的大头部分朝上；将种子尖的部分向下插入培养基，种子粗的大头部分朝上，插入整粒种子三分之一左右。上述无激素MS培养基包括以下成分的质量浓度：
MS：4.8g/L，蔗糖：20g/L，琼脂：6.5g/L，并调节该培养基的体系pH为6.0。上述的无激素MS培养基在121℃下，高温灭菌30min，再使用；
初次培养的温度设置为24℃，且使每天的光照时间14h，黑暗处存放培养10h，整个初次培养的培养时间为10天，光照的强度为2000-4000lux，光暗交替对幼胚生长有利。
将经过上述初次培养后无污染的种子取出，用经过消毒的手术刀和镊子配合切开种子，从种子小头向大头方向，纵向切开五分之四左右，再用镊子顺着切口左右拉开，然后用手术刀尖轻轻挑出胚(去除胚乳)接种到无激素MS培养基内进行再次培养，这里无激素MS培养基包括以下成分的质量浓度：
MS：4.8g/L，蔗糖：20g/L，琼脂：6.5g/L，并调节该培养基的体系pH为6.0；上述的无激素MS培养基在121℃下，高温灭菌30min，再使用。生长素既能促进生长也能抑制生长，不同植物对生长素的敏感度不同，本发明在长期的研究开发中发现，使用低浓度生长素的培养基出现了抑制七子花幼苗生长的情况，说明七子花对激素比较敏感，通过采用本发明的上述培养基能够有效的保证七子花的生长和高成活率的优点。
上述的MS采用一般的MS培养基均可，本实施例中最好采用如下的MS：
硝酸钾：1900mg/L；硝酸铵：1650mg/L；磷酸二氢钾：170mg/L；硫酸镁：370mg/L；氯化钙：440mg/L；碘化钾：0.83mg/L；硼酸：6.2mg/L；硫酸锰：22.3mg/L；硫酸锌：8.6mg/L；钼酸钠：0.25mg/L；硫酸铜：0.025mg/L；氯化钴：0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠：37.3mg/L；硫酸亚铁：27.8mg/L；肌醇：100mg/L；甘氨酸：2.0mg/L；盐酸硫胺素：0.1mg/L；盐酸吡哆醇：0.5mg/L；烟酸：0.5mg/L；
上述再次培养的温度设置为24℃，每天的光照时间为14h，光照强度为2000-4000lux，黑暗处存放培养10h，培养5d后胚会从白色转绿色，再培养至10d后能看见二片子叶，经过培养至20d后能看见真叶，经过培养30d后能成为正常的带有根、茎、叶和芽的七子花小苗。
采用本实施例的繁育方法，进行同步繁育20颗，成活率达到100％。
实施例2
采摘并筛先出成熟的，颜色呈金黄色、形状饱满且用手指揉捏上去硬度较好的七子花果实；
在超净工作台上进行操作，将选取的七子花果实放入清洁容器中，加入无菌水，然后加入2-3滴的洗洁精，轻轻摇晃3min，倒掉水；再重复上述过程清洗三次，倒掉水后，再向容器中加入质量浓度为0.1％的升汞溶液进行浸泡处理5min，倒掉升汞溶液后，再用无菌水清洗三次，得到清洗消毒后的七子花果实。
然后，取用经过75％乙醇溶液消毒的镊子和手术刀，用手术刀和镊子配合把七子花的果皮去除，取出其中的种子，再把种子的种皮割开，切除全部种皮，然后把干净的种子接入到无激素MS培养基里进行初次培养，上述接种时将去种皮后的种子尖头的部分向下插入到上述无激素培养基上，插入整粒种子的三分之一左右，使种子的粗的大头部分朝上；种子尖的部分向下插入培养基，种子粗的大头部分朝上，插入整粒种子三分之一左右。上述无激素MS培养基包括以下成分的质量浓度：
MS：4.5g/L，蔗糖：25g/L，琼脂：7.0g/L，并调节该无激素MS培养基的体系pH为6.5。上述的无激素MS培养基在121℃下，高温灭菌30min，再使用。
初次培养的温度设置为26℃，且使每天的光照时间14h，黑暗处培养10h，整个初次培养的培养时间为12天。所述光照的强度为2000-4000lux，光暗交替对幼胚生长有利。
将经过上述初次培养后无污染的种子取出，用经过消毒的手术刀和镊子配合切开种子，从种子小头向大头方向，纵向切开五分之四左右，再用镊子顺着切口左右拉开，然后用手术刀尖轻轻挑出胚(去除胚乳)接种到无激素MS培养基内进行再次培养，这里无激素MS培养基包括以下成分的质量浓度：
MS：4.5g/L，蔗糖：25g/L，琼脂：7.0g/L，并调节该培养基的体系pH为6.5；上述的无激素MS培养基在121℃下，高温灭菌30min，再使用；
上述初次培养和再次培养的无激素MS培养基中的MS最好采用如下的MS：
硝酸钾：1950mg/L；硝酸铵：1700mg/L；磷酸二氢钾：160mg/L；硫酸镁：360mg/L；氯化钙：460mg/L、碘化钾：0.8mg/L；硼酸：6.5mg/L；硫酸锰：22mg/L；硫酸锌：8mg/L；钼酸钠：0.3mg/L；硫酸铜：0.02mg/L；氯化钴：0.03mg/L、乙二胺四乙酸二钠：38mg/L；硫酸亚铁：27mg/L；肌醇：110mg/L；甘氨酸：1.0mg/L；盐酸硫胺素：0.3mg/L；盐酸吡哆醇：0.8mg/L；烟酸：0.8mg/L；
上述再次培养的温度设置为24℃，每天的光照时间为14h，光照强度为2000-4000lux，黑暗处存放10h，培养5d后胚会从白色转绿色，再培养至10d后能看见二片子叶，经过培养至20d后能看见真叶，经过培养30d后能成为正常的带有根、茎、叶和芽的七子花小苗。
采用本实施例的繁育方法，进行同步繁育20颗，成活率达到100％。
实施例3
采摘并筛先出成熟的，颜色呈金黄色、形状饱满且用手指揉捏上去硬度较好的七子花果实；
在超净工作台上进行操作，将选取的七子花果实放入清洁容器中，加入无菌水，然后加入2-3滴的洗洁精，轻轻摇晃3min，倒掉水；再重复上述过程清洗三次，倒掉水后，向容器中加入质量浓度为0.1％的升汞溶液进行浸泡5min，倒掉升汞溶液后，再用无菌水清洗三次，得到清洗消毒后的七子花果实。
然后，取用经过75％乙醇溶液消毒的镊子和手术刀，用手术刀和镊子配合把清洗消毒后七子花果实的果皮去除，取出其中的种子，再把种子的种皮割开，切除全部种皮，然后把干净去除种皮后的种子接入到无激素MS培养基里进行初次培养，上述接种时将去种皮后的种子尖头的部分向下插入到上述无激素培养基上，插入整粒种子的三分之一左右，使种子的粗的大头部分朝上；
将种子尖的部分向下插入培养基，种子粗的大头部分朝上，插入整粒种子三分之一左右。
上述无激素MS培养基包括以下成分的质量浓度：
MS：5.0g/L，蔗糖：23g/L，琼脂：6.8g/L，并调节该培养基的体系pH为6.0；无激素MS培养基在121℃下，高温灭菌30min，
上述初次培养的温度设置为26℃，且使每天的光照时间14h，黑暗处培养10h，整个初次培养的培养时间为12天，光照强度为2000-4000lux。
将经过上述初次培养后无污染的种子取出，用经过消毒的手术刀和镊子配合切开种子，从种子小头向大头方向，纵向切开五分之四左右，再用镊子顺着切口左右拉开，然后用手术刀尖轻轻挑出胚(去除胚乳)接种到无激素MS培养基内进行再次培养，无激素MS培养基包括以下成分的质量浓度：
MS：5.0g/L，蔗糖：23g/L，琼脂：6.8g/L，并调节该培养基的体系pH为6.0；无激素MS培养基在121℃下，高温灭菌30min；
其中上述的初次培养和再次培养中无激素MS培养基中的MS最好采用如下的MS：
硝酸钾：2000mg/L、硝酸铵：1600mg/L；磷酸二氢钾：180mg/L；硫酸镁：380mg/L；氯化钙：420mg/L；碘化钾：0.9mg/L；硼酸：6.2mg/L；硫酸锰：25mg/L；硫酸锌：10mg/L；钼酸钠：0.2mg/L；硫酸铜：0.04mg/L；氯化钴：0.02mg/L；乙二胺四乙酸二钠：39mg/L；硫酸亚铁：29mg/L；肌醇：90mg/L；甘氨酸：3.0mg/L；盐酸硫胺素：0.1mg/L；盐酸吡哆醇：1.0mg/L；烟酸：0.5mg/L。
上述再次培养的温度设置为24℃，每天的光照时间为14h，光照强度为2000-4000lux，黑暗处存放10h，培养5d后胚会从白色转绿色，再培养至10d后能看见二片子叶，经过培养至20d后能看见真叶，经过培养30d后能成为正常的带有根、茎、叶和芽的七子花小苗。
采用本实施例的繁育方法，进行同步繁育20颗，成活率达到100％。
比较例1
为了更好的说明本发明的七子花繁育技术经过种子初次培养的优异性，本比较例通过对比进行具体实施。
采摘并筛先出成熟的，颜色呈金黄色、形状饱满且用手指揉捏上去硬度较好的七子花果实；
在超净工作台上进行操作，将选取的七子花果实放入清洁容器中，加入无菌水，然后加入2-3滴的洗洁精，轻轻摇晃1min，倒掉水；再重复上述过程清洗三次，加入0.1％的升汞溶液浸泡5min，倒掉升汞溶液后，再用无菌水清洗三次。
然后，取用经过75％乙醇溶液消毒的镊子和手术刀，用手术刀和镊子配合把七子花的果皮去除，取出其中的种子，再把种子的种皮割开，切除全部种皮，用经过消毒的手术刀和镊子配合切开种子，从种子小头向大头方向，纵向切开五分之四左右，再用镊子顺着切口左右拉开，然后用手术刀尖轻轻挑出胚(去除胚乳)接种到无激素的MS培养基内进行再次培养，培养的温度设置为24℃，每天的光照时间为14h，光照的强度为2000-4000lux,黑暗处存放10h，培养二个月。
本比较例中的无激素的MS培养基配方如下：
MS：4.8g/L，蔗糖：20g/L，琼脂：6.5g/L，并调节该培养基的体系pH为6.0；
其中的MS配方如下：
硝酸钾：1900mg/L；硝酸铵：1650mg/L；磷酸二氢钾：170mg/L；硫酸镁：370mg/L；氯化钙：440mg/L；碘化钾：0.83mg/L；硼酸：6.2mg/L；硫酸锰：22.3mg/L；硫酸锌：8.6mg/L；钼酸钠：0.25mg/L；硫酸铜：0.025mg/L；氯化钴：0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠：37.3mg/L；硫酸亚铁：27.8mg/L；肌醇：100mg/L；甘氨酸：2.0mg/L；盐酸硫胺素：0.1mg/L；盐酸吡哆醇：0.5mg/L；烟酸：0.5mg/L；
采用本比较例的繁育方法，进行同步繁育20颗，发现有成活的幼苗4颗，成活率20％。
比较例2
为了更好的说明本发明的七子花繁育技术中去除胚乳的优异性，本比较例通过对比进行具体实施。
采摘并筛先出成熟的，颜色呈金黄色、形状饱满且用手指揉捏上去硬度较好的七子花果实；
在超净工作台上进行操作，将选取的七子花果实放入清洁容器中，加入无菌水，然后加入2-3滴的洗洁精，轻轻摇晃1min，倒掉水；再重复上述过程清洗三次，加入0.1％的升汞溶液浸泡5min，倒掉升汞溶液后，再用无菌水清洗三次。
然后，取用经过75％乙醇溶液消毒的镊子和手术刀，用手术刀和镊子配合把七子花的果皮去除，取出其中的种子，再把种子的种皮割开，切除全部种皮，横向切除二分之一的胚乳，然后把剩下的含有胚的种子接入到MS培养基里进行培养，上述接种时将去种皮后的种子尖头的部分向下插入到上述MS培养基上，插入整粒种子的三分之一左右，使种子的粗的大头部分朝上；上述的MS培养基在121℃下，高温灭菌30min，种子尖的部分向下插入培养基，种子粗的大头部分朝上，插入整粒种子三分之一左右。
本比较例中采用如下的MS培养基：
硝酸钾：1900mg/L；硝酸铵：1650mg/L；磷酸二氢钾：170mg/L；硫酸镁：370mg/L；氯化钙：440mg/L；碘化钾：0.83mg/L；硼酸：6.2mg/L；硫酸锰：22.3mg/L；硫酸锌：8.6mg/L；钼酸钠：0.25mg/L；硫酸铜：0.025mg/L；氯化钴：0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠：37.3mg/L；硫酸亚铁：27.8mg/L；肌醇：100mg/L；甘氨酸：2.0mg/L；盐酸硫胺素：0.1mg/L；盐酸吡哆醇：0.5mg/L；烟酸：0.5mg/L；并调节该培养基的体系pH为6.0；
培养的温度设置为24℃，且使每天的光照时间14h，光照的强度为2000-4000lux,黑暗处培养10h，在组培室里进行培养，整个培养的时间为二个月。
采用本比较例的繁育方法，进行同步繁育20颗，没有发现有成活的幼苗，成活率0。
比较例3
为了更好的说明本发明的七子花繁育技术中去除胚乳的优异性，本比较例通过对比进行具体实施。
采摘并筛先出成熟的，颜色呈金黄色、形状饱满且用手指揉捏上去硬度较好的七子花果实；
在超净工作台上进行操作，将选取的七子花果实放入清洁容器中，加入无菌水，然后加入2-3滴的洗洁精，轻轻摇晃1min，倒掉水；再重复上述过程清洗三次，加入0.1％的升汞溶液浸泡5min，倒掉升汞溶液后，再用无菌水清洗三次。
然后，取用经过75％乙醇溶液消毒的镊子和手术刀，用手术刀和镊子配合把七子花的果皮去除，取出其中的种子，再把种子的种皮割开，切除全部种皮，纵向切除二分之一的胚乳，然后把剩下的含有胚的一半种子接入到MS培养基里进行培养，上述接种时将去种皮后的种子尖头的部分向下插入到上述MS培养基上，插入整粒种子的三分之一左右，使种子的粗的大头部分朝上；上述的MS培养基在121℃下，高温灭菌30min，种子尖的部分向下插入MS培养基，种子粗的大头部分朝上，插入整粒种子三分之一左右。
本比较例中采用如下的MS培养基：
硝酸钾：1900mg/L；硝酸铵：1650mg/L；磷酸二氢钾：170mg/L；硫酸镁：370mg/L；氯化钙：440mg/L；碘化钾：0.83mg/L；硼酸：6.2mg/L；硫酸锰：22.3mg/L；硫酸锌：8.6mg/L；钼酸钠：0.25mg/L；硫酸铜：0.025mg/L；氯化钴：0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠：37.3mg/L；硫酸亚铁：27.8mg/L；肌醇：100mg/L；甘氨酸：2.0mg/L；盐酸硫胺素：0.1mg/L；盐酸吡哆醇：0.5mg/L；烟酸：0.5mg/L；并调节该培养基的体系pH为6.0；
培养的温度设置为24℃，且使每天的光照时间14h，光照的强度为2000-4000lux,黑暗处培养10h，在组培室里进行培养，整个培养的时间为二个月。
采用本比较例的繁育方法，进行同步繁育20瓶(每瓶1颗)，没有发现有成活的幼苗，成活率0。
比较例4
为了更好的说明本发明的七子花繁育技术在无激素MS培养基中的成活率优异性，本比较例通过对比进行具体实施。
采摘并筛先出成熟的，颜色呈金黄色、形状饱满且用手指揉捏上去硬度较好的七子花果实；
在超净工作台上进行操作，将选取的七子花果实放入清洁容器中，加入无菌水，然后加入2-3滴的洗洁精，轻轻摇晃1min，倒掉水；再重复上述过程清洗三次，加入0.1％的升汞溶液浸泡5min，倒掉升汞溶液后，再用无菌水清洗三次。
然后，取用经过75％乙醇溶液消毒的镊子和手术刀，用手术刀和镊子配合把七子花的果皮去除，取出其中的种子，再把种子的种皮割开，切除全部种皮，然后把干净的种子接入到含有不同生长素(NAA)浓度的MS培养基里进行初次培养，上述接种时将去种皮后的种子尖头的部分向下插入到上述无激素培养基上，插入整粒种子的三分之一左右，使种子的粗的大头部分朝上；上述的含有不同生长素(NAA)浓度MS培养基在121℃下，高温灭菌30min，种子尖的部分向下插入培养基，种子粗的大头部分朝上，插入整粒种子三分之一左右。
初次培养的温度设置为24℃，且使每天的光照时间14h，光照的强度为2000-4000lux,黑暗处培养10h，整个初次培养的培养时间为10天。
将经过上述初次培养后无污染的种子取出，用经过消毒的手术刀和镊子配合切开种子，从种子小头向大头方向，纵向切开五分之四左右，再用镊子顺着切口左右拉开，然后用手术刀尖轻轻挑出胚(去除胚乳)接种到含有不同生长素(NAA)浓度MS培养基内进行再次培养，上述再次培养的温度设置为24℃，每天的光照时间为14h，光照的强度为2000-4000lux,黑暗处存放10h，放在组培室里进行培养二个月。
上述的初次培养和再次培养中采用的含有不同生长素(NAA)浓度的MS培养基采用相同的体系，其中MS培养基如下：
MS：4.5g/L，蔗糖：25g/L，琼脂：7.0g/L，并调节该培养基的体系pH为6.5；
本比较例中最好采用如下的MS：
硝酸钾：1950mg/L；硝酸铵：1700mg/L；磷酸二氢钾：160mg/L；硫酸镁：360mg/L；氯化钙：460mg/L、碘化钾：0.8mg/L；硼酸：6.5mg/L；硫酸锰：22mg/L；硫酸锌：8mg/L；钼酸钠：0.3mg/L；硫酸铜：0.02mg/L；氯化钴：0.03mg/L、乙二胺四乙酸二钠：38mg/L；硫酸亚铁：27mg/L；肌醇：110mg/L；甘氨酸：1.0mg/L；盐酸硫胺素：0.3mg/L；盐酸吡哆醇：0.8mg/L；烟酸：0.8mg/L；
具体针对不同生长素浓度含量的实施具体分成以下五组不含浓度的生长素分别进行实施，每组中各接种20瓶(每瓶1颗)进行繁育，统计萌发的成苗数：
第一组：NAA浓度为0；
第二组：NAA浓度为0.1mg/L；
第三组：NAA浓度为0.3mg/L；
第四组：NAA浓度为0.6mg/L；
第五组：NAA浓度为1.0mg/L；
采用上述的繁育方法，在不同生长素浓度的MS培养基中培养，其中第一组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均成活，成活数量为20颗，成活率达100％；
其中第二组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均没有成活，成活数量为0颗；
其中第三组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均没有成活，成活数量为0颗；
其中第四组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均没有成活，成活数量为0颗；
其中第五组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均没有成活，成活数量为0颗。
比较例5
为了更好的说明本发明的七子花繁育技术在无激素MS培养基中的成活率优异性，本比较例通过对比进行具体实施。采摘并筛先出成熟的，颜色呈金黄色、形状饱满且用手指揉捏上去硬度较好的七子花果实；
在超净工作台上进行操作，将选取的七子花果实放入清洁容器中，加入无菌水，然后加入2-3滴的洗洁精，轻轻摇晃1min，倒掉水；再重复上述过程清洗三次，加入0.1％的升汞溶液浸泡5min，倒掉升汞溶液后，再用无菌水清洗三次。
然后，取用经过75％乙醇溶液消毒的镊子和手术刀，用手术刀和镊子配合把七子花的果皮去除，取出其中的种子，再把种子的种皮割开，切除全部种皮，然后把干净的种子接入到含有不同细胞分裂素(6-BA)浓度的MS培养基里进行初次培养，上述接种时将去种皮后的种子尖头的部分向下插入到上述含有不同细胞分裂素(6-BA)的MS培养基上，插入整粒种子的三分之一左右，使种子的粗的大头部分朝上；上述的含有不同细胞分裂素(6-BA)浓度MS培养基在121℃下，高温灭菌30min，种子尖的部分向下插入培养基，种子粗的大头部分朝上，插入整粒种子三分之一左右。
初次培养的温度设置为24℃，光照的强度为2000-4000lux,且使每天的光照时间14h，黑暗处培养10h，整个初次培养的培养时间为10天。
将经过上述初次培养后无污染的种子取出，用经过消毒的手术刀和镊子配合切开种子，从种子小头向大头方向，纵向切开五分之四左右，再用镊子顺着切口左右拉开，然后用手术刀尖轻轻挑出胚(去除胚乳)接种到含有不同细胞分裂素(6-BA)浓度MS培养基内进行再次培养，上述再次培养的温度设置为24℃，每天的光照时间为14h，光照的强度为2000-4000lux,黑暗处存放10h，在组培室里培养二个月。
上述的初次培养和再次培养中采用的含有不同细胞分裂素(6-BA)浓度的MS培养基采用相同的体系：其中MS培养基如下：
MS：4.5g/L，蔗糖：25g/L，琼脂：7.0g/L，并调节该培养基的体系pH为6.5；
本比较例中最好采用如下的MS：
硝酸钾：1950mg/L；硝酸铵：1700mg/L；磷酸二氢钾：160mg/L；硫酸镁：360mg/L；氯化钙：460mg/L、碘化钾：0.8mg/L；硼酸：6.5mg/L；硫酸锰：22mg/L；硫酸锌：8mg/L；钼酸钠：0.3mg/L；硫酸铜：0.02mg/L；氯化钴：0.03mg/L、乙二胺四乙酸二钠：38mg/L；硫酸亚铁：27mg/L；肌醇：110mg/L；甘氨酸：1.0mg/L；盐酸硫胺素：0.3mg/L；盐酸吡哆醇：0.8mg/L；烟酸：0.8mg/L。
具体针对不同生长素浓度含量的实施具体分成以下五组不含浓度的生长素分别进行实施，每组中各接种20瓶(每瓶1颗)进行繁育，统计萌发的成苗数：
第一组：6-BA浓度为0；
第二组：6-BA浓度为0.5mg/L；
第三组：6-BA浓度为1.0mg/L；
第四组：6-BA浓度为1.5mg/L；
第五组：6-BA浓度为2.0mg/L；
采用上述的繁育方法，在不同6-BA浓度的MS培养基中培养，其中第一组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均成活，成活数量为20颗，成活率达100％；
其中第二组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均没有成活，成活数量为0颗；
其中第三组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均没有成活，成活数量为0颗；
其中第四组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均没有成活，成活数量为0颗；
其中第五组的20瓶(每瓶1颗)中的七子花种子均没有成活，成活数量为0颗。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (4)
1.一种利用七子花种子胚的繁育方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A、筛选：采摘筛选出成熟、外形饱满的七子花果实，将筛选的七子花果实进行清洗消毒处理；
B、将经过消毒处理后的七子花果实去除外果皮，取出种子，再将种子进行清洗灭菌处理后，全部切除种皮，取出去皮后干净的种子；
C、将去皮后干净的种子接种到无激素MS培养基并控制温度在20℃～30℃进行初次培养，所述初次培养的光照时间为每天光照时间12～14小时；培养时间为10～13天；
D、再将初次培养后无污染的种子进行切开，取出胚接种到无激素MS培养基中进行再次培养至生长成幼苗；所述再次培养温度控制在20℃～30℃，所述再次培养的光照时间为每天光照时间12～14小时；培养时间为30～35天；
上述步骤C和步骤D中所述无激素MS培养基各自独立的包括以下成分的质量浓度：
MS：4.5～5.0g/L；蔗糖：20～25g/L；琼脂：6～7g/L；
且所述无激素MS培养基体系的pH值调节为6.0～6.5。
2.根据权利要求1所述利用七子花种子胚的繁育方法，其特征在于，步骤D中将种子进行切开具体为：
取经过初次培养后无污染的种子，用经过消毒后的手术刀沿种子纵向且从种子小头向大头方向切开五分之四，再用镊子顺着切口左右拉开，用手术刀切除胚乳，取出相应的胚接种到无激素MS培养基。
3.根据权利要求1所述利用七子花种子胚的繁育方法，其特征在于，步骤C中所述初次培养中将整粒种子的大头部分朝上接种到无激素MS培养基中，且插入整粒种子的三分之一。
4.根据权利要求1所述利用七子花种子胚的繁育方法，其特征在于，步骤B中所述洗清灭菌处理具体为：将种子加入无菌水，再加入几滴洗洁精，清洗结束后，再加入0.1％的升汞溶液进行浸泡处理，完成清洗消毒。
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