CN111543319A - 一种油梨未成熟胚的体外拯救方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种拯救油梨未成熟胚的方法，该方法包括：收集未成熟的油梨杂交果实，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；根据合子胚的成熟度，选择不同的培养基中促使合子胚的成熟；油梨种胚发芽后，在光照条件下长成正常的植株。本发明提供了一种油梨未成熟胚的体外培养拯救技术，当处于不同发育阶段的合子胚在体外条件下诱导成熟，成熟后诱导种胚萌发，形成健康植株的技术。本发明的技术可有效提高杂交油梨合子胚的成活率，提高油梨杂交成功率，拯救杂交后代，减少了杂交后代丢失，保证杂交群体的遗传完整性，为油梨杂交育种和遗传研究等提供关键技术。

Description

一种油梨未成熟胚的体外拯救方法
技术领域
本发明涉及一种经济果树育种领域，具体地涉及一种油梨未成熟胚的体外拯救方法。
背景技术
油梨杂交育种是创造遗传变异、改良遗传特性，培育优良植物新品种的主要技术。通过油梨的种间杂交，可以将同一物种内的两个或多个优良性状集中在一个新品种中。另外，种间杂交还可以产生杂种优势，获得比亲本品种更强或表现更好的新品种。
然而，油梨幼果具有很高的脱落率。利用杂交方法进行杂交，杂交的果实会大量落果，能正常在树上发育的很少，导致油梨杂交培育材料巨大丢失，这也是油梨杂交育种中存在的重大难题。本发明就这一难题进行了研究，提出一种解决脱落的杂交油梨果实合子胚拯救成熟的方法，从而有效提高杂交油梨合子胚的成活率，提高油梨杂交成功率，拯救杂交后代，减少了杂交后代丢失，保证杂交群体的遗传完整性，为油梨杂交育种和遗传研究等提供关键技术。
发明内容
针对现在技术中存在的问题，本发明提供一种利用未成熟胚进行体外培养，从脱落的油梨果实中培养出成熟的油梨种子胚胎的方法。拯救后的油梨种子可以发芽并生长成正常的杂交油梨植株。
在本发明中，“种胚”、“合子胚”、“胚体”均是指本发明的方法所拯救的核心对象，在本发明的语境下，这些术语可以互换。在不同的具体语境下，采用不同的术语。
本发明的拯救未成熟的油梨种胚方法使用到的培养基包括：
(1)基础培养基
基础培养基是种胚萌发的基础营养液，由大量元素、微量元素、铁盐、有机成分组成；
(2)萌发培养基
萌发培养基是种胚萌发的营养液，由基础培养基+6-苄胺基嘌呤(6-BA)+琼脂粉+蔗糖组成；
(3)陪护培养基
对于成熟度低于80％的油梨种胚，由于成熟度低，因此需要采用陪护培养基进行人工促进种胚的生长；陪护培养基由全强度或半强度的基础培养基+酪蛋白水解物或谷氨酸+琼脂粉+蔗糖组成。
如图1所示，本发明的方法包括以下步骤：
(1)外植体前处理
收集未成熟的油梨落果，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；
根据实践经验，判断合子胚的成熟度；对于胚成熟度为80％-100％的合子胚，直接萌发培养；对于成熟度为80％以下的合子胚，则先进行陪护培养至80-100％的成熟度，然后再进行萌发培养；
(2)根据配方配制基础培养基、陪护培养基和萌发培养基；
其中，基础培养基的配方为：
Figure BDA0002460700230000021
Figure BDA0002460700230000031
陪护培养基的配方a、b、c、d、e和f的配方如下：
a.半强度的基础培养基
300～500mg/L酪蛋白水解物
8～12％椰子水
8～12％蔗糖
1～3g/L琼脂粉；以及
b.半强度的基础培养基
300～500mg/L谷氨酰胺
8～12％椰子水
8～12％蔗糖
1-3g/L琼脂粉
c.半强度的基础培养基
300-500mg/L酪蛋白水解物
8-12％椰子水
4-6％蔗糖
2-4g/L琼脂粉；以及
d.半强度的基础培养基
300-500mg/L谷氨酰胺
8-12％椰子水
4-6％蔗糖
2-4g/L琼脂粉；
e.基础培养基
300-500mg/L酪蛋白水解物
8-12％椰子水
2-4％蔗糖
4-6g/L琼脂粉；以及
f.基础培养基
300-500mg/L谷氨酰胺
8-12％椰子水
2-4％蔗糖
4-6g/L琼脂粉；
分别根据陪护培养基a、b、c、d、e和f的配方，将椰子水以外的各个成分加到容器中，搅拌，然后将各个培养基的pH调节至5.5-6.5，将培养基进行灭菌、冷却处理后，将过滤并灭菌后的椰子水加入冷却的灭菌培养基中，得到陪护培养基a、b、c、d、e和f；
萌发培养基的配方为：
基础培养基
2.0-4.0μM 6-苄胺基嘌呤(6-BA)
4-8g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖；
(3)初始陪护培养基的选择
根据不同的合子胚的成熟度选择相应的陪护培养基的配方；
对于授粉后100天内的种胚，选择陪护培养基a或b中的任意一种作为初始陪护培养基；
对于授粉后100天至200天的种胚，选择陪护培养基c或d中的任意一种作为初始陪护培养基；
对于授粉后200天之后的种胚，选择陪护培养基e或f中的一种作为初始陪护培养基。另外，对于授粉后200天之后的种胚，是比较成熟的种胚，也可以采用萌发培养基直接进行萌发培养；
(4)合子胚的陪护培养以及陪护培养基的选择和更换
在合子胚的前心形期，采用陪护培养基a或b进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“初级陪护培养”)；当将合子胚培养到鱼雷期时，更换为陪护培养基c或d进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“一级陪护培养”)；在合子胚培养至成熟期时更换为陪护培养基e或f进行陪护培养(这个时间的陪护培养也可以称为“陪护培养”)。
将合子胚培养至成熟期的时间设定在10周内，在这10周内，无论是合子胚属于哪个成熟度，10周内基本都能通过陪护培养而培养至成熟期。随着合子胚成熟度的提高，需要不断更换陪护培养基。一般地，在针对某个成熟度的合子胚采用相应的陪护培养基进行培养，随着成熟度的提高，每隔3-4周后更换用于更高成熟度的陪护培养基。例如，在前心形采用陪护培养基a进行陪护培养，经过3-4周后，合子胚发展到了鱼雷期，此时，将陪护培养基更换为陪护培养基c进行进一步的陪护培养。
经陪护培养，合子胚已发展到成熟期，然后进行萌发培养；
未成熟合子胚的陪护培养在黑暗条件下进行。
(5)萌发培养
将上面陪护培养得到的种胚放入萌发培养基中，在25℃±1℃进行萌发培养，以维持合子胚的生长；在萌发培养期间进行光照培养，直至培养成正常生根小苗。在萌发期间，通过在陪护培养基上部分去除子叶诱导胚胎发芽；在15周期间进行发芽，大约每隔3周更换萌发培养基。
根据本发明的方法，在步骤(1)中，对落果表面和种子进行灭菌处理。
根据本发明的方法，所述灭菌处理包括：采用0.5v/v％次氯酸钠溶液中浸泡，然后在无菌蒸馏水中漂洗三次；优选地，所述0.5v/v％次氯酸钠溶液还含有10滴/L的吐温20。
根据本发明的方法，在步骤(2)中，所述萌发培养基的配方为：
基础培养基
2.22μM 6-BA
6g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖；
其中，所述基础培养基的配方为：
Figure BDA0002460700230000061
根据本发明的方法，在步骤(2)中，陪护培养基a、b、c、d、e、f的配方如下：
a.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉；以及
b.半强度的基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉
c.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；以及
d.半强度的基础培养基培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；
e.基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉；以及
f.基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉。
在根据发明方法的步骤(3)中，对于授粉后100天内的种胚，若选择初始陪护培养效果不佳或发育不好的，则在将种子剥去种皮、消毒后，采用前培养基使种子在25℃±1℃的温度下维持生长，在维持生长期间进行16小时的光照射(如图2所示)，待种子恢复正常生长时，按照上述步骤继续未成熟胚的拯救；
其中，前培养基的配方为：
半强度的基础培养基
2.0-2.5μM 6-苄胺基嘌呤
4-8g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖。
在本发明的方法的步骤(3)中，采用酸将培养基的pH调节至5.74。优选地，所述酸试剂为盐酸。
在本发明的方法的步骤(3)中，所述灭菌的条件为：在121℃和0.1MPa下高压灭菌15-20分钟。
在本发明的方法的步骤(5)中，所述光照培养的条件为：通过Grolux灯管照射；优选地，照射强度为40mmol.m-2.s-1。
对于胚成熟度为80-100％之间的合子胚，一般无需拯救种胚，可以将成熟度为80-100％的种胚直接放入萌发培养基中进行萌发培养。
本发明提供了一种油梨未成熟胚的体外培养拯救技术，当处于不同发育阶段的合子胚在体外条件下诱导成熟，成熟后诱导胚萌发，形成健康植株的技术。本发明的技术可以提高杂交油梨种子的回收率，减少杂交成果的浪费。
附图说明
图1是本发明方法的一种实施方式的流程示意图；
图2是本发明方法的另一种实施方式的流程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明。
本发明提供了一种油梨未成熟胚的拯救方法，所述方法包括的如下步骤：
(1)外植体的前处理
生理落果、其他脱落以及需要胚拯救的材料，最好选择落果或落实48小时内，进行胚拯救，有助于提高拯救的成功率。
收获后，通过放入含有10滴/L的吐温20的0.5％(v/v)次氯酸钠溶液中10分钟浸泡对果实进行表面灭菌，然后在无菌蒸馏水中漂洗三次。通过在落果和种胚进行消毒，可以保证种胚处于无菌状态，确保种胚拯救的成功率和结果的正确性。
在无菌条件下纵向切割灭菌的果实，取出种子，通过0.5％(v/v)次氯酸钠溶液中10分钟浸泡对果实进行表面灭菌，然后在无菌蒸馏水中漂洗三次。消毒后的种子，小心地剥离出未成熟的合子胚。
(2)胚基本成熟培养方法
根据实践经验，判断合子胚的成熟度。对于胚成熟度为80％-100％的合子胚，直接萌发培养。将胚成熟度为80％-100％的合子胚放入萌发培养基中进行萌发培养，根据油梨的发育状况和胚成熟度选择萌发培养基的强度；可根据油梨不同发育情况和胚成熟度选择培养基强度，如果成熟度低选择液体培养基，成熟度中等选择半固体培养基，同时根据胚发育情况，由液体培养基逐步变成半固体培养，最后为固体培养。
胚成熟度为80％以下的合子胚是需要拯救的对象。
选取胚成熟度为80％以下的合子胚，先进行陪护培养至80-100％的成熟度，然后再进行萌发培养。
陪护培养至萌发培养需要用到的培养基包括：(1)基础培养基、(2)萌发培养基和(3)陪护培养基。
下面介绍如上列举的三种培养基的配方以及配制方法。
萌发培养基的配方为：
基础培养基
2.22μM 6-BA
6g/L琼脂粉
3％蔗糖；
其中，基础培养基的配方为：
Figure BDA0002460700230000101
注：在上表中，铁盐在组织培养中首先将乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)和硫酸亚铁FeSO4·7H2O分别溶解后，在相互混合配制获得。
①根据不同的胚胎成熟选择陪护培养基
从油梨种子落果中选取120个授粉后100日内、授粉后100d-200d的和授粉后200d后的种胚，分别采用以下培养基进行培养：
陪护培养基a、b、c、d、e、f的配方以及选择原则如下。
对于授粉后100天内的种胚，选择陪护培养基a或b中的任意一种进行陪护培养。
a.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉；以及
b.半强度的基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉
对于授粉后100天至200天的种胚，选择陪护培养基c或d中的任意一种进行陪护培养。
c.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；以及
d.半强度的基础培养基培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；
对于授粉后200天以后的种胚，选择陪护培养基e或f中的任意一种进行陪护培养。
e.基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉；以及
f.基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉。
对120个种胚及其陪护培养基的配方的分配如下表1所示。
表1
Figure BDA0002460700230000121
(3)培养液的配制
将上述所有陪护培养基的pH用盐酸调节至5.5-6.5，将陪护培养基在121℃和0.1MPa下高压灭菌15-20分钟；将陪护培养基冷却处理后，将椰子水加入冷却、灭菌后的陪护培养基中；
(4)陪护培养基的选择和更换
在前心形期胚培养，选择a或b培养基，培养到鱼雷期后，选择c或d培养基，成熟期后选择e或f；
针对每个成熟度使用相应的陪护培养基的2-3周后，更换新培养基，或应根据种胚发育成熟情况更换针对下一个成熟度的陪护培养基，直至种胚成熟。
陪护培养，应在25℃±1℃的温度下，黑暗或弱光培养。
(5)萌发培养
陪护培养的种胚达到萌发时期时，将种胚放在萌发培养基培养。同时，通过在萌发培养基上部分去除子叶诱导胚胎发芽，间隔2-3周更换培养基。
萌发培养，在25℃±1℃的温度下维持生长。萌发培养在光照条件下进行，在萌发培养期间进行16小时的光周期培养。具体操作为：通过Grolux灯管照射，照射强度40mmol.m-2.s-1，在白天的太阳光源下，1KLux＝18μmol.m-2.s-1，促进植株的生长，直至培养成正常生根小苗。
表2油梨种胚拯救结果汇总
Figure BDA0002460700230000131
由表2可知，对于成熟度较低的种胚(例如，授粉后100日内的种胚)，其拯救的成功率低于成熟度高的种胚。对于成熟度较高的、授粉后200日后的种胚，拯救成功率可达95％以上，实现了大部分种胚的拯救和回收。
通过本发明的方法，可以挽救油梨杂交培育过程脱落的果实，实现油梨脱落种子的回收和有效利用，减少杂交成果的丢失。本发明的技术可有效提高杂交油梨合子胚的成活率，提高油梨杂交成功率，拯救杂交后代，减少了杂交后代丢失，保证杂交群体的遗传完整性，为油梨杂交育种和遗传研究等提供关键技术。

Claims (9)

1.一种拯救油梨未成熟胚的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)外植体前处理
收集未成熟的油梨落果，从消毒后的果实中剥离出未成熟的合子胚；选取成熟度为80％以下的合子胚，陪护培养至80-100％的成熟度，然后再进行萌发培养；
(2)根据配方配制基础培养基、陪护培养基和萌发培养基
其中，基础培养基的配方为：
Figure FDA0002460700220000011
Figure FDA0002460700220000021
陪护培养基a、b、c、d、e和f的配方如下：
a.半强度的基础培养基
300～500mg/L酪蛋白水解物
8～12％椰子水
8～12％蔗糖
1～3g/L琼脂粉；以及
b.半强度的基础培养基
300～500mg/L谷氨酰胺
8～12％椰子水
8～12％蔗糖
1-3g/L琼脂粉
c.半强度的基础培养基
300-500mg/L酪蛋白水解物
8-12％椰子水
4-6％蔗糖
2-4g/L琼脂粉；以及
d.半强度的基础培养基
300-500mg/L谷氨酰胺
8-12％椰子水
4-6％蔗糖
2-4g/L琼脂粉；
e.基础培养基
300-500mg/L酪蛋白水解物
8-12％椰子水
2-4％蔗糖
4-6g/L琼脂粉；以及
f.基础培养基
300-500mg/L谷氨酰胺
8-12％椰子水
2-4％蔗糖
4-6g/L琼脂粉；
分别将椰子水以外的各个成分加到容器中，搅拌，然后将各个培养基的pH调节至5.5-6.5，将培养基进行灭菌、冷却处理后，将过滤并灭菌后的椰子水加入冷却的灭菌培养基中，得到陪护培养基a、b、c、d、e和f；
萌发培养基的配方为：
基础培养基
2.0-4.0μM 6-苄胺基嘌呤
4-8g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖；
(3)初始陪护培养基的选择
根据不同的合子胚的成熟度选择相应的陪护培养基的配方；
对于授粉后100天内的种胚，选择陪护培养基a或b中的任意一种作为初始陪护培养基；
对于授粉后100天至200天的种胚，选择陪护培养基c或d中的任意一种作为初始陪护培养基；
对于授粉后200天之后的种胚，选择陪护培养基e或f中的一种作为初始陪护培养基；
(4)合子胚的陪护培养以及陪护培养基的选择和更换
在合子胚的前心形期，采用陪护培养基a或b进行陪护培养；当将合子胚培养到鱼雷期时，采用陪护培养基c或d进行陪护培养；在合子胚培养至成熟期时采用陪护培养基e或f进行陪护培养；
合子胚经陪护培养至成熟期后，采用萌发培养基进行萌发培养；
陪护培养在黑暗条件下进行；
(5)萌发培养
将陪护培养得到的种胚放入萌发培养基中，在25℃±1℃进行萌发培养；在萌发培养期间进行光照培养，直至培养成正常生根小苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，对落果表面和种子进行灭菌处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述灭菌处理包括：采用0.5v/v％次氯酸钠溶液中浸泡，然后在无菌蒸馏水中漂洗三次；优选地，所述0.5v/v％次氯酸钠溶液还含有10滴/L的吐温20。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述萌发培养基的配方为：
基础培养基
2.22μM 6-BA
6g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖；
其中，所述基础培养基的配方为：
Figure FDA0002460700220000041
Figure FDA0002460700220000051
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，陪护培养基a、b、c、d、e、f的配方如下：
a.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉；以及
b.半强度的基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
10％蔗糖
2g/L琼脂粉
c.半强度的基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；以及
d.半强度的基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
5％蔗糖
3g/L琼脂粉；
e.基础培养基
400mg/L酪蛋白水解物
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉；以及
f.基础培养基
400mg/L谷氨酰胺
10％椰子水
3％蔗糖
5g/L琼脂粉。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，对于授粉后100天内的种胚，若选择初始陪护培养效果不佳或发育不好的，则在将种子剥去种皮、消毒后，采用前培养基使种子在25℃±1℃的温度下维持生长，在维持生长期间进行16小时的光照射，待种子恢复正常生长后，继续未成熟胚的拯救；
其中，前培养基的配方为：
半强度的基础培养基
2.0-2.5μM 6-苄胺基嘌呤
4-8g/L琼脂粉
2.5-3.5％蔗糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，采用酸试剂将培养基的pH调节至5.74；优选地，所述酸试剂为盐酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述灭菌的条件为：在121℃和0.1MPa下高压灭菌15-20分钟。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述光周期培养的条件为：通过Grolux灯管照射，保证植株生长；优选地，照射强度为40mmol.m-2.s-1。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021213152A1 (zh) * 2020-04-21 2021-10-28 中国热带农业科学院海口实验站 一种油梨未成熟胚的体外拯救方法
CN113854151A (zh) * 2021-10-29 2021-12-31 中国热带农业科学院海口实验站 一种油梨组织培养与快速繁殖的方法
CN114073224A (zh) * 2021-09-30 2022-02-22 中国热带农业科学院海口实验站 一种油梨水培方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104025959A (zh) * 2014-05-14 2014-09-10 广西南亚热带农业科学研究所 一种提高油梨繁殖系数的方法
CN106688376A (zh) * 2017-02-09 2017-05-24 中国热带农业科学院海口实验站 一种牛油果种苗的培养方法
CN107410024A (zh) * 2017-05-16 2017-12-01 仲恺农业工程学院 一种油梨愈伤组织的诱导方法以及促进其芽分化的方法
CN108308030A (zh) * 2018-04-04 2018-07-24 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 一种促进油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2134133B1 (es) * 1997-04-04 2000-04-16 Inia Metodo para la micropropagacion de aguacate (persea americana mill.) adulto.
CN111543319B (zh) * 2020-04-21 2021-07-30 中国热带农业科学院海口实验站 一种油梨未成熟胚的体外拯救方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104025959A (zh) * 2014-05-14 2014-09-10 广西南亚热带农业科学研究所 一种提高油梨繁殖系数的方法
CN106688376A (zh) * 2017-02-09 2017-05-24 中国热带农业科学院海口实验站 一种牛油果种苗的培养方法
CN107410024A (zh) * 2017-05-16 2017-12-01 仲恺农业工程学院 一种油梨愈伤组织的诱导方法以及促进其芽分化的方法
CN108308030A (zh) * 2018-04-04 2018-07-24 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 一种促进油梨茎段诱导愈伤组织及无菌芽的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIMON H. T. RAHARJO等: "Micrografting and ex vitro grafting for somatic embryo rescue and plant recovery in avocado (Persea americana)", 《PLANT CELL,TISSUE AND ORGAN CULTURE》 *
罗小燕等: "油梨组织培养研究进展", 《热带作物学报》 *
葛宇等: "油梨研究进展", 《中国南方果树》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021213152A1 (zh) * 2020-04-21 2021-10-28 中国热带农业科学院海口实验站 一种油梨未成熟胚的体外拯救方法
US11490577B2 (en) 2020-04-21 2022-11-08 Haikou Experimental Station, Chinese Academy Of Tropical Agricultral Sciences In vitro rescue method for immature embryo of avocado
CN114073224A (zh) * 2021-09-30 2022-02-22 中国热带农业科学院海口实验站 一种油梨水培方法
CN114073224B (zh) * 2021-09-30 2022-09-23 中国热带农业科学院海口实验站 一种油梨水培方法
CN113854151A (zh) * 2021-10-29 2021-12-31 中国热带农业科学院海口实验站 一种油梨组织培养与快速繁殖的方法
CN113854151B (zh) * 2021-10-29 2022-05-31 中国热带农业科学院海口实验站 一种油梨组织培养与快速繁殖的方法

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