JPS6174520A - コーンの再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明はコーン再生の一般的方法および該方法によって
生産された植物に関する。さらに詳しくは、本発明は多
くのコーンの品種からコーン苗木を再生するために組織
および細胞培養を使用することに関する。

先行技術の説明 培養細胞からの植物再生は、体細胞ハイブリッド形成の
適用、体細胞クローン変異による新品種の生産および新
品種生産における遺伝子工学の使用のために必須である
。数種のコーンの品種の組織培養から植物を再生できる
が、同様な技術を使って再生を行えない品種も多数ある
。

近年、植物細胞培養の成功が、植物の成長および発育の
調節における細胞および生物の各役４割に重大な影響を
もたらしている。この概念は、分離した植物細胞がｉｎ
　ｖｉｔｒｏで培養し易いということが証明され、完全
な植物が体細胞胚形成を通じて直接的に、または器官形
成を通じて間接的に体細胞組織由来の培養から再生でき
た時に支持された。一般に、再生経路の選択は外的因子
、特に成長調節因子の操作によ゛り経験的に決められる
。ある植物種の初期の研究は、外因性オーキシン濃度が
体細胞胚形成を調節する主要素であり、その減少が胚形
成の開始を誘導することを示唆している。

他の種では、一定のバランスのオーキシンおよびサイト
カイニンへの暴露が器官形成の発生（苗条（ｓｈｏｏす
、欠いで根）を誘導する。いくつかのコーンの遺伝子型
はこれらの技術を使って再生したが、大部分のコーンの
遺伝子型に一般的に適用できる方法はない。多数の遺伝
子型においては、従来の方法を用いて培養することはた
とえ不可能でなくても依然として非常に困難である。

コーン組、織培養の標準方法になった方法がグリーンら
（こよってクロップ・サイエンス（Ｇｒｅｅｎｅｔ　ａ
ｌ、、Ｃｒｏｐ　５ｃｉｅｎｃｅ）ｌ旦、４１？（１９
７５）に記載されている。この方法では、ＭＳ無機塩、
シュドラウス（Ｓｔｒａｕｓ）ビタミンおよびアミノ酸
（グリシン、アスパラギン、ナイアシン、チアミン、ピ
リドキシンおよびパントテン酸）、２係シユークロース
、０．８％寒天および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
（２，４−Ｄ　）、Ｐ−クロロフェノキシ酢酸（ＰＣＡ
）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ　）、２−イソペンチ
ルアデニン（２−ｉｐ）、またはそ゛の混合物から選択
されたホルモンからなるカルス誘導培地で未成熟胚を平
板培養している。濃度を減らしたホルモンを含有する培
地でカルスを継代培養して苗木を再生している。有用な
ホルモン濃度は、２　’Ｐ／　ｌ　２．４−　Ｄ、　オ
ヨび１　’９／ｌ！２．４−Ｄ、４　ｒｑ　／　／　Ｎ
　Ａ　Ａとｏ、ｏ　５ｍｙ７ｔ：　２−　ｉｐの混合物
である。ついで、０．２５■／ｌ　２．４−Ｄ、または
１ｑ／ＶＮＡＡと０．０５η／ｌ　２−　ｉｐの混合物
を含む培地でそれぞれ再生を行なっている。

移植前に３〜４週間の期間、明所において１６時間、暗
所において８時間のサイクルで全ての培養を行なってい
る。試験した５つの遺伝子型の１つでカルス誘導が生じ
なかったとこの参考文献は報告している。

同じ結果が他にも報告されている。フリーリンら グはメイデイ力（Ｆｒｅｃｌ　ｉｎｇ　ｅｔ　、ａｌ　
、　、Ｍａｙｄｉｃａ。

△ 且１，９７（１９７６））において、２または５ダ／ｌ
の２．４−Ｄ、２％のシュークロスを含みミオイノシト
ールを含まない１Ｍ培地を一連のカルス誘導に用い、０
〜０．１■／ｌの２．４−Ｄを含む同培地を次の再生に
用いることによってコーンの再生を行っている。ベイシ
ルらはセオレティヵル・アンド・アプライド・ジエネテ
ィックス（Ｖａｓｉｌ　ｅｔａｌ、、Ｔｈｅｏｒ、Ａｐ
ｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、）、’６６．２８５（１９８３）に
おいて、３〜１２％のシュークロースおよび０゜２ｓ　
〜ｚ、ｏｍｑ７！！ｃｖ２，４−Ｄを含有するＭＳ培地
を用いて３週間培養してカルス形成および苗条形成を行
っている。高シュークロース濃度は胚形成カルスに最も
都合がよい。（ａ）　１　”Ｐ／　／ジベレリン酸（Ｇ
Ａ３）含または不含の、３チシユークロースを含有する
ＭＳ培地または（ｂ）２％シュークロース含有”ｄＭｓ
培地へ移植した後、根形成を行っている。

エタロらハｌ　イｆ　イｆＪ　（Ｅｄａｌｌｏ　ｅｔ　
ａｌ　、　、Ｍａｙ　−ｄｉｃａ）、２６．３９（１９
８１）において、２ｍ９／ｌの２．４−Ｄを含有する前
記のグリーンらの培地を使ってコーンの未成熟胚からカ
ルス誘導を行っている。３０日の移植により該培養を同
一培地で維持している。２．４−Ｄを含有しない培地を
用いて再生を行っている。根形成のため、　５　’ｑ　
、４ｆ：　Ｎ　Ａ　Ａの１間重層を有する培地へ苗条を
移植している。該苗木を土壌へ移植する前に、２０チ、
１０チ最後に０％のシュークロースを含有する培地に順
に移している。２．４−Ｄを用いた同様な一連のカルス
誘導培地を使ったコーンの再生および２．４−Ｄを用い
ないかまたは低濃度で用いた再生が、ルーらのセオレテ
イカル・アンド・アプライド・ジエネテイツクス（Ｌｕ
　Ｃｃ　ａｌ、、ＴｈｅＯｒ、Ａｐｐｌ、Ｃｙｅｎｅｔ
、）。

旦旦、１（１５）（１９８２）、ヒラバートらのプロシ
ーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテエツド・ステ
ィソ・オブ・アメリカ（Ｈｉｂｂｅｒｄ　ｅｔ　ａｌ、
。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ）、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、Ｕ　Ｓ　Ａ
）、　７９　、５５９　（１９８２）、ゲーゲンハツハ
らの（Ｇｅｇｅｎｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、）、同書、Ｌ
土、５１１３（１９７７）およびグリーンらのクロップ
・サイエフ　ス（Ｇｒｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ　、、Ｃｒｏ
ｐ　５ｃ−ｉｅｎｃｅ）、１４．５４（１９７４）に示
されている。後者の参考文献には、遺伝子型がカルス誘
導に影響を及ぼすことも示されている。

先行文献は、組織および細胞培養による大部分のコーン
（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）の遺伝子型の再生方法を記載して
いない。従来方法では再生できないか、ま１０５、Ｂ３
７、Ｂ８４、Ｂ１４、Ｍｏ　ｌ　７およびに１６８が含
まれる。本発明は、コーン栽培品種を高頻度、高成長率
で再生するための広く一般的に適用できる方法の最初の
例である。

コーン植物および種子はこの方法で生産される。

この方法から得られるコーン植物は、体細胞クロ・−ン
変異の結果、出発材料の植物と異なることもある。該経
路は、さらに変異を与えるために種々の選択した方法を
使用できるという点でも有用である。生産した植物は通
常の育種計画に使用できる。

発明の要約 本発明の方法は、誘導培地でコーン植物の組織からカル
ス形成を誘導し、カルスを維持し、再生培地で苗条およ
び根を形成し、所望により成熟培地で苗木を成熟させる
段階からなることを特徴とする。

さらに詳しくは、本発明の方法は、 （ａ）カルス形成を確実にするのに十分な量の無機塩、
ビタミン、シュークロースおよびホルモンを含む第１培
地で　７−７　植物から得られた組織を培養し、 （ｂ）カルス維持を確実にするのに十分な借の無機塩、
ビタミン、シュークロースおよびホルモンを含む第２培
地でカルスを継代培養し、 （Ｃ）苗条形成および板形成を確実にするのに十分な量
の無機塩、ビタミン、シュークロースおよびホルモンを
含む第３培地でカルスを継代培養し、（ｄ）所望により
、それによって植物が得られるようにさらに根を形成さ
せることを包含する苗木の成熟を確実にするの；こ十分
な量の無機塩、ビタミン、シュークロースおよびホルモ
ンを含む第４培地で該苗条を継代培養する。

段階からなることを特徴とする。

該組織の源は、好ましくは、ジイーア・メイズ（Ｚｅａ
　ｍａｙｓ）の品種からの未成熱圧である。該培地は、
好ましくは、Ｎ５無機塩および修正ＭＳビタミンを含む
。好ましいホルモンは、第１、第２および第３培地では
３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸（ジカンバ（
ｄｉｃａｍｂａ））または３−アミ／−２，５−’；ク
ロロ安息香酸（クロランベン（ｃｈｌｏｒａｍｂｅｎ）
）であり、第４培地ではジヵンハ、クロランベン、ある
いはジヵンバまたはクロランベンのいずれかと２．４−
Ｄの混合物である。

発明の詳細 な説明は、細胞または組織培養を使って、コーン（Ｚｅ
ａ　ｍａｙりを再生する方法に関する。この方法では、
土壌中に移して成長させ成熟させることのできるコーン
の苗木が得られる。本発明は、また、この方法によって
得られるコーン植物およびこれらの植物から得られる譚
子に関する。

一般に該方法は、（ａ）培地で　コ　−　ン　植物組織
を培養してカルスを生産し、（ｂ）培地でカルスを培養
してカルスを維持し、（Ｃ）培地でカルスを培養して苗
条および根を生成させ、（ｄ）所望１こより、培地で根
を有する苗条を培養して移植するための苗木を成熟させ
ることからなる。苗木は、発育したら土壌中で生育でき
る。

カルスの発生に使用する植物組織には未成熱圧が好まし
い。該未成熱圧は、受粉後およそ１０日回流胚が１．５
〜２．０順の長さになった時、穂軸から取り出す。該穂
軸を収穫し、表面滅菌する。それぞれの穀粒から未成熱
圧を取り出す。胚軸が培地と接触するように、すなわち
圧盤側が上になるように、以下、第１培地と称するカル
ス誘導培地で接圧を平板培養する。

第１培地は無機塩、ビタミンおよびシュークロースを含
む。該無機塩は多量元素および微量元素からなる。第１
培地に使用する多量元素としては次の化合物、硫酸マグ
ネシウム、塩化カルシウム、リン酸−カリウム、硝酸カ
リウムおよび硫酸アンモニウムがあげられる。第１培地
に含有される微量元素にはホウ酸、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ヨウ化カリウム、硫酸鉄（■〕、エチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）ニナトリウム塩、モリブデン酸α
リナトリウム、硫酸銅（ＩＩ）および塩比コバルトがあ
る。無機塩のこの組合せは、銅、コバルトおよびモリブ
デンの無機塩を含有させた修正Ｎ６無機塩として公知で
ある。カルス誘導に悪影響をおよぼさない限り、他の組
合せの無機塩も使用できる。無機塩の組合せ例にはＭ５
、ヘラ−（Ｈｅｌｌｅす、ニラチェ（ＮｉｔｓｃＪおよ
びニラチェ、Ｂ５およびホワイ１−（Ｗｈｉｔｅ）　　
が含まれるが、それらに限定されない。

１１の第１培地を調製するために使用する多量元素ａよ
ひ微■元素の好ましい量は次のとおりである。硫酸マグ
ネシウム７永和物１８５ｒｎｓ’、塩山カルシウム２水
和物１６６■、リン酸−カリウム４（１６）　”？、　
硝酸カリウム２８３０７Ｗ、硫酸アンモニウム４６３■
、ホウ酸１．６ｍ９、硫酸マンガン１水和物３．３　ｍ
Ｖ、硫酸亜鉛７水和物１．５　ｍＶ、ヨウ（ヒカリウム
０．８３”ＳＪ、硫酸鉄（■）７永和物２７．８ｍ？、
ＥＤＴＡニナトリウム塩３７，３η、モリブデン酸（Ｖ
Ｉ）−１−トリウム２水和物０．２５ｍ？、硫酸銅（■
）５水和物０．０２５ｍ？、および塩化コバルト６水和
物０．０２５ｒＩＴ９゜ 第１培地はビタミンも含有する。使用するビタミン番こ
はミオイノシトール、ニコチン酸、クリ’／ン、ピリド
キシン、チアミンおよびパントテン酸塩がある。これら
のビタミンは、パントテン酸塩を含有させた修正ＭＳビ
タミンとして公知である。

ＩＪの第１培地を調製するために使用するビタミンの量
は次のとおりである。ミオイノシトール１（１６）”Ｓ
’、ニコチン酸０．５ｍ’？、グリシ７２　ｍ’ｉ、ピ
リドキシン塩酸塩０．５　ｍＶおよびチアミン塩酸劇、
１ｍ２およびパントテン酸カルシウムｏ、ｚ５ｍ？。

第１培地は３〜１２％、好ましくは９条のシュークロー
スおよび寒天またはゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）（商
標、カリホルニア州すンディエゴ、ピー・オー・ボック
ス２３０７６、ケルコ・コマーシャル・ディベロップメ
ント（Ｋｅｌｃｏ　Ｃｏｒｒｍｅｒｃｉａｌ　Ｄｅ　−
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｐ、０＋Ｂｏｘ　２３０７６、Ｓ
ａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ１ｉ　−ｆｏｒｎｉａ）のよう
なゲル化剤を含有する。ゲルライトを０．１８％の濃度
で使用するのが好ましい。該培地は５，５〜６．０のｐ
Ｈ１好ましくは５．８のｐＨを有する。

前記成分に加えて、第１培地はホルモンも含有する。本
明細書で使用しているよう番こ、ホルモンは植物または
植物組織に対して調節作用を有するいずれもの天然また
は合成比合物を意味する。植物ホルモンにはオーキシン
類およびサイトカイニン類がある。本発明のカルス誘導
に有用なホルモンにはジカンバまたはクロランベンがあ
ることが判明している。存在するホルモンの量はカルス
形成を確実にするのに十分であればよい。一般に５〜１
５μＭで十分であり、好ましくは１０μＭである。第１
培地；こはホルモンとしては１０μＭクロランベンを使
用するのが好ましい。ビタミン、およびジカンバまたは
クロランベン以外の全成分をオートクレーブにかけて培
地を滅菌する。ビタミン、およびジカンバまたはクロラ
ンベンはオートクレーブにかけた培地に加える前にミク
ロポー第１培地で該禿、熱圧を平板培養し、１日当り１
６時間の光同期を有する散光下で２〜４週間、好ましく
は２〜３週間培養する。この期間に接圧は脱分化し、カ
ルスを形成する。未成熱圧を第１培地で培養した後、該
カルスを以下に第２培地と称する維持培地に移植し継代
培養する。散光下４〜８週間第２培地で該カルスを継代
培養する。所望ならば該カルスをさらに長期間第２培地
で維持できる。２〜４週間後、該カルスを新しい第２培
地に移植する。形成した根はいずれもカルスの移植のた
びに除去する。

第２培地は、カルスを維持するのに十分な量のｍｉ塩、
ビタミン、シュークロースおよびホルモンを含む。無機
塩およびビタミンは第１培地で記載したものと同じであ
る。第１培地の場合と同様１こ、培地の機能に悪影響を
及ぼさない種々の組合せの無機塩を使用することができ
る。シュークロース濃度は３〜６％、好ましくは３％で
ある。ホルモンはジカンバ、好ましくはクロランベンで
あり、５〜１０μＭ、好ましくは５μＭの量を使用する
。ゲルライトを培地に加えて培地を固（ヒさせる。０．
１８％の濃度で十分である。培地は５．５〜６．０のｐ
Ｈ，好ましくは５．８のｐＨを有する。前記と同様にし
て培地を滅菌する。

維持するためのシュークロース濃度を所望のレベルまで
直ちにまたは段階的に低下させることができる。例えば
、９％シュークロース含有第１培地から３チシユークロ
ース含有第２培地ヘカルスを移植することができる。ざ
らに、まず６％シュークロース含有第２培地に移植して
２〜４週間培養し、ついで３チシユークロース含有第２
培地へ移植することもできる。

組織の成長速度を落すために第２培地にアブシ゛ジン酸
（ＡＢ　Ａ　）を加えることが望ましい場合もある。こ
れはカルスを長期間維持するのに好ましい。ＡＢＡを使
用する時は０．１〜２．０μＭ、好ましくは０．１〜１
．０μＭを使用する。

カルスを第２培地で培養した後、以下に第３培地と称す
る再生培地に移植し継代培養し、散光下で培養する。第
３培地は第１培地と同じ無機塩およびビタミンを含有す
る。第１培地の場合と同様に、培地の機能に悪影響を及
ぼさない種々の組合せの無機塩を使用することができる
。さらに、この培地はホルモンを含有し苗条形成を確実
にする。

ジカンバ、クロランベン、あるいはジカンノイまたはク
ロランベンのいずれかと２．４−Ｄの混合物は、いずれ
も苗条および根形成に有用であることが判明した。根形
成を促進するために２．４−Ｄを加えてもよい。一般に
０〜５μＭ、好ましくは１μＭのジカンバまたはクロラ
ンベン単独または０〜０゜１μＭの２．４−Ｄとの組合
せを使用する。いずれかのホルモンが存在する場合、ク
ロランベンを使用するのが好ましい。

第３培地は３〜６チ、好ましくは３％のシュークロース
および第１培地と同量のゲル化剤を含有し、同じｐＨを
有することが好ましい。この培地も前記と同様にオート
クレーブおよびメンブランフィルタ−で滅菌する。

第３培地での植物再生能を増強するためには。

カルスを第３培地に移植する前に、まず、維持したカル
スをより高シュークロース濃度を含有する新しい第２培
地に１〜２週間移植するのが望ましい、。例えば、カル
スを３％シュークロースを含有する第２培地で維持して
いる場合、該カルスを第３培地へ移植する前にまず６％
シュークロースを含有する新しい第２培地へ移植しても
よい。

いったん苗条および根が形成したら、土壌に移植でき、
所望により、以下に第４培地と称する成熟培地へ移植し
て散光下で培養できる。第４培地は１〜３％、好ましく
は２％シュークロースを含有する以外第３培地と同じで
ある。この培地にはホルモンを使用しない万が好ましい
。ホルモンを存在させる場合には、０〜１．０μＭジカ
ンバまたはクロランベンを０〜０．１μＭ２．４−Ｄと
ともにまたは単独で使用するのがよい。

根が形成したら、該苗木を土壌へ移植する準備をする。

十分発育した根を有する苗条を試験管から取り出し、ゲ
ルライトを洗い流す。該植物を鉢植え土壌２部、バーミ
キュライト１部からなる土壌へ移植゛し、高湿度室で湿
度を維持した。ついで該植物をより大きなポットへ移植
する。

この方法は多くのコーンの栽培品種の組織から苗条を再
生するのに有用である。該方法は従来方法ではうまく植
物を再生できなかった品種から苗木を再生するのに特に
有用である。これらの品種の例にはＢ７３、Ａ６３２、
Ｃ：Ｍ２Ｏ３，Ｂ３７、Ｂ８４、Ｂ１４．ＭＯ１７、Ｒ
１６８が含まれる。

これらの品種に加えて、本発明の方法は、また、従来技
術によって以前に再生された品種を再生するのにも有用
である。これらの品種の例にはＭＳ７１、Ａ１８８、Ｐ
Ａ９１、Ａ６４１．　Ｗｌ　１７が含まれる。

種々のコーンの品種を再生するための従来方法にともな
う主たる問題点はカルス形成を誘導できないということ
であった。一般にコーン組織からカルスを誘導できれば
、ついで該カルスを処理して植物を再生できる。したが
って、カルス形成誘導能はいくつかのコーンの品種の再
生を制限する段階である。本発明はカルス形、酸誘導お
よび植物再生の方法を開示するものである。該植物再生
方法は、カルス組織を形成じたことがある全てのコーン
の品種に適用できる。それ故、以下の実施例においては
、コーンの一品種（Ｂ７３）で一般的方法を示す。残り
の品種についてはカルス誘導だけを記載する。各品種の
カルスはＢ７３からのカルスと同じ一般的外観を有した
。それ故、本明細書で以下に記載した方法によって、こ
れらの品種のそれぞれから植物を得ることができる。

実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、これらに限定されるものではない。

これらの実施例において、特に断らない限り、明所での
培養は１日当たり１６時間の光同期を有する散光下、２
５℃での培養をいう。特に断らない限り、８時間の暗期
の間の温度は２５℃である。

実施例１ 溶液の調製 久の貯蔵液または溶液を以下にざらに詳記する培地作成
時に使用するために調製した。

１、無機塩 Ａ、リン酸−カリウム ２（１６）Ｘ貯蔵液は、８ｙのリン酸−カリウムを１（
１６）Ｒ１！の蒸留脱イオン水に溶解することにより調
製した。該貯蔵液を冷蔵庫に保管した。

Ｂ、残りの無機塩 １０Ｘ貯蔵液は、７．４０．７の硫酸マグネシウム７水
和物、６．６４ｇの塩化カルシウム２水和物、１ｔ３．
２．Ｖの硝酸カリウム、１８．５：ｌの硫酸アンモニウ
ム、６４ｍ１のホウ酸、１３２ｎｙｉの硫酸マンガン１
永和物、６０ｍ７の硫酸亜鉛７水和物、３３．２ηのヨ
ウ化カリウム、１０■のモリブデン酸（Ｖリナｌ−ＩＪ
ウム２水和物、１６０〜の硫酸銅（■）５水和物および
１．０キの塩（ヒコバルト６水和物を３６（１６）ｍ１
の蒸留脱イオン水に溶解することにより調製した。１．
１１２／の硫酸鉄（■）７永和物および１．４９２Ｌ！
のＥＤＴＡニナトリウム塩を各々２（１６）αｅの蒸留
脱イオン水に加熱して溶解し、ついでゆっくり撹拌しな
がら混合した。ついで、この混合物を残りの塩に加えた
。該塩貯蔵液を１（１６）ｒｔｔｅづつに分け、使用す
るまで凍結した。

２、ビタミン ビタミンの１（１６）Ｘ貯蔵溶液は、１０ｙのミオイノ
シトール、５０ｒｎｇのニコチン酸、２（１６）’？０
）グリシン、５０■のピリドキシン塩酸塩、１（１６）
■のチアミン塩酸塩および２５〜のパントテン酸カルシ
ウムをＬｏｏｍ／！の蒸留脱イオン水に溶解スることに
より調製し、ついでそれを蒸留脱イオン水で１０倍に希
釈して貯蔵液を調製した。１（１６）ｄづつを使用する
まで遮光した瓶中で凍結した。

３、ホルモン Ａ、ジカンバＡ。

１　’ｊｕｔｅ貯蔵液は、ベルシコールケミカルズ（Ｖ
ｅｌｓｉｃｏｌ　Ｃ：ｈｅｍｉｃａｌｓ）’から入手シ
タジカンハ０．２１ｍ／を蒸留脱イオン水で１（１６）
ｍ／に希釈すること１こより調製した。この溶液を冷蔵
庫に保管した。

Ｂ、２．４−Ｄ Ｑ、５ｍＭ貯蔵液は、１１．０５”ＩＰの２．４−Ｄヲ
０、５　＝　１．　Ｏｔｈｅのｌ、Ｑ　Ｎ　ＫＯＨｌこ
溶解し、蒸留脱イオン水で１（１６）１ｇに希釈するこ
とにより調製した。ｌ、ＱＮＨＣ：／でｐＨを５．８に
調整し、該溶液を冷蔵庫に保管した。

Ｃ，クロランベン ０．５５ｍＭ貯蔵液は、１０．３０”Ｓ’のクロランヘ
ンを用いて２．４−Ｄについて記載したようにして調製
した。

Ｄ、ジカンバＢ。

０．５５ｍＭ貯蔵液は、１１．０５”９のジカンバを用
いて２．４−Ｄについて記載したようにして調製した。

実施例２ 培地の調製 １、第１培地またはカルス誘導培地 第１培地は、４０ｙのシュークロースおよび１（１６）
ｒＩｔｅのＩＯＸ無機塩貯蔵液を８（１６）ｒｒｔｅの
蒸留脱イオン水へ加えることにより調製した。ついで、
５ＩＩＬｅの２（１６）Ｘ！Ｊン酸−カリウム貯蔵液を
加え、蒸留脱イオン水で容量をＩＩ！にした。ｌ、　Ｑ
　Ｎ　ＫＯＨでｐＨを５．９５に調整した。ｐＨを高め
（こ調整してオートクレーブの間に通常生じる約０．１
５の低下を補正した。１．８ｇのゲルライトを加え、該
混合物を１５　ｐｓｉで１５分間オートクレーブにかけ
た。１０ＩＩＬｅの１（１６）Ｘビタミン貯蔵液および
ＺｒｒｔｅのジカンパＡ貯蔵液＠０．２μゲルマンフィ
ルターで濾過して滅菌し、ついで冷却培地へ加え、つい
でペトリ皿または試験管へ注いだ。

適当量の貯蔵液を使用して異なる濃度のジカンバを含有
する第１培地を調製した。例えば、３ｍｇのジカンバ貯
蔵液を使用して３ｍＶｌジカンバ含有第１培地を調製し
た。１０μＭを所望する場合は、ついで２０ｒｎｌのジ
カンバＢ貯蔵液を使用する。

適当量のクロランベン貯蔵液を使用してクロランヘン含
有第１培地を調製した。例えば、２０ｎＪのクロランベ
ン貯蔵液を使用して１０μＭクロランベン含宵第１培地
を調製した。

２、第２培地または維持培地 第゛２培地は、１ｒｔｔｅのジカンバＡ貯蔵液を使用す
る以外は第１培地について記載したようにして調製した
。前記のよう（こして異なる濃度のジカンバを含有する
第２培地を調製した。前記と同方法でクロランベン含有
第２培地を調製した。

３、第３培地または再生培地 （ａ）　０．１　ｍｌ；のジカンバ貯蔵液を使用し、（
ｂ）　２（１６）　Ｘリン酸−カリウム貯蔵液を加えて
から、０．２　ｒｒｔｌの２．４−Ｄ貯蔵液を使用する
以外第１培地について記載したようにして調製した。適
当量の貯蔵液を前記のように加えて、異なる濃度のホル
モン類、あるいはジカンバ、クロランベンまたはジカン
バとクロランベンの混合物のみを含有する第３培地を調
製した。

４、第４培地または成熟培地 第４培地は、（ａ）　２０　ｙのシュークロースおよび
（１））　０．１　ｒｒｔｅのジカンバ貯蔵液を使用す
る以外第１培地について記載したよう番こして調製した
。前記と同様にして、異なる濃度のジカンバ、またはク
ロランベンを含有する第４培地を調製した。第３培地と
同じ方法で、２．４−Ｄを配合したジカンバまたはクロ
ランベン含有第４培地を調製した。

実施例３ コーン再生 受粉後１０〜１１日目に穂回流１．５朋の長さにナツタ
時：ｌ−′ン（Ｚｅａ　ｍａｙＳＬ、Ｂ７３）の穂軸か
ら未成熱圧を取り出した。該穂軸を刈り取り、３０係ク
ロロツクス（カリホルニア州オークランド、りｏｏツタ
スカンパ＝　−（Ｃ１ｏｒｏｘ　、（：ｌ　ｏｒｏｘ　
Ｃｏｍ−ｐａｎｙ　、０ａｋｌ　ａｎｄ　、Ｃａｌ　ｉ
　Ｅｏｒｎｉａ）、漂白剤（１，６％久亜塩素酸ナトリ
ウム））およびリクイノックスにューヨーク州ニューヨ
ーク、ブロードウェイ８５３、アルコノックス・インコ
ーホレイティラド（Ｌｉｑｕｉｎｏｘ、Ａｌｃｏｎｏｘ
　Ｉｎｃ１８５３　Ｂｒｏａｄｗａｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、）洗浄剤１〜２滴／　２（
１６）　ｒｔｔｌ含有溶液で１５分間表面殺菌した。該
穂軸を滅菌脱イオン水で４回洗浄した。メスで各種子頂
部を細切し、内胚乳をかき取って未成熱圧を分離した。

ついて該未成熱圧を取り出し、胚軸が培地に接触するよ
う、すなわち圧盤が上になるようにしてペトリ皿に入れ
た第１培地で平板培養した。２’ｆＶｌシカンハを用い
、前の実施例に記載したようにして第１培地を調製した
。該ペトリ皿を明所に置き、４週間培養した。

この期間に、ＩＶでジカンバを用いて前記のように調製
し、またペトリ皿に入れた第２培地へ各カルスを移植し
た。３週間後に新しい培地へ移植して明所で６週間カル
スをこの培地で培養した。

各移植時に、形成した根をいずれも各カルスから取り除
いた。

ついで各カルスを第３培地に移植した。第３培地は、０
．１ｍＶｌジカンハオヨび０．１．ｕＭ２，４−Ｄを用
いて、実施例２で記載したようにして調製した。該カル
スをこの培地で明所で５日間培養した。

カルスは脱分化し苗条および根を形成した。

ついで根を有する苗条を培養試験管中に入れた第４培地
に移植した。第４培地は０．１　”Ｖｌジカンバを用い
て前記のよう（こ調製した。根を有する苗条を明所で１
〜２週間培養し、ざらに根を形成させた。

該苗木を温室内の土壌（こ移植した。十分に発育した根
を有する苗条を試験管から取り出し、水道水でゲルライ
トを完全に洗い流した。２部の鉢植え土壌と１部のバー
ミキュライトを含む植木箱に該苗木を植えた。植木箱を
高湿度室に置き、５日間風度を維持した。ついで室のふ
たを取り除いた。

ざらに３日後、該植物を１２インチポットへ移植した。

１週間に２〜３回該回動植物をやり、２週間毎に肥料を
施した。

実施例４ カルス誘導 仄の　コーン　の品種、ンイー了・メイズ・ｘル（Ｚｅ
ａ　ｒｎａｙｓ　Ｌ、）Ａ５３２、Ａ６１９、ＣＭ／１
０５、Ｂ３７、Ｂ３４、Ｂ１４．Ｍ０１７、λ１６８、
ＭＳ７１、Ａ６４１およびＷ１１７から取り出した未成
熱圧を、シュークロース濃度が３％または９％のいずれ
かである以外実施例３に記載したのと同じ第１培地で平
板培養した。それぞれの品種について、実施例３のカル
スと同等かそれより良好な一般的外観を有するカルスを
得た。それぞれのカルスは第２培地へ移植できるように
なった。

実施例５ カルス誘導 実施例３に記載したように未成熱圧をジイーア・メイズ
、　ｘル（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ、）Ｂ７３およびＭＳ
７１から取り出した。１０μＭクロランベンおよび（ａ
）３％、（ｂ）６％、（Ｃ）９％あるいは（ｄ）１２％
シーＬ−クロースのいずれかを含有する第１培地で鎮圧
を平板培養した。３％シュークロース含有培地での８７
３Ｂ外は、それぞれの’Ｐｊにおいて実施例３のカルス
と同じ一般的外観を有するカルスを得た。

９％または１２％シュークロース含有第１培地はカルス
誘導）こ対して、より良好であることが判明した。それ
ぞれのカルスは第２培地へ移植できるようになった。

実施例６ カルス誘導 実施例３および４と同じコーン品種から、実施例３にお
いて記載したようにして、未成熱圧を取り出した。１０
μＭクロランベンおよび９％または３％シュークロース
のいずれかを含有する第１培地て鎮圧を平板培養した。

３％シュークロース含有培地での８７３以外は、それぞ
れの品種につイテ実施例３のカルスと同じ一般的外観を
有するカルスを得た。それぞれのカルスは第２培地へ移
植できるようになった。

以上２本発明をその具体例を用いて詳しく説明したが、
明らかなごとく７本発明の精神を逸脱しない範囲で種々
の修飾が可能であり、これらも本発明範囲のものである
。

時計出願人　サンジエン・テクノロジイズ・コーポレイ
ション

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）カルス形成を確実にするのに十分な量の無
   機塩、ビタミン、シュークロース、およびクロランベン
   （ｃｈｌｏｒａｍｂｅｎ）とジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ
   ）からなる群から選択されたホルモンを含む第１培地で
   コーン植物から得られた組織を培養し、 （ｂ）カルス維持を確実にするのに十分な量の無機塩、
   ビタミン、シュークロース、およびクロランベンとジカ
   ンバからなる群から選択されたホルモンを含む第２培地
   で該カルスを継代培養し、（ｃ）苗条および根の形成を
   確実にするのに十分な量の無機塩、ビタミン、シューク
   ロース、およびクロランベン、ジカンバ、クロランベン
   と２，４−Ｄの混合物およびジカンバと２，４−Ｄの混
   合物からなる群から選択されたホルモンを含む第３培地
   で該カルスを継代培養する。 段階からなることを特徴とする、細胞または組織からコ
   ーン苗木を再生する方法。
2. （２）該組織が未成熟胚から得られる前記第（１）項の
   方法。
3. （３）無機塩、ビタミン、シュークロース、およびクロ
   ランベン、ジカンバ、クロランベンと２，４−Ｄの混合
   物およびジカンバと２，４−Ｄの混合物からなる群から
   選択されたホルモンを含む第４培地で該苗条および根を
   継代培養する前記第（１）項または第（２）項の方法。
4. （４）第４培地中の該ホルモンの濃度が、０〜１．０μ
   Ｍクロランベンまたはジカンバまたは、０〜１．０μＭ
   クロランベンまたはジカンバと０〜０．１μＭ２，４−
   Ｄであり、第４培地中のシュークロースの濃度が１〜３
   ％である前記第（３）項の方法。
5. （５）第４培地中のクロランベン、ジカンバおよび２，
   ４−Ｄの濃度が０μＭであり、シュークロースの濃度が
   ２％である前記第（４）項の方法。
6. （６）第４培地中の該無機塩が、硫黄マグネシウム、塩
   化カルシウム、リン酸−カリウム、硝酸カリウム、硫酸
   アンモニウム、ホウ酸、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ヨウ
   化カリウム、硫酸鉄（II）、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、
   モリブデン酸（III）ナトリウム、硫酸銅（II）および
   塩化コバルトからなり、第４培地中の該ビタミンがミオ
   イノシトール、ニコチン酸、グリシン、ピリドキシン、
   チアミンおよびパントテン酸塩からなることを特徴とす
   る前記第（３）項、第（４）項または第（５）項の方法
   。
7. （７）無機塩が銅、コバルトおよびモリブデンを含有さ
   せた修正Ｎ６無機塩であり、該ビタミンがパントテン酸
   塩を含有させた修正ＭＳビタミンである前記第（６）項
   の方法。
8. （８）ホルモンの濃度が （ｉ）第１培地中５〜１５μＭクロランベンまたはジカ
   ンバであり、 （ｉｉ）第２培地中５〜１０μＭクロランベンまたはジ
   カンバであり、 （ｉｉｉ）第３培地中０〜５μＭクロランベンまたはジ
   カンバまたは、０〜５μＭクロランベンまたはジカンバ
   と０〜０．１μＭ２，４−Ｄである 前記第（１）項〜第（７）項いずれか（１）項の方法。
9. （９）クロランベン、ジカンバおよび２，４−Ｄの濃度
   が、 （ｉ）第１培地中１０μＭクロランベンまたはジカンバ
   であり、 （ｉｉ）第２培地中５μＭクロランベンまたはジカンバ
   であり、 （ｉｉｉ）第３培地中１μＭクロランベンまたはジカン
   バである 前記第（８）項の方法。
10. （１０）シュークロースの濃度が （ｉ）第１培地中３〜１２％であり、 （ｉｉ）第２および第３培地中３〜６％である前記第（
    １）項〜第（９）項いずれか１項の方法。
11. （１１）シュークロースの濃度が第１培地中で９％、第
    ２および第３培地中で３％である前記第（１０）項の方
    法。
12. （１２）第１、第２および第３培地中の該無機塩が硫酸
    マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸−カリウム、硝
    酸カリウム、硫酸アンモニウム、ホウ酸、硫酸マンガン
    、硫酸亜鉛、ヨウ化カリウム、硫酸鉄（II）、ＥＤＴＡ
    三ナトリウム塩、モリブデン三（III）ナトリウム、硫
    酸銅（II）、塩化コバルトからなる前記第（１）項〜第
    （１１）項いずれか１項の方法。
13. （１３）無機塩が銅、コバルトおよびモリブデンを含有
    させた修正Ｎ６無機塩である前記第（１２）項の方法。
14. （１４）第１、第２、第３および第４培地中の該ビタミ
    ンがミオイノシトール、ニコチン酸、グリシン、ピリド
    キシン、チアミンおよびパントテン酸塩からなることを
    特徴とする前記第（１）項〜第（１３）項いずれか１項
    の方法。
15. （１５）ビタミンがパントテン酸塩を含有する修正ＭＳ
    ビタミンである前記第（１４）項の方法。
16. （１６）前記第（１）項〜第（１５）項いずれか１項の
    方法によつて生産された植物。
17. （１７）前記第（１６）項の植物から生産された種子。