CN112931221B - 一种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法，这种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法这种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法能够以花生花药培养单倍体植株，为花生创建新种质资源，缩短育种年限，省时省工，提高育种效率，对花生的育种研究产生重大意义；本发明在花生花药培养方面取得突破性进展，首次在花生学科领域花生栽培种上获得单倍体植株，经根尖染色体鉴定，是第一例栽培种花生花药培养单倍体植株；本发明某一特定的花生品种，它本身的花粉植株的诱导率并不高，但是当它作为杂交亲本之一时，杂种一代的花粉愈伤组织的诱导率相当高，具有较强的花药培养力，有望作为花生花药培养的“桥梁品种”。

Description

一种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法。

背景技术

花药培养是二十世纪60年代以来发展起来的一项生物技术，旨在诱导出单倍体花粉植株。花药培养属于器官培养范畴，是把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，诱导小孢子由正常的配子体发育途径转向孢子体发育途径，而后通过愈伤组织或胚状体再生单倍体植株的过程。花药培养对于基础和育种研究都有重大意义，用杂种一代(F₁)的花药进行培养，育出的单倍体使染色体加倍，得到纯合的个体，易于鉴定和选择，省时省工，大大提高选种效率。利用花药培养产生单倍体植株的技术，已被广泛应用到28科68属170多种植物上，其中23科52属约300种高等植物的花药培养获得成功。花药培养技术在植物育种上具有缩短育种年限、提高育种效率、创建新种质资源等优点。

其中，花生是世界上重要的经济和油料作物。花生花药培养研究最早报道始于1981 年，Bajaj等用A.hypogaea和A.glabrata及A.villosa的单核后期的花药为外植体，经愈伤组织获得少量再生植株。国内花生花药培养研究始于二十世纪70年代初,但一直处于条件摸索和优化阶段，袁美等较系统地研究了基本培养基、基因型和蔗糖浓度等因素在花生花药愈伤组织诱导中的作用，以及几种激素组合在诱导愈伤组织及分化形成体胚中的作用；张景景等对不同发育时期的花药进行固体培养，对诱导愈伤和愈伤分化的培养基进行了筛选；然而，这两项研究均尚未获得花生的完整再生植株。

目前花生特异种质资源的匮乏成为其育种的瓶颈，因此种质的创新工作成为花生育种中亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法，这种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法能够以花生花药培养单倍体植株，为花生创建新种质资源，对花生的育种研究产生重大意义。采用的技术方案如下：

一种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤(1)、选取健康花生植株摘取未开放花蕾，剪除花蕾的萼片，将花药块从花蕾中挤压出来，剔除花瓣与花柱，获得花药块；

步骤(2)、愈伤组织诱导培养：将诱导培养基倒入广口玻璃瓶中，经高压湿热灭菌、冷凝后接入已经消毒灭菌处理的花药块，在温度为26±2℃的黑暗环境下培养，获得愈伤组织；

步骤(3)、愈伤组织分化培养：将分化培养基倒入广口玻璃瓶中，经高压湿热灭菌、冷凝后接入嫩绿色的愈伤组织，在温度为26±2℃、光照强度为2000lux、光照时间为8小时/天的条件下培养，获得幼芽；

步骤(4)、植株再生培养：将已分化出根、茎、叶的幼芽接入再生苗培养基，置于温度为 26±2℃、光照强度为2800lux、光照时间为10小时/天的条件下在培养箱中培养，获得再生植株；

步骤(5)、炼苗移栽：以汕油121为砧木、以再生植株为接穗，嫁接后采用薄膜封闭并保持高湿度管理后，再撤除薄膜炼苗，嫁接成活后将炼苗移植至田间，并搭建小拱棚覆盖薄膜保温栽培，获得花生单倍体植株。

通常，光照强度为2000lux是指光照强度为2000勒克斯；光照时间为8小时/天是指每天的光照时间为8小时。

作为本发明的优选方案，所述步骤(1)中摘取花蕾次日，花蕾先用自来水冲洗20min，在超净工作台上用浓度为75％的乙醇浸泡30s，接着放入浓度为1％的NaClO中消毒，设置处理时间，然后用无菌水冲洗5-6次，最后利用灭菌滤纸吸干花蕾表面的水分，以获得花药块。在选取健康花生植株应摘取未开放的淡绿色花蕾，花蕾规格为0.5cm-0.7cm，每个株系取3-5 个花蕾。上述浓度为1％的NaClO是由100ml消毒液加入1-2滴表面活性剂Twenn-20制成的。

作为本发明的优选方案，所述步骤(2)中的诱导培养基，使用之前需先往诱导培养基中添加浓度为30g/L的蔗糖与浓度为7g/L的琼脂，使诱导培养基的pH值保持在5.5-5.8。通常，上述广口玻璃瓶的直径为5cm。

作为本发明的优选方案，所述步骤(2)中诱导培养基包括B5D1培养基、B3D1培养基、B5N1培养基和B3N1培养基；B5D1培养基是由基础MS培养基添加浓度为5mg/L的6-BA 和浓度为1mg/L的2,4-D组成；B3D1培养基是由基础MS培养基添加浓度为3mg/L的6-BA 和浓度为1mg/L的2,4-D组成；B5N1培养基是由基础MS培养基添加浓度为5mg/L的6-BA 和浓度为0.1mg/L的NAA组成；B3N1培养基是由基础MS培养基添加浓度为3mg/L的6-BA 和浓度为0.1mg/L的NAA组成。

通常，上述基础MS培养基是由无机盐、NH₄NO₄ 1650mg/L、KNO₃ 1900mg/L、 CaCl₂·2H₂O 440mg/L、MgSO₄·7H₂O 370mg/L、KH₂PO₄ 170mg/L、KI 0.83mg/L、H₂BO₃ 6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、 CuSO₄·2H₂O0.025mg/L、CoCL₂·6H₂O 0.025mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、Na₂·EDTA·2H₂O 37.3mg/L；有机物、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、适量蔗糖与适量琼脂组成。

上述6-BA是指6-苄氨基嘌呤，其作用既可以促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。

上述2,4-D是指2,4-二氯苯氧乙酸，是一种生长素类似物，用作植物生长调节剂。

上述NAA是指萘乙酸，适用于谷类作物，增加分蘖，提高成穗率和千粒重。

上述步骤(2)中诱导培养基培养后，需统计花药的污染数、死亡数和愈伤组织数，其中的愈伤组织诱导率＝(产生愈伤组织花药数/接种花药数)×100％。

作为本发明的优选方案，所述步骤(3)中分化培养基，使用之前需先往分化培养基中添加浓度为30g/L的蔗糖与浓度为7g/L的琼脂，使分化培养基的pH值保持在5.5-5.8。

作为本发明的优选方案，所述步骤(3)中分化培养基包括B5N1-1培养基、B5N1-2培养基和B5N1-3培养基；B5N1-1培养基是由基础MS培养基添加浓度为5mg/L的6-BA、浓度为0.1mg/L的NAA、浓度为0.1mg/L的TDZ和浓度为0.1mg/L的AgNO₃组成；B5N1-2 培养基是由基础MS培养基添加浓度为5mg/L的6-BA、浓度为0.1mg/L的NAA、浓度为 0.2mg/L的TDZ和浓度为0.2mg/L的AgNO₃组成；B5N1-3培养基是由基础MS培养基添加浓度为5mg/L的6-BA、浓度为0.1mg/L的NAA、浓度为0.3mg/L的TDZ和浓度为0.3mg/L 的AgNO₃组成。

上述TDZ是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等；并且可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程。

上述步骤(3)中分化培养基培养后，需统计愈伤组织分化率，其中的愈伤组织分化率＝(能分化出幼芽的愈伤组织块数/转移愈伤组织块数)×100％。

作为本发明的优选方案，所述步骤(4)中再生苗培养基包括CM培养基和SG培养基，使用之前需先往CM培养基与SG培养基中分别添加浓度为20g/L的蔗糖与浓度为5.5g/L的琼脂，使CM培养基与SG培养基的pH值保持在5.5-5.8。

作为本发明进一步的优选方案，所述步骤(4)中CM培养基是由基础MS培养基添加浓度为3g/L的花宝1号、浓度为2g/L的蛋白胨、浓度为0.8g/L的活性炭、浓度为15g/L 的香蕉泥和浓度为50g/L的土豆泥组成。上述花宝1号是按以下3种离子配比而成： NO₃ ^-:P₂O₅ ^-:K₂O^-＝7:6:19。上述蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息，可作为微生物培养基的主要原料。

作为本发明进一步的优选方案，所述步骤(4)中SG培养基是由基础MS培养基添加浓度为3g/L的花宝2号、浓度为2g/L的蛋白胨、浓度为0.8g/L的活性炭和浓度为50g/L的土豆泥组成。上述花宝2号是按以下3种离子配比而成：NO₃ ^-:P₂O₅ ^-:K₂O^-＝20:20:20。

上述步骤(4)中幼芽的高为4cm-6cm，具有2-3节间。

上述步骤(4)中再生植株培养后，需记录再生苗的根数、再生苗的叶数与再生植株的数量。其中，再生苗率＝(再生苗数/接种已分化出幼芽的愈伤组织块数)×100％；

再生植株率＝(完整再生植株数/接种已分化出幼芽的愈伤组织块数)×100％。

上述步骤(5)中炼苗移栽的方法也可以为：将种植在玻璃瓶中的再生植株放入炼苗棚进行自然光照培养30d后，洗净晾干，再植入塑料杯中，在温度为28±2℃、75％遮荫自然光的条件下进行栽培。

作为本发明的优选方案，所述花生花药培养创制单倍体植株的培育方法还包括步骤 (6)、采用根尖染色体鉴定方法对花生单倍体植株进行染色体数目鉴定。

本发明对照现有技术的有益效果是：

(1)这种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法能够以花生花药培养单倍体植株，为花生创建新种质资源，缩短育种年限，省时省工，提高育种效率，对花生的育种研究产生重大意义。

(2)本发明在花生花药培养方面取得突破性进展，首次在花生学科领域花生栽培种上获得单倍体植株，经根尖染色体鉴定，是第一例栽培种花生花药培养单倍体植株。

(3)本发明某一特定的花生品种，它本身的花粉植株的诱导率并不高，但是当它作为杂交亲本之一时，杂种一代的花粉愈伤组织的诱导率相当高，具有较强的花药培养力，有望作为花生花药培养的“桥梁品种”。

(4)本发明利用花药培养单倍体植株构建成的DH群体，是遗传连锁图谱构建和进行 QTL定位等方面研究的理想群体，可以为花生基因定位和功能基因的发掘奠定物质基础，为花生研究与育种提供了新的思路和途径。

附图说明

图1是本发明实施例1中愈伤组织诱导培养的实物图；

图2是本发明实施例1中愈伤组织分化培养形成幼芽的实物图；

图3是本发明实施例1中SG培养基上的再生苗生长情况的实物图；

图4是本发明实施例1中CM培养基上的再生苗生长情况的实物图；

图5本发明实施例1中编号为15B8-8的再生植株的嫁接实物图；

图6是本发明实施例1中编号为15B8-8的再生植株的炼苗实物图；

图7是本发明实施例1中编号为15B8-8的再生植株田间移植的实物图；

图8是本发明实施例1中花生单倍体植株处于有丝分裂前期的倍性鉴定FISH检测图；

图9是本发明实施例1中花生单倍体植株处于有丝分裂中期的倍性鉴定FISH检测图。

具体实施方式

实施例1

本实施例中，这种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法包括下述步骤：

步骤(1)、2017年3月，在基地种植F₃株系50份，在花生育种基地种植F₁组合14份，共64份材料；2017年5月选取健康花生植株摘取未开放花蕾，剪除花蕾的萼片，将花药块从花蕾中挤压出来，剔除花瓣与花柱，获得花药块；摘取花蕾次日，花蕾先用自来水冲洗20min，在超净工作台上用浓度为75％的乙醇浸泡30s，接着放入浓度为1％的NaClO中消毒，设置处理时间，然后用无菌水冲洗5-6次，最后利用灭菌滤纸吸干花蕾表面的水分，以获得花药块。在选取健康花生植株应摘取未开放的淡绿色花蕾，花蕾规格为0.5cm-0.7cm，每个株系取3-5 个花蕾。上述浓度为1％的NaClO是由100ml消毒液加入1-2滴表面活性剂Twenn-20制成的。

供试材料明细见表1。

表1供试材料

注：F₁没有株系。

步骤(2)、愈伤组织诱导培养：设置4种诱导培养基，分别为B5D1培养基、B3D1 培养基、B5N1培养基与B3N1培养基(见表2)。使用之前需先往4种诱导培养基中分别添加浓度为30g/L的蔗糖与浓度为7g/L的琼脂，使诱导培养基的pH值保持在5.5-5.8。将4种诱导培养基分别倒入相应的广口玻璃瓶中，经高压湿热灭菌、冷凝后接入已经消毒灭菌处理的花药块，在温度为26±2℃的黑暗环境下培养20天，获得愈伤组织；在培养过程中，需统计花药块的污染数、死亡数和愈伤组织数，其中的愈伤组织诱导率＝(产生愈伤组织花药块数 /接种花药块数)×100％。

表2诱导培养基

步骤(3)、愈伤组织分化培养：设置3种分化培养基，分别为B5N1-1培养基、B5N1-2培养基与B5N1-3培养基(见表3)。使用之前需先往3种分化培养基中分别添加浓度为30g/L的蔗糖与浓度为7g/L的琼脂，使分化培养基的pH值保持在5.5-5.8。将3种分化培养基分别倒入相应的广口玻璃瓶中，经高压湿热灭菌、冷凝后接入嫩绿色的愈伤组织，在温度为26±2℃、光照强度为2000lux、光照时间为8小时/天的条件下培养30天，获得幼芽；在培养过程中，需统计愈伤组织分化率，其中的愈伤组织分化率＝(能分化出幼芽的愈伤组织块数/转移愈伤组织块数)×100％。

表3分化培养基

步骤(4)、植株再生培养：设置2种再生苗培养基，分别为CM培养基与SG培养基(见表 4)。使用之前需先往2种再生苗培养基中分别添加浓度为20g/L的蔗糖与浓度为5.5g/L的琼脂，使再生苗培养基的pH值保持在5.5-5.8。

将已分化出根、茎、叶的幼芽分别接入2种再生苗培养基，置于温度为26±2℃、光照强度为2800lux、光照时间为10小时/天的条件下在培养箱中培养15天，获得再生植株；在培养过程中，需记录再生苗的根数、再生苗的叶数与再生植株的数量。其中，再生苗率＝(再生苗数/接种已分化出幼芽的愈伤组织块数)×100％。上述幼芽的高为4cm-6cm，具有2-3节间。

表4再生苗培养基

上述花宝1号是按以下3种离子配比而成：NO₃ ^-:P₂O₅ ^-:K₂O^-＝7:6:19。

上述花宝2号是按以下3种离子配比而成：NO₃ ^-:P₂O₅ ^-:K₂O^-＝20:20:20。

步骤(5)、炼苗移栽：2020年10月，以汕油121为砧木、以编号为15B8-8的再生植株为接穗，嫁接后采用薄膜封闭并保持高湿度管理33天后，再撤除薄膜炼苗15天，嫁接成活后将炼苗移植至田间，并搭建小拱棚覆盖薄膜保温栽培，获得花生单倍体植株；

步骤(6)、2020年11月，采用根尖染色体鉴定方法对编号为15B8-8的花生单倍体植株进行染色体数目鉴定。

对上述实施例1中的步骤(1)-步骤(6)进行数据分析。

在步骤(1)中，花蕾经过浓度为1％的NaClO消毒处理获得花药块，将花药块培养20天后，花药块会出现三种情形：污染、死亡、诱导形成愈伤组织。花药块的消毒时间对花药块污染率、死亡率和愈伤诱导率的影响，见表5。

表5消毒时间对花药块污染率、死亡率和愈伤诱导率的影响

由表5可知，消毒时间为7min时，花药块的污染率最高(11.5％)；消毒时间为9min，花药块的污染率降低、诱导率最高；消毒时间为11min时，花药块的污染率最低、死亡率高、诱导率低。因此，花药块的消毒时间对愈伤组织诱导率有着较大影响，综合来看，采用浓度为1％的NaClO的消毒时间设置为9min，效果较好。

在步骤(2)中，采用B5D1培养基、B3D1培养基、B5N1培养基与B3N1培养基这 4种诱导培养基对愈伤组织诱导培养。如图1-2中，培养过程中，需统计愈伤组织数，其中的愈伤组织诱导率＝(产生愈伤组织花药块数/接种花药块数)×100％。这4种诱导培养基对愈伤组织诱导率的影响，见表6。

表6诱导培养基对愈伤组织诱导率的影响

由表6可知，B5N1培养基的愈伤组织诱导率为81.3％，B3N1培养基上的愈伤组织诱导率为 77.3％，B5N1培养基与B3N1培养基上的愈伤组织诱导率较高，因此B5N1培养基、B3N1 培养基比B5D1培养基、B3D1培养基更适合花生花药诱导培养。

在步骤(3)中，将B5N1-1培养基、B5N1-2培养基与B5N1-3培养基这3种分化培养基分别接入愈伤组织，培养30天后，统计愈伤组织分化率。这3种分化培养基对分化率的影响，见表7。

表7分化培养基对分化率的影响

由表7可知，B5N1-2培养基上的愈伤组织分化带幼芽组织数量较多，达到6个，分化率达 4.26％，叶片和根形态更为明显、完整，较为适合花生花药愈伤组织再分化培养。

在步骤(4)中，将已分化出幼芽的愈伤组织块分别接入CM培养基与SG培养基这2种再生培养基，培养20天后，少数能继续生根生叶，且根叶形态趋于正常，记录再生苗的根数、再生苗的叶数与再生植株的数量。这2种再生培养基对再生苗生长的影响，见表8。

表8再生培养基对再生苗生长的影响

由表8可知，CM培养基与SG培养基上的再生苗根数、叶数差异很小，SG培养基上的再生苗全部出根(如图3所示)，CM培养基上的再生苗出现了有叶无根的不良生长效果(如图4 所示)，因此，SG培养基比CM培养基更适合再生苗根叶生长。

为了了解供体植株世代对再生植株创制的影响，准备64份材料进行花药培养试验，其中F₁世代有14份，F₃世代有50份材料。供体植株世代对再生植株创制的影响，见表9。

表9供体植株世代对再生植株创制的影响

由表9可知，F₁世代材料的愈伤组织诱导率为69.8％、芽分化率为2.27％、获得再生苗1株、再生植株0株、再生苗率为50％、再生植株率为0；F₃世代材料的愈伤组织诱导率为70.7％、芽分化率为2.99％、获得再生苗5株、再生植株4株、再生苗率50％、再生植株率为40％。综上所述，在愈伤组织诱导、芽分化和再生苗方面，F₁世代与F₃世代之间差异很小；F₁世代获得再生苗只有1株，与F₃世代比较再生植株率，由于样本太小存在较大误差，不具备可比性。

为了了解基因型对再生植株率的影响，准备64个株系(组合)进行花药培养试验。基因型对再生植株率的影响，见表10。

表10基因型对再生植株率的影响

由表10可知，64个株系(组合)中有23个株系(组合)亲本包含汕油52，愈伤组织诱导率 69.2％、芽分化率5.56％、获得再生苗5株、再生植株4株、再生苗率71.4％、再生植株率57.1％；另外，有41个株系(组合)亲本未包含汕油52，愈伤组织诱导率71.1％、芽分化率1.68％、获得再生苗1株、再生植株0株、再生苗率20.0％、再生植株率为0。

表11再生植株的统计

由表11可知，试验获得再生苗6株，其中株系15B5-7、15B8-6、15B8-8分别为1株、2株、 2株，组合16B13为1株；只有株系15B8-6获得2株再生植株，株系15B8-8获得2株再生植株；其余株系(组合)的花药愈伤组织均未出现分化。

由表11可知，有4个株系(组合)获得再生苗，其中3个株系(组合)的亲本包含汕油52；有2个株系获得再生植株，均为15B8组合(粤油256/汕油52)F₃世代株系，汕油52 是父本。

综合对比可以发现，汕油52花生品种，无论是作为父本、母本，世代数在F₁、F₃，都具有较强的花药培养力。

在步骤(5)中的炼苗移栽，2020年嫁接成活后，1株编号为15B8-8的再生植株成功移植田间栽培(如图5-7所示)。

在步骤(6)中，依据荧光原位杂交染色结果可以看出，如图8-9所示，花生花药培养材料的染色体总数为20条，A基因组(绿色)染色体条数为9条，B基因组(红色)染色体条数为11条。花生栽培种染色体条数为40条，与栽培种相比较来看，该花生花药培养材料为单倍体。

综上所述，上述花生花药愈伤组织诱导率为56.0％-81.3％，花生花药愈伤组织分化率为1.42％-4.26％，再生苗率20.0％-100％，再生植株率0％-100％。综合来看，浓度为1％的NaClO 消毒时间采用9min，诱导培养采用B5N1培养基与B3N1培养基，分化培养采用B5N1-2培养基，再生苗生长采用SG培养基，从接种花药到获得再生植株，成功的概率为0.67％。

编号为15B8-8(F₃)的再生植株，经根尖染色体鉴定，具有9条A染色体、11条B 染色体，而不是理论上的10条A染色体、10条B染色体，推测分裂期间可能进行了染色体交换，确切原因尚有待进一步探讨。此外，由于完整再生植株数量极少，暂时没有条件做其他染色体鉴定方法，待植株扩繁足够多，可以采用细胞流氏仪进行倍性鉴定。

实施例2

本实施例中花生花药培养创制单倍体植株的培育方法与实施例1的区别在于：

步骤(5)中炼苗移栽的方法为：2018年9月，将2株种植在玻璃瓶中的编号为15B8-6的再生植株放入炼苗棚进行自然光照培养30天后，再生植株的高度约7-8cm、茎基直径约0.2cm、根大于或等于5条；将该再生植株洗净晾干，再植入塑料杯中，在温度为28±2℃、75％遮荫自然光的条件下进行栽培。上述塑料杯中盛放的栽培基质为：细沙与珍珠岩，按1:1的比例混合而成。

然而，在2018年移栽过程中，由于环境变化剧烈导致2株编号为15B8-6的再生植株死亡。

Claims (5)

1.一种花生花药培养创制单倍体植株的培育方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤（1）、选取健康花生植株摘取未开放花蕾，摘取花蕾次日，花蕾先用自来水冲洗20min，在超净工作台上用浓度为75%的乙醇浸泡30s，接着放入浓度为1%的NaClO中消毒，消毒时间设置为9min，然后用无菌水冲洗5-6次，最后利用灭菌滤纸吸干花蕾表面的水分；再通过剪除花蕾的萼片，将花药块从花蕾中挤压出来，剔除花瓣与花柱，获得花药块；

步骤（2）、愈伤组织诱导培养：

诱导培养基采用B5N1培养基和B3N1培养基；B5N1培养基是由基础MS培养基添加浓度为5mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA组成；B3N1培养基是由基础MS培养基添加浓度为3mg/L的6-BA和浓度为0.1mg/L的NAA组成；

使用之前需先往诱导培养基中添加浓度为30g/L的蔗糖与浓度为7g/L的琼脂，使诱导培养基的pH值保持在5.5-5.8；

再将诱导培养基倒入广口玻璃瓶中，经高压湿热灭菌、冷凝后接入已经消毒灭菌处理的花药块，在温度为26±2℃的黑暗环境下培养，获得愈伤组织；

步骤（3）、愈伤组织分化培养：

分化培养基采用B5N1-2培养基；B5N1-2培养基是由基础MS培养基添加浓度为5mg/L的6-BA、浓度为0.1mg/L的NAA、浓度为0.2mg/L的TDZ和浓度为0.2mg/L的AgNO₃组成；

使用之前需先往分化培养基中添加浓度为30g/L的蔗糖与浓度为7g/L的琼脂，使分化培养基的pH值保持在5.5-5.8；

再将分化培养基倒入广口玻璃瓶中，经高压湿热灭菌、冷凝后接入嫩绿色的愈伤组织，在温度为26±2℃、光照强度为2000lux、光照时间为8小时/天的条件下培养，获得幼芽；

步骤（4）、植株再生培养：将已分化出根、茎、叶的幼芽接入再生苗培养基，置于温度为26±2℃、光照强度为2800lux、光照时间为10小时/天的条件下在培养箱中培养；所述花生植株的亲本包含汕油52、植株世代为F₁或F₃；

步骤（5）、炼苗移栽：以汕油121为砧木、以再生植株为接穗，嫁接后采用薄膜封闭并保持高湿度管理后，再撤除薄膜炼苗，嫁接成活后将炼苗移植至田间，并搭建小拱棚覆盖薄膜保温栽培，获得花生单倍体植株。

2.根据权利要求1所述的花生花药培养创制单倍体植株的培育方法，其特征在于：所述步骤（4）中再生苗培养基包括CM培养基和SG培养基，使用之前需先往CM培养基与SG培养基中分别添加浓度为20g/L的蔗糖与浓度为5.5g/L的琼脂，使CM培养基与SG培养基的pH值保持在5.5-5.8。

3.根据权利要求2所述的花生花药培养创制单倍体植株的培育方法，其特征在于：所述步骤（4）中CM培养基是由基础MS培养基添加浓度为3g/L的花宝1号、浓度为2g/L的蛋白胨、浓度为0.8g/L的活性炭、浓度为15g/L的香蕉泥和浓度为50g/L的土豆泥组成。

4.根据权利要求2所述的花生花药培养创制单倍体植株的培育方法，其特征在于：所述步骤（4）中SG培养基是由基础MS培养基添加浓度为3g/L的花宝2号、浓度为2g/L的蛋白胨、浓度为0.8g/L的活性炭和浓度为50g/L的土豆泥组成。

5.根据权利要求1所述的花生花药培养创制单倍体植株的培育方法，其特征在于：还包括步骤（6）、采用根尖染色体鉴定方法对花生单倍体植株进行染色体数目鉴定。

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