CN112931198B - 一种菠萝抗寒种质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种菠萝抗寒种质的制备方法，属于菠萝抗寒种质制备技术领域。本发明中的菠萝抗寒种质的制备方法，先将菠萝胚性悬浮细胞使用EMS进行诱变；然后将诱变后的胚性悬浮细胞于再生培养基上无菌培养30‑50天；然后调整温度至3‑7℃无菌培养4‑6天，获得存活的成熟胚；最后将存活的成熟胚进行生芽培养、生根培养，得增殖芽苗；然后调整温度至3‑7℃无菌培养增殖芽苗4‑6天；选择存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。本发明中的方法，关键环节在实验室即可完成，实验条件可控；能够在短时间内对大量的菠萝个体进行抗寒能力筛选，能够快速筛选得到抗寒种质，能够明显加快菠萝抗寒育种的进度。

Description

一种菠萝抗寒种质的制备方法

技术领域

本发明涉及一种菠萝抗寒种质的制备方法，属于菠萝抗寒种质制备技术领域。

背景技术

菠萝是多年生植物，原产于南美洲热带高温干旱地区，性喜温暖，适宜生长温度为28-32℃。菠萝根系对温度反应敏感，温度稳定在14℃以上是菠萝正常生长的条件。0℃是菠萝遭受严重寒害的临界温度。气温降至0℃，如果持续时间达1天以上，会造成植株新叶腐烂，根系冻死，果实萎缩腐烂。如果气温达-2℃，植株几乎死亡。低温能够诱导菠萝果实褐变水化，发生黑心病水心病。造成菠萝品质变差，销售困难。我国菠萝主产区为广东、海南、云南、福建、广西等省区。近几年多地区菠萝滞销，其中重要原因是因为前一年冬季气温过低造成菠萝果实出现黑心水心造成的。在一些地区，菠萝冬果曾遭黑心病危害达50％以上(贺军虎，菠萝新品种及优质高产栽培技术，中国农业科学出版社，2016年，第94页)，给农民带来了巨大的经济损失。

针对菠萝主产区的低温灾害，培育抗寒菠萝新品种，对于菠萝产业的健康发展具有重要意义。由于菠萝自交不亲和，因此其一般是用冠芽、裔芽、吸芽及茎部等进行无性繁殖，这种无性繁殖非常不利于新品种的培育。在使用杂交育种培育新品种时，制备杂交种需要选育庞大的群体，需要付出极大的人力物力。而且由于自然条件下气温变化不定，针对杂交后代的选育具有极大的不确定性，因此，菠萝抗寒育种进展缓慢。

发明内容

本发明的目的是提供一种菠萝抗寒种质的制备方法，该方法能快速的获得菠萝抗寒种质，大幅度缩短菠萝抗寒育种的进程。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种菠萝抗寒种质的制备方法，包括如下步骤：

1)将菠萝胚性悬浮细胞使用EMS进行诱变；

2)将诱变后的胚性悬浮细胞于再生培养基上无菌培养30-50天；然后调整温度至3-7℃无菌培养4-6天，获得存活的成熟胚；

3)将步骤2)中存活的成熟胚进行生芽培养、生根培养，得增殖芽苗；然后调整温度至3-7℃无菌培养增殖芽苗4-6天；选择存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。

本发明中的菠萝抗寒种质的制备方法，先使用EMS(甲基磺酸乙酯)对菠萝胚性悬浮细胞进行诱变，然后在菠萝胚性悬浮细胞成苗过程中进行了两次抗寒筛选，一次在菠萝胚性悬浮细胞诱变后30-50天时，另一次在生芽生根培养后，诱导形成增殖芽苗后；两次分别在温度为3-7℃下无菌培养菠萝幼苗4-6天，然后选择存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。本发明中的方法，关键环节在实验室即可完成，实验条件可控；能够在短时间内对大量的菠萝个体进行抗寒能力筛选，能够快速筛选得到抗寒种质。不仅能够节约大量的人力物力，而且能够控制处理条件，解决常规育种选育气候条件不确定的问题，能够明显加快菠萝抗寒育种的进度。

优选的，步骤1)中所述菠萝胚性悬浮细胞是菠萝芽制备得到。所述菠萝芽为菠萝冠芽、裔芽、吸芽或块茎芽。可以使用的菠萝品种为台农4号、巴厘、金钻、甜蜜蜜或金菠萝的任意一种。

优选的，步骤1)中所述诱变时EMS的浓度为0.005-0.01％。菠萝胚性悬浮细胞是单细胞或细胞串，选用高浓度的EMS容易杀死菠萝胚性悬浮细胞，造成不发芽。因此本发明中选择0.005-0.01％的诱导浓度。

优选的，步骤1)中所述诱变的时间为12-18小时。

优选的，步骤1)中所述菠萝胚性悬浮细胞的制备包括：a、取菠萝植株上的芽，消毒后于愈伤组织诱导培养基上暗培养，得到愈伤组织；b、选取愈伤组织中的胚性愈伤，于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养，得到胚性悬浮细胞。

优选的，步骤a中取菠萝植株上的芽的芽体茎段中间(厚度约0.4-0.6厘米)的片状部位，于愈伤组织诱导培养基上暗培养。在外植体材料选取上，本发明选择菠萝芽体茎段中间约0.5厘米厚度的部位，菠萝芽内生菌多，在组织培养时经常遇到外植体内生菌污染的情况，选用芽体茎段中间部位，能够有效避免这个问题。

优选的，步骤a中于愈伤组织诱导培养基上暗培养50-70天，诱导得到愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基配方为MS+2.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+1.5mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.1mg/L NAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.3。

优选的，步骤b中所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基为在MS培养基的基础上，添加1.5-2.5mg/L 2,4-D、1-2mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L NAA、40-50g/L蔗糖；所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基的pH＝5.0-5.5。步骤b中于胚性细胞诱导液体培养基中暗培养50-70天，诱导得到胚性悬浮细胞。更为优选的，所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基配方为MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+45g/L蔗糖，pH＝5.3。

优选的，步骤b在选择愈伤组织中的松脆易碎的胚性愈伤进行培养。在胚性愈伤转接到液体培养基以后，以每14天转接一次为宜，转接太频繁会增大被污染的几率，而且效果也不明显。转接时培养瓶内应保留10％-20％的原培养液不变。每次转接时，用移液器去除培养液内的黄色的分生组织小球、处于子叶期白色的胚、褐化坏死的组织和高度液泡化的细胞。

优选的，步骤2)中所述再生培养基中添加以下物质：SH大量元素、SH微量元素、MS维生素、3.9-4.3μmol/L生物素、650-700μmol/L谷氨酰胺、1.5-2.5mmol/L脯氨酸、80-120mg/L麦芽糖、1.0-1.2μmol/L NAA、0.15-0.25μmol/L玉米素、0.3-0.7μmol/L激动素、0.5-0.9μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine、110-150mmol/L蔗糖、27-31mmol/L乳糖、0.8-1.2g/L植物凝胶；所述再生培养基的pH＝5.6-6.0。步骤2)中是将胚性悬浮细胞于再生培养基上暗培养30-60天，得到成熟胚。

所述再生培养基为半固体培养基。再生培养基使用半固体培养基较好，铺在半固体培养基上面的滤纸能够更好地与培养基相接触，胚性悬浮细胞在滤纸上能够更容易地生长得到幼胚；而如果用全固体的培养基，则胚性悬浮细胞死亡率较高，生长出来的幼胚也呈现失水症状。

更为优选的，所述再生培养基配方为SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L生物素+680μmol/L谷氨酰胺+2mmol/L脯氨酸+100mg/L麦芽糖+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/L玉米素+0.5μmol/L激动素+0.7μmol/LN6-(2-isopentenyl)adenine(异戊基腺嘌呤)+130mmol/L蔗糖+29mmol/L乳糖+1g/L植物凝胶，pH5.8。其中SH即SH培养基；MS即MS培养基；adenine即腺嘌呤。在转移胚性悬浮细胞时，在再生培养基的上面铺一张细胞载体，转移1mL上述胚性悬浮细胞培养物到细胞载体上，即可。所述细胞载体为滤纸，优选为无菌定性分析滤纸。在再生培养基上的培养为黑暗培养。

优选的，步骤3)中所述生芽培养包括：将成熟胚于第一生芽培养基上暗培养，得到发芽的胚；将发芽的胚转移到第二生芽培养基上培养，得到从生芽；将从生芽中的小苗取出于芽苗恢复培养基上培养，得到幼芽，然后将幼芽进行生根培养。

优选的，所述第一生芽培养基中添加以下物质：MS培养基、1.5-2.5mg/L IAA、0.3-0.7mg/L BAP、25-35g/L蔗糖、2.5-3.5g/L植物凝胶；所述第一生芽培养基的pH＝5.6-6.0。然后将成熟胚于第一生芽培养基上黑暗培养20-40天，得到发芽的胚。第一生芽培养基为固体培养基，其上无需铺设滤纸。

更为优选的，所述第一生芽培养基配方为MS培养基+2mg/L IAA+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH＝5.8。其中MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤。将成熟胚转移到第一生芽培养基上，暗培养1个月左右获得发芽的胚。

优选的，所述第二生芽培养基为在MS培养基得基础上，添加0.5-1.5mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L NAA、4-6％椰子汁、25-35g/L蔗糖；所述第二生芽培养基的pH＝5.6-6.0。步骤4)中是将发芽的胚转移到第二生芽培养基上，暗培养10-20天，然后光照培养20-40天，得到从生芽。光照培养时，光照时间为每天12小时，光照强度为1500lux，温度26℃。

更为优选的，所述第二生芽培养基配方为MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+5％椰子汁+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

优选的，将所述丛生芽中长至2-5cm的单棵苗切割分离，接种至芽苗恢复培养基上，光照培养10-20天。光照培养时，光照时间为每天12小时，光照强度为1500lux，温度26℃。

优选的，所述芽苗恢复培养基为MS培养基，其中还包括椰子汁和糖类。更为优选的，所述芽苗恢复培养基配方为MS+5％椰子汁+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

优选的，步骤3)中所述生根培养是将菠萝幼芽于生根培养基中光照培养20-40天，得到增殖芽苗。然后将增殖芽苗于3-7℃无菌培养4-6天；选择存活的增殖芽苗即为菠萝抗寒种质。

所述生根培养基配方为1/2MS+0.5mg/L IBA+3％香蕉粉+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

优选的，将获得的存活的增殖芽苗去除培养器盖、练苗，得到菠萝抗寒种质。

优选的，所述练苗为将增殖芽苗至于阴凉处锻炼2-4天。练苗后取出苗，用自来水洗净苗上的培养基，移栽至装有营养土：沙子＝1:1的盆中，阴凉处培养3天，移至自然光下生长。

本发明中的比较了获得的抗寒种质和一般种质，发现一般种质对照受到严重冻害，而经过本发明中的方法处理后获得的抗寒种质基本没有受到冻害，处理后获得的种质为具有抗寒性能。

附图说明

图1为本发明试验例1中抗寒株系与对照低温处理后表现图；

图2为本发明试验例2中抗寒株系与对照低温处理后表现图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。以下实施例中MS的配方如表1所示。

表1 MS培养基配方

1/2MS是指MS中大量元素(硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁和磷酸二氢钾)的用量减半，其它成分用量不变。

SH培养基配方为：硝酸钾2.5g/L，硫酸镁0.195g/L，磷酸二氢铵0.3g/L，无水氯化钙151mg/L，甘氨酸2.0mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，乙二胺四乙酸铁钠19.8mg/L，六水氯化钴0.1mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，硼酸5.0mg/L，碘化钾1.0mg/L，一水硫酸锰10.0mg/L，二水钼酸钠0.1mg/L，七水硫酸锌1.0mg/L。

SH大量元素：硝酸钾2.5g/L，硫酸镁0.195g/L，磷酸二氢铵0.3g/L，无水氯化钙151mg/L。

SH微量元素：六水氯化钴0.1mg/L，五水硫酸铜0.2mg/L，硼酸5.0mg/L，碘化钾1.0mg/L，一水硫酸锰10.0mg/L，二水钼酸钠0.1mg/L，七水硫酸锌1.0mg/L。

MS维生素：肌醇100.0mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫氨素0.4mg/L。

实施例1

本实施例中菠萝抗寒种质的制备方法，包括如下步骤：

1)胚性悬浮细胞系的获取

摘取巴厘或台农4号的冠芽，剥掉叶片，用软刷蘸1％洗涤灵轻轻刷洗茎段至干净，将茎段用自来水冲洗干净，去掉茎段表面的附着物。将上述茎段用75％酒精对其表面喷洒，然后转至超净工作台，在超净工作台中，将茎段放入75％的酒精中浸泡1分钟，然后取出茎段，用无菌水冲洗5次，放至滴加有2滴Tween20的0.1％氯化汞中浸泡1分钟，然后用无菌水冲洗5次，将茎段转移至一个直径为90毫米的培养皿中。在培养皿中，用无菌手术刀片和镊子切去茎段上下两端，仅留下茎段中间厚度约0.5厘米的片状部位，接种在愈伤组织诱导培养基M1上，M1配方为MS+2.0mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L Sucrose+7g/LAgar，pH＝5.3。将创伤面紧贴在培养基上，暗培养，每两周继代一次，培养条件为黑暗，温度26℃，培养时间2个月。

2个月后，将诱导出的愈伤组织切下，放至愈伤组织诱导培养基M1上，继续暗培养，扩繁愈伤组织。选择包含有大量松脆易碎的胚性愈伤和处于发育早期的透明原胚的培养物，小心放于无菌的培养皿中，用手术刀片小心取下松脆易碎的胚性愈伤，放于盛放有6mL液体培养基M2中；液体培养基M2为：MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+45g/Lsucrose,pH＝5.3。培养条件：黑暗，温度26℃，转速90rpm，培养时间2个月。胚性悬浮细胞系诱发的第一个月，每7到10天更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；从第二个月开始，每两周更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；在更换培养液时，用移液器吸走并除去黄色的分生组织小球、处于子叶期的白色胚、褐化组织和高度液泡化的细胞。

每个月转移一部分样品在细菌培养基上培养，以检测是否被细菌污染；每次更换培养液时，先静置1分钟，观察沉淀下来的细胞所占培养液的比例，如果沉淀细胞的体积所占整个培养液体积的比例超过3％，可以将细胞转移到一个更大的培养瓶中进行培养；在培养的过程中可以用FDA检测悬浮细胞的活性，先滴几滴FDA到蒸馏水中，直到呈现亮蓝色，加1到2滴这样的溶液到悬浮细胞样品中，在显微镜下观察，呈现亮绿色的细胞为具有活性的细胞；用孔径为250到500微米的筛网除去分生组织小球和原胚；如此反复，即可获得较理想的胚性悬浮细胞系。

2)EMS诱变

在一个容积为50毫升的离心管中，放入1毫升胚性悬浮细胞，加入10毫升无菌蒸馏水，加入抽滤灭菌的0.4毫升0.2％的EMS。用parafilm膜将离心管管口封住，在摇床上，常温下，100rpm，摇晃处理15小时。取下离心管，室温下静置30分钟，使悬浮细胞全部沉淀在管底。尽可能多地移除掉液体。然后加满无菌水，轻轻摇晃混匀后，静置30分钟，使悬浮细胞全部沉淀在管底，尽可能多地移除掉瓶中的水，重复该步骤8次。最后一次三角瓶需要在室温下静置1小时，然后尽可能多地移除掉瓶中的无菌水。

3)再生及抗寒处理

用移液枪吸取无菌水对悬浮细胞进行吹吸，然后将悬浮细胞转移至再生培养基M3上，M3盛放在一个直径为90mm的培养皿中。M3培养基为：SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L biotin+680μmol/L glutamine+2mmol/L proline+100mg/L maltose+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/L zeatin+0.5μmol/L kinetin+0.7μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine+130mmol/L sucrose+29mmol/L lactose+1g/L phytagel,pH5.8；所述SH即SH培养基；MS即MS培养基；biotin即生物素；glutamine即谷氨酰胺；proline即脯氨酸；maltose即麦芽糖；NAA即萘乙酸；zeatin即玉米素；kinetin即激动素；adenine即腺嘌呤；sucrose即蔗糖；lactose即乳糖；phytagel即植物凝胶；在培养基的上面铺一张无菌定性分析滤纸，转移1mL上述培养物到滤纸上。黑暗，温度26℃，培养时间为40天；然后调整温度至5℃无菌培养5天。

在直径为90mm的培养皿中盛放25mL第一生芽培养基M4，M4培养基配方为：MS大量元素+MS微量元素+MS维生素+2mg/L IAA+0.5mg/L6-BA+30g/L sucrose+3g/L phytagel,pH＝5.8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；6-BA即6-苄氨基嘌呤；sucrose即蔗糖；phytagel即植物凝胶；将存活的成熟胚转移到培养基M4上，暗培养1个月获得发芽的胚。

将发芽的胚转移到第二生芽培养基M5上，M5培养基配方为：MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+5％椰子汁+30g/L蔗糖，pH＝5.8；暗培养15天，温度为26℃，然后光照培养，光照时间为每天12小时，光照强度为1500lux。温度为26℃，培养1个月，即可获得菠萝再生丛生芽。

将丛生芽中已长至3厘米左右的单棵幼苗切割分离，接种至芽苗恢复培养基M6上，光照培养，光照时间为每天12小时，光照强度为1500lux.温度为26℃，每两周继代一次。M6配方为MS+5％椰子汁+30g/L蔗糖，pH＝5.8。

15天后将幼苗转移至生根培养基M7上，M7配方为1/2MS+0.5mg/L IBA+3％香蕉粉+30g/L蔗糖，pH＝5.8；光照培养，光照时间为每天12小时，光照强度为1500lux，温度为26℃。培养30天。调整温度至5℃无菌培养增殖芽苗5天；选择存活下来的增殖芽苗在26℃，光照培养，光照时间为每天12小时，光照强度为1500lux条件下进行培养。培养2个月，苗长至10厘米左右，去除培养瓶盖子，阴凉处锻炼3天，取出苗，用自来水洗净苗上的培养基，移栽至装有营养土：沙子＝1:1的盆中，阴凉处培养3天，移至自然光下生长。存活下来的增殖芽苗即为抗寒种质。

应用本实施例的方法，用一株冠芽制备的胚性悬浮细胞，经过EMS诱变和抗寒处理后，巴厘获得了3株抗寒种质，台农4号获得了5株抗寒种质。

实施例2

本实施例中菠萝抗寒种质的制备方法，包括如下步骤：

1)胚性悬浮细胞系的获取

所用菠萝冠芽为金钻或者金菠萝的冠芽。胚性悬浮细胞获取过程同实施例1。

2)EMS诱变；3)再生及抗寒处理；过程同实施例1。

本实施例中，用一株冠芽制备的胚性悬浮细胞，经过EMS诱变和抗寒处理后，金钻获得了3株抗寒种质，金菠萝获得了4株抗寒种质。

实施例3

本实施例中菠萝抗寒种质的制备方法，包括如下步骤：

1)将菠萝胚性悬浮细胞使用EMS进行诱变，诱变浓度为0.005％，诱变的时间为18小时；

2)将诱变后的胚性悬浮细胞于再生培养基上无菌培养30天；然后调整温度至3℃无菌培养4天，获得存活的成熟胚；

3)将步骤2)中存活的成熟胚进行生芽培养，得幼芽；然后将幼芽转移至生根培养基中培养20天，然后调整温度至3℃培养4天，得到存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。

实施例4

本实施例中菠萝抗寒种质的制备方法，包括如下步骤：

1)将菠萝胚性悬浮细胞使用EMS进行诱变，诱变浓度为0.01％，诱变的时间为12小时；

2)将诱变后的胚性悬浮细胞于再生培养基上无菌培养50天；然后调整温度至7℃无菌培养6天，获得存活的成熟胚；

3)将步骤2)中存活的成熟胚进行生芽培养，得幼芽；然后将幼芽转移至生根培养基中培养40天，然后调整温度至7℃培养6天，得到存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质。

试验例1

待实施例1中获得的巴厘和台农4号种质长至10片叶时，与对照的菠萝(对照菠萝苗也是从胚性悬浮细胞获得的，但是在获得的过程中没有经过EMS诱变和抗寒筛选)苗一起置在5℃条件下，光照强度为2000lux，光照时间为10小时/天，培养5天。发现对对照的菠萝苗受到严重冻害，而经过实施例1获得的种质基本没有受到冻害，处理后获得的种质为抗寒种质。

抗寒株系与对照低温处理后表现如图1所示，上面两株为对照，下面两株为抗寒株系。在4度条件下处理1天，对照叶片呈现墨绿色，在室温条件下，叶片组织塌陷，呈烫伤状。抗寒株系叶片颜色为正常绿色，叶片组织坚挺，没有烫伤状出现。

试验例2

待实施例2中获得的金钻和金菠萝种质长至10片叶时，与对照的菠萝苗(对照菠萝苗也是从胚性悬浮细胞获得的，但是在获得的过程中没有经过EMS诱变和抗寒筛选)一起置在5℃条件下，光照强度为2000lux，光照时间为10小时/天，培养5天。发现对比例1中的菠萝苗受到严重冻害，而经过实施例2获得的种质基本没有受到冻害，处理后获得的种质为抗寒种质。

抗寒株系与对照低温处理后表现如图2所示，左边两株为对照，右边两株为抗寒株系。在4度条件下处理1天，对照叶片呈现墨绿色，在室温条件下，叶片组织塌陷，呈烫伤状。抗寒株系叶片颜色为正常绿色，叶片组织坚挺，没有烫伤状出现。

Claims (4)

1.一种菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）将菠萝胚性悬浮细胞使用EMS进行诱变；

2）将诱变后的胚性悬浮细胞于再生培养基上无菌培养30-50天；然后调整温度至3-7℃无菌培养4-6天，获得存活的成熟胚；

3）将步骤2）中存活的成熟胚进行生芽培养、生根培养，得增殖芽苗；然后调整温度至3-7℃无菌培养增殖芽苗4-6天；选择存活的增殖芽苗，即为菠萝抗寒种质；

步骤1）中所述菠萝胚性悬浮细胞的制备包括：a、取菠萝植株上的芽，消毒后于愈伤组织诱导培养基上暗培养，得到愈伤组织；b、选取愈伤组织中的胚性愈伤，于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养，得到胚性悬浮细胞；

所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基由MS培养基、1.5-2.5mg/L 2 ,4-D、1-2mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L NAA、40-50 g/L蔗糖组成；

步骤2）中所述再生培养基由SH大量元素、SH微量元素、MS维生素、3.9-4.3 μmol/L 生物素、650-700μmol/L 谷氨酰胺、1.5-2.5mmol/L 脯氨酸、80-120mg/L 麦芽糖、1.0-1.2μmol/L NAA、0.15-0.25μmol/L 玉米素、0.3-0.7μmol/L 激动素、0.5-0.9μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine、110-150mmol/L 蔗糖、27-31mmol/L 乳糖、0.87-1.2g/L 植物凝胶组成；

步骤3）中所述生芽培养包括：将成熟胚于第一生芽培养基上暗培养，得到发芽的胚；将发芽的胚转移到第二生芽培养基上培养，得到从生芽；将从生芽中的小苗取出于芽苗恢复培养基上培养，得到幼芽，然后将幼芽进行生根培养；

所述第一生芽培养基由MS大量元素、MS微量元素、MS维生素、1.5-2.5 mg/L IAA、0.3-0.7mg/L BAP、25-35 g/L 蔗糖、2.5-3.5g/L植物凝胶组成；

所述第二生芽培养基为由MS培养基、0.5-1.5mg/L 6-BA、0.05-0.15mg/L NAA、4-6%椰子汁、25-35g/L 蔗糖组成；

所述胚性悬浮细胞诱导液体培养基的pH=5.0-5.5，所述再生培养基、第一生芽培养基和第二生芽培养基的pH=5.6-6.0。

2.根据权利要求1所述的菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述诱变时EMS的浓度为0.005-0.01%。

3.根据权利要求2所述的菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：所述诱变的时间为12-18小时。

4.根据权利要求1所述的菠萝抗寒种质的制备方法，其特征在于：步骤b中于胚性悬浮细胞诱导液体培养基中暗培养50-70天，诱导得到胚性悬浮细胞。

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