CN1748477A - 一种通过成熟胚愈伤诱导进行日本结缕草植株再生的方法及培养基 - Google Patents
一种通过成熟胚愈伤诱导进行日本结缕草植株再生的方法及培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物组织和细胞培养技术领域。以草坪草品种日本结缕草(Zoysia japonica Steud)的成熟种子为外植体诱导愈伤组织，通过愈伤组织增殖(或通过长期继代)，最后诱导分化为完整小植株。本发明包括下列步骤：a)在含有愈伤诱导剂的培养基中培养日本结缕草的成熟种子并诱导愈伤组织；b)挑选状态良好的愈伤组织到增殖(或继代)培养基上增殖或继代；c)挑选状态良好的经过增殖或者继代的愈伤组织到分化培养基上诱导成完整小植株。本发明还包括将增殖或继代培养基上的黄色脆性胚性愈伤接种到继代培养基上作长期继代并保持分化。与现有技术相比，本发明显著提高了结缕草外植体愈伤诱导率和植株再生的效率。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养和植株再生技术领域，具体地说，本发明涉及以日本结缕草的成熟种子为外植体，通过愈伤组织诱导进行植株再生的方法以及用于该方法的培养基。
背景技术
日本结缕草(Zoysia japonica Steud.)是草坪植物中应用较广泛、适应性较强的一个暖季型草种。其分布广、抗性强，在现代城市绿化、运动场建植及水土保持中都占有重要地位，但较短的青绿期成为限制其大量应用的瓶颈，利用现代生物技术，如遗传转化、原生质体融合、体细胞突变体的诱导等，对日本结缕草进行遗传改良，为日本结缕草种质的创新提供了广阔的空间。要对日本结缕草进行遗传转化及体细胞突变体的诱导，植株再生体系的建立是前提。
现有技术中的日本结缕草植株再生方法通常是这样的：将日本结缕草成熟胚接种在诱导培养基上诱导愈伤组织，对诱导出的愈伤组织进行继代培养，再将愈伤组织转入分化培养中诱导芽的产生(Al-KharyiJ M，Huang F H，Thompson L F，et al.Crop Science，1989，29(5)：1324-1325；Asano Y.Plant cellRep，1989，8(3)：141-143；Inokuma C，Sugiura K，Cho C，Okawara R，Kaneko S.Plant Cell Rep，1996，15：737-741；李瑞芬等，结缕草愈伤组织诱导及植株再生，园艺学报，2003，30(3)：355-357)。这些方法中产生的愈伤组织很难长期继代并保持分化能力，因而很难作为遗传转化的受体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种离体培养日本结缕草的植株再生方法，特别是提供一种在离体培养条件下，通过成熟胚愈伤诱导进行日本结缕草植株再生的方法及用于该方法的培养基，该方法及其培养基能够使日本结缕草愈伤组织长期继代并保持良好分化成正常植株能力。
本发明是这样实现的：
一种离体培养日本结缕草再生植株的方法，它包括下列步骤：
a)在含有诱导剂的培养基中培养日本结缕草的成熟种子，将其诱导出愈伤组织；
b)挑选步骤a)得到的状态良好的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上使其增殖；
c)挑选步骤b)得到的状态良好的愈伤组织接种到分化培养基上诱导芽丛，和
d)将步骤c)得到的芽丛转入生根培养基中生根，使其成为完整植株。
在本发明中解决愈伤组织长期继代培养并保持良好分化能力的技术措施是：从增殖的愈伤组织中挑选黄白色、颗粒状、分散好的愈伤组织接种到长期继代培养基上，使该愈伤组织能够长期继代并保持分化能力。
在本发明中，所述的培养基中的诱导剂选自2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄基嘌呤或其组合。
它们的适宜浓度为：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)为2-4mg/L，6-BA为0.02-0.05mg/L。
在本发明中，所述的愈伤组织诱导培养基为：N6的大量元素，MS的微量元素和有机成分，MS铁盐，水解乳蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2，4-D 2.0-4.0mg/L，6-BA 0.02-0.05mg/L，维生素B1 5.0mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L，固化琼脂粉8g/L，加水至1L，调pH值为6.0。
所述的愈伤组织增殖培养基为：MS基本培养基，水解乳蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2，4-D 1.5-2.5mg/L，维生素VB1 5.0mg/L，AgNO3 3.0mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L，固化琼脂粉8g/L，加水至1L，调pH值为6.0。
所述的愈伤组织分化培养基为：MS基本培养基，萘乙酸0.3mg/L，6-BA 1.0mg/L，蔗糖30g/L，固化琼脂粉7g/L，加水至1L，pH值为6.0。
所述的愈伤组织长期继代培养基为：MS基本培养基，萘乙酸0.3mg/L，激动素0.5mg/L，6-苄基腺嘌呤1.0mg/L，蔗糖30g/L，固化琼脂粉7g/L，加水至1L，调pH值为5.8。
用于由分化的芽丛诱导生根的生根培养基为1/2MS基本培养基附加固化琼脂粉7g/L，加水至1L，调pH值为6.0。
特别指出，在实施上述的技术发明步骤中，为了使日本结缕草的愈伤组织达到长期继代培养并保持良好的分化为植株的能力，应挑选黄白色、颗粒状、分散好的愈伤组织接种到继代培养基上，按照本发明所提示的方法培养。
为了便于本发明的描述，上述各个步骤中，含有诱导剂、细胞分裂素的培养基分别称为愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、分化培养基、生根培养基及继代培养基。用于配制上述各培养基的基础培养基是本领域技术人员熟知的常用培养基如MS培养基和N6培养基(培养基成分参见李明浚编译.植物组织培养，北京：中国农业出版社，1992)。在本发明中根据各步骤的需要，基础培养基采用的主要是MS培养基(Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15：473-497)和N6培养基(朱至清等.通过氮源比较实验建立一种较好的水稻花药培养基，中国科学，1975，(5)：484-490)，但不应认为本发明的仅仅适用于该培养基。
在上述方法中，诱导剂是本领域技术人员常用来诱导愈伤组织的诱导剂。诱导剂宜选用萘乙酸(简称NAA)、吲哚乙酸(IBA)，2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-D)或其组合，较佳的诱导剂是2，4-二氯苯氧乙酸。2，4-D是影响外植体脱分化的关键因素，在本发明中，愈伤组织诱导发生阶段，培养基中必须加入2，4-D，浓度宜为2-4mg/L，添加一定量的细胞分裂素6-BA(浓度为0.01-0.02mg/L)能明显地提高有分化能力愈伤组织诱导率，但高浓度的6-BA(＞0.1mg/L)则对愈伤组织有一定的伤害，使愈伤组织不但诱导量小、褐化并会逐渐死亡。
在上述方法中，愈伤组织的增殖阶段也必须加入适量的2，4-D，其浓度宜为1.5-2.5mg/L。
上述诱导愈伤组织分化的细胞分类素和生长素是本领域技术人员所熟知的，在本发明的实践中，较佳的细胞分裂素是6-BA(6-苄基腺嘌呤)，其浓度宜为1.0mg/L，生长素为NAA，其浓度为0.3mg/L。
在上述方法中，愈伤组织的长期继代培养基中2，4-D和KT(激动素)是关键激素，继代过程中在培养基中添加0.2mg/L 6-BA能使愈伤组织趋于分化，不利于愈伤组织的保存。而0.3-0.5gm/L KT则能使愈伤组织长期保存而不降低分化率。
本发明可从日本结缕草成熟种子中高频诱导愈伤组织，愈伤组织增殖培养后接种入分化培养基可诱导芽丛分化，挑选增殖培养后具有芽点样物愈伤组织周围的愈伤组织进行继代培养，能长期保持这些愈伤组织的再生能力，截止到目前为止所继代的愈伤组织已继代(保存)了18个月。这些能保持高分化率的愈伤组织为以后的农杆菌介导的日本结缕草的遗传转化以及体细胞突变体的诱导提供了良好的受体。
与已有的日本结缕草离体植株再生方法相比，本发明具有以下明显的效果：1、所用的愈伤组织诱导和继代基本培养基以及培养基所附加的激素和附加物如所报道的技术文献不同；2、本发明制备的日本结缕草愈伤组织在本发明制备的继代和分化培养基上可长期继代保存并保持良好的分化能力。
附图说明
图1由结缕草成熟种子诱导的愈伤组织
图2愈伤组织在增殖培养基上形成的微芽及其周围产生的愈伤组织
图3将部分发育良好的具叶状体结构的微芽在1/2MS培养基上诱导成苗
图4继代2次后处于分化状态的愈伤组织及其周围的愈伤组织
图5长期继代保存了13个月的愈伤组织的形态特征
图6连续继代13个月的愈伤组织接种于编号为D4的分化培养基上分化成苗
图7将图3种诱导出的部分发育不太好的芽丛切分后转移到1/2MS培养基上进行诱导生根
图8移栽至田间栽培成活的结缕草植株
具体实施方式
实施例1：日本结缕草再生系统的建立
1、试验材料来源及其处理：
本发明的试验材料成熟的日本结缕草(Zoysia japonica Steud)种子从北京中国种业集团购买。在本发明中，日本结缕草的愈伤组织的诱导、继代和分化没有品种的限制。
将日本结缕草种子加蒸馏水在研钵中研磨15分钟左右，自来水下冲洗去种皮，然后在超净工作台(或无菌接种箱)上用76％(V/V)酒精消毒30秒，再用0.1％(W/V)升汞溶液消毒20-25分钟，无菌水漂洗5遍，每次洗涤3-5分钟，得到用于处理的消毒种子，备用。
2、培养基设计：
表1，列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。
表1 日本结缕草的离体培养基设计
| 培养基名称 | 培养基成分 |
| 愈伤组织诱导培养基愈伤组织增殖培养基愈伤组织继代培养基愈伤组织分化培养基 | N6基本培养基的大量元素，MS微量元素和有机成分，MS铁盐，CH 500mg/L，脯胺酸(Pro)500mg/L，2，4-D 3.0mg/L，6-BA 0.02mg/L，VB1 5.0mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L，固化琼脂粉8g/L，加水至1L。灭菌前调整培养基pH值为6.0。MS基本培养基，CH 500mg/L，Pro 500mg/L，2，4-D 2.0mg/L，VB1 5.0mg/L，AgNO33.0mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L，固化琼脂8g/L，加水至1L。灭菌前调整培养基pH值为6.0MS基本培养基，CH 500mg/L、Pro 500mg/L，2，4-D 2.0mg/L，VB1 5.0mg/L，AgNO33.0mg/L、KT(0.3，0.5，1.0，2.0mg/L)，或BA0.2mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L、固化琼脂8g/L，加水至1L。灭菌前调整培养基pH值为6.0。MS基本培养基，NAA 0.3mg/L，KT 0.5mg/L，6-BA 1.0mg/L，蔗糖30g/L，固化琼脂粉7g/L，加水至1L。灭菌前调整培养基pH值为5.8。 |
说明：MS基本培养基成分(参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版)。
N6基本培养基的大量元素(参见：朱至清等，通过氮源比较实验建立一种较好的水稻花药培养基，中国科学，1975，(5)：484-490)
在本发明中，培养基中各组分及简称如下：2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、NAA(α-萘乙酸，或称萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、CH(水解乳蛋白)、Pro(脯胺酸)、KT(激动素)、VB1(维生素B1))、蔗糖、葡萄糖和固化琼脂粉均可市售购得。
3、接种与培养
在超净工作台或无菌接种箱条件下，将处理好的成熟日本结缕草种子接种于分装有愈伤组织诱导培养基的培养皿中，每培养皿中接种约50粒种子，25±1℃暗培养(温度25±1℃的暗培养箱中，24h)。5-7天后，有萌发潜力的胚皆萌发出芽，10天后在芽基部与种子接触处膨大长出愈伤组织，少数不萌发的种子直接长出愈伤组织(见图1)。最初长出的愈伤组织一般为乳白色或黄白色，一个月后挑呈团簇状的愈伤组织转移到继代培养基上，同一培养室弱光条件下(每天弱光照14h，光照强度100-500lx)培养，该种愈伤组织迅速增值，并且一部分同时形成有叶状体的微芽结构(见图2)。
培养8-10天后，将形成有叶状体微芽结构的愈伤组织和块状愈伤组织分别接种于1/2MS上，25±1℃下光照培养(培养室培养温度25±1℃，光照强度1000-1500lx，每天光照14h)，大约7天后具微芽结构的愈伤组织便形成完整植株；15天后块状愈伤组织也形成完整植株(见图3)。
当小苗长得很健壮时，打开培养盒盖，使小植株适应环境2-3天。然后洗净根上的培养基，剪掉少量须根和大部分茎叶，将小苗移栽到一次性塑料杯中，小水灌透。先放在模拟大自然环境的光照培养箱3-5天，使其长出新根后移栽于室外的花盆或大田中，成活率达100％(见图8)。
实施例2：不同浓度KT对愈伤组织的长期继代保存的影响
(1)材料：
愈伤组织经2-3代增殖培养后形成的一种分化状态的愈伤组织，将该愈伤组织进行长期继代培养。
(2)愈伤组织继代培养基的配制：
愈伤组织继代培养基的配制如表1所示。为了探索不同浓度KT对连续继代的日本结缕草的影响，在本实施例中申请人特别增加了如表2所示的培养基进行比较试验。
3、培养方法：
将诱导出的紧实愈伤组织在经2-3代继代培养后形成了一种分化状态的愈伤组织(见图4所示)。选择分化状态愈伤组织周围颜色呈黄白色、颗粒状、分散性好的愈伤组织，或在芽状体结构周围形成的具有颗粒状、干燥、硬实的愈伤组织进行继代培养，建立起愈伤组织无性系。在此过程中，激动素KT对愈伤组织的连续继代起着重要的作用。在继代培养中，当KT浓度为0.3mg/L，愈伤组织中有少量的芽点样物产生，而且硬实的愈伤组织的量过少，不利于其增殖；当KT浓度在0.5-1.0mg/L时，整个培养物中硬实的愈伤组织产生量大，而且愈伤组织中有芽点样物产生，有利于愈伤组织的保存；当KT浓度达2.0mg/L时，由于产生的芽点样物过多而愈伤组织的量少而不利于愈伤组织的保存；当加入细胞分裂素6-BA 0.2mg/L时，愈伤组织培养物的情况同加入KT2.0mg/L的情况差不多，即，芽点样物过多而愈伤组织的量少，不利于愈伤组织的进一步的保存。因此，根据愈伤组织状态、愈伤组织量以及愈伤组织中芽点样物的产生量，选用适当浓度(一般为0.5-1.0mg/L)的KT有利于愈伤组织的继代保存。由于添加KT0.5mg/L或KT1.0mg/L的培养基中愈伤组织状态差别不大，最后选用添加KT0.5mg/L的培养基为最适合的继代培养基。在此种培养基上，通过继代保存的愈伤组织截止到2005年5月已经长达18个月。
表2 不同KT浓度及0.2mg/L 6-BA对日本结缕草愈伤组织继代的影响
| 激素名称 | 添加浓度(mg/L) | 愈伤组织状态 |
| KTKTKTKT | 0.30.51.02.0 | 颗粒样、干燥、硬实愈伤组织少、少量芽点样物产生颗粒样、干燥、硬实愈伤组织多、有芽点样物产生颗粒样、干燥、硬实愈伤组织多、有芽点样物产生愈伤组织量少、产生芽点样物过多 |
| 6-BA | 0.2 | 愈伤组织量少、产生芽点样物过多 |
说明：接种所用愈伤组织块的大小约10克/鲜重
实施例3：连续不断继代的日本结缕草愈伤组织在不同分化培养基上的分化率
用于愈伤组织分化培养基的配制如表1所示。
本发明长久保存的愈伤组织往往是多种状态共存的(见图5)，黑色箭头所指为保存时挑选的愈伤组织，蓝色箭头所指为只具有增殖能力而无分化能力的愈伤组织，红色箭头所指为一种组织化程度较高的愈伤组织，它的产生是本发明中继代保存的愈伤组织具有保存价值的一种标志。
在本实施例中，申请人利用继代了6代的愈伤组织用于分化芽和植株的试验。申请人在表1所示的通用分化培养基的基础上，特别设计了如表3所示的分化培养基，以确定本发明最适分化培养基。
本实施例的愈伤组织在不同分化培养基上的分化效果如表4所示。
从表4可以看出，利用如图5红色箭头所指为一种组织化程度较高的愈伤组织，具有很强的分化能力，在添加不同激素的9种培养基中都可以分化出苗，甚至在不加任何激素的1/2MS培养基中也能分化出苗(见图6)。
表3 连续继代保存的结缕草愈伤组织分化成苗的不同培养基编号及成分
| 分化培养基编号 | 培养基成分(mg/L) |
| D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10 | MS基本培养基，NAA 0.3，KT 0.5，BA 0.1MS基本培养基，NAA 0.3，KT 0.5，BA 0.5MS基本培养基，NAA 0.3，KT 0.5，BA 0.05MS基本培养基，NAA 0.3，KT 0.5，BA 1.0MS基本培养基，NAA 2.0，KT 0.1，BA 2.0MS基本培养基，TDZ(Thidiazuron，塞苯隆)1.0MS基本培养基，NAA0.5，KT 0.5MS基本培养基，NAA0.2，KT 1.0，BA0.5MS基本培养基，BA 1.01/2 MS |
说明：(1)连续继代的愈伤组织是指继代了6代，从接种到愈伤组织的利用约45天。
(2)MS基本培养基来源见表1所附的参考文献。
表4 可连续继代保存愈伤组织在10种不同分化培养基上的分化率
| 分化培养 | 接种愈伤块数 | 分化愈伤块 | 分化率 | 分化苗的状态 |
| 基编号 | (块) | 数 | (％) | |
| D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10 | 60667062606272666590 | 48585056535066605460 | 8087.971.491.790.380.691.790.983.166.7 | 黄绿色、簇生、伸长不好黄绿色、簇生、伸长性稍好不健壮、有黄化苗茁壮、深绿色、簇生深绿色、茁壮、有黄化苗簇生芽数少、茁壮再生芽具畸形(50％)黄绿色、伸长不好、簇生芽少簇生芽多、伸长不好簇生芽较少、分化苗正常 |
说明：接种所用愈伤组织块的大小约10克/鲜重
根据表4的结果发明人建议在本发明中有利分化的BA添加量适宜浓度为0.5-2mg/L，最佳浓度为1.0mg/L，NAA添加量适宜浓度为0.2-2.0mg/L，最佳浓度为0.3mg/L。
Claims (9)
1、一种离体培养日本结缕草的植株再生方法，它包括下列步骤：
a)在含有诱导剂的培养基中培养日本结缕草的成熟种子，将其诱导出愈伤组织；
b)挑选步骤a)得到的状态良好的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上使其增殖；
c)挑选步骤b)得到的状态良好的愈伤组织接种到分化培养基上诱导芽丛，和
d)将步骤c)得到的芽丛转入生根培养基中生根，使其成为完整植株。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中的方法包括挑选黄白色、颗粒状、分散好的愈伤组织接种到长期继代培养基上，使该愈伤组织进行长期继代并保持分化能力。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导剂选自2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄基嘌呤或其组合。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述2，4-D为2-4mg/L，6-BA为0.02-0.05mg/L。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征还在于，愈伤组织诱导培养基为：N6的大量元素，MS的微量元素和有机成分，MS铁盐，水解乳蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2，4-D 2.0-4.0mg/L，6-BA 0.02-0.05mg/L，维生素B15.0mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L，固化琼脂粉8g/L，加水至1L，调pH值为6.0。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，愈伤组织增殖培养基为：MS基本培养基，水解乳蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2，4-D 1.5-2.5mg/L，维生素VB15.0mg/L，AgNO33.0mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L，固化琼脂粉8g/L，加水至1L，调pH值为6.0。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于愈伤组织分化培养基为MS基本培养基，萘乙酸0.3mg/L，6-BA 1.0mg/L，蔗糖30g/L，固化琼脂粉7g/L，加水至1L，pH值为6.0。
8、根据权利要求2所述的方法，愈伤组织长期继代培养基为MS基本培养基，萘乙酸0.3mg/L，激动素0.5mg/L，6-苄基腺嘌呤1.0mg/L，蔗糖30g/L，固化琼脂粉7g/L，加水至1L，调pH值为5.8。
9、根据权利要求1所述的方法，其中的生根培养基为1/2MS基本培养基附加固化琼脂粉7g/L。
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