CN116569842B - 利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法，涉及植物组织培养技术领域。包括将种子接种到萌发培养基上进行暗培养；培养60h后，取暗培养所得无菌萌发种子，去除种皮、根尖、两片子叶及其中间生长点，保留3～5mm大小的胚尖作为外植体；将制备的外植体放入预培养基中进行低温预培养36h；然后将预培养后的外植体转入液体芽诱导培养基中室温振荡培养10min；之后再转入芽诱导培养基中进行芽诱导20d；再之后将长出5～6片叶子的再生植株转入生根培养基中，培养至生根，时间约2周；最终将所得生根良好的植株进行炼苗并移栽移入大田中。本发明利用乌菜胚尖为外植体，结合多种培养基进行组培，有效缩短了组培时间，提高了组培效率。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培技术领域，尤其涉及一种乌菜再生苗的组培方法。
背景技术
乌菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis)属于不结球白菜，是十字花科芸薹属白菜亚种蔬菜，又名乌塌菜、塌塌菜、黑菜等；广泛栽培于我国江淮地区，是冬季主要蔬菜之一，有近千年的栽培历史，是调剂春节前后“冬缺”和“春淡”的理想蔬菜，在推动当地农业经济发展中起到了不可或缺的作用。因其富含维生素，又被称为‘维生素菜’。
随着生物技术的发展，人们愈发重视通过生物技术方法改良作物性状。植物基因工程育种作为高效改良作物性状的前沿技术，已被广泛应用。但植物基因工程依赖高效的组织培养再生体系，植物组织培养再生效率的高低直接决定遗传转化的成功与否。因此，建立高效的组织再生体系，快速获得乌菜再生苗，对利用植物基因工程改良乌菜性状等具有重要意义。
乌菜组织培养再生体系基本分为四大阶段：无菌苗的获得、外植体的切取与预培养、不定芽诱导、生根与驯化成苗等，涉及到不同外植体选择、不同预培养基、不同预培养时间、不同芽诱导培养基、不同生根培养基等。其中，外植体选择、预培养与芽诱导培养基对组织再生成功与否以及再生效率高低等具有较大的影响。前人研究主要以带柄子叶或下胚轴为外植体，建立了再生体系，但这套体系存在再生效率较低、周期时间较长等问题。
现有白菜类蔬菜组织再生方法有：袁家铮，王春明，石丽，于为常，《一种构建小白菜离体再生体系的方法》(申请号：CN201811189960)；朱丽华，《大白菜下胚轴高效离体不定芽再生的研究》(南京农业大学硕士学位论文，2005年)；陈国户,张盛云,袁凌云,朱世东,刘姗,张慧,汪承刚，2017年《乌菜高效离体子叶再生体系的建立》《分子植物育种》；张鲁刚，刘学成，茹磊，李海萍，惠麦侠，张明科，《一种大白菜真叶离体再生培养方法》(申请号201110045595.9)；张鲁刚，范爱丽，武云霞，屈会玲，惠麦侠，张明科，《一种以橙色大白菜子叶段为外植体的离体组织培养方法》(申请号200810232067.2)；刘倩倩，刘维信，《一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法》(申请号201410364506.0)。
上述现有技术存在以下不足：
1、按《一种构建小白菜离体再生体系的方法》，采用子叶为外植体，但操作较繁琐，且使用激素类型较多，不定芽诱导率较低(57.6％)，再生芽中畸形芽比例较高，未建立高效再生体系。
2、按《大白菜下胚轴高效离体不定芽再生的研究》，建立了大白菜下胚轴再生体系，但只对激素以及外植体相关因素进行优化，不定芽再生时间约3周时间。
3、按《乌菜高效离体子叶再生体系的建立》，采用子叶外植体获得了较高的再生效率，不定芽诱导率可达85.56％，但其再生时间超过4周，周期较长，且平均每外植体再生不定芽数较低(5.36)。
4、按《一种大白菜真叶离体再生培养方法》，利用白菜真叶进行再生；按《一种以橙色大白菜子叶段为外植体的离体组织培养方法》，以白菜子叶段为外植体进行再生；《一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法》，以白菜球叶为外植体进行离体再生；这类方法虽成功建立了组织培养再生体系，但操作繁琐、培养周期较长，工作量较大。
以上几种白菜类蔬菜组培方法的共性在于：外植体选择以子叶、下胚轴、真叶等为外植体，不定芽再生时间较长、部分方法体系再生率较低，短时间不能获得大量再生苗，且优化的因素不全面。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法，以克服现有技术中乌菜组培效率较低、周期较长的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
提供一种利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1、获取无菌种子；
步骤2、将步骤1所得无菌种子接种到萌发培养基上进行暗培养；
步骤3、取暗培养所得萌发种子，并去除种皮、根尖、两片子叶及其中间生长点，保留3～5mm大小的胚尖作为外植体；
步骤4、将所得外植体放入预培养基中进行低温预培养；
步骤5、将低温预培养后的外植体转入液体芽诱导培养基中短时振荡培养；其中，培养时长为10min，温度为室温，摇床转速为180rpm；液体芽诱导培养基成分为：MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2mg/L异戊烯基腺嘌呤，pH＝5.8；
步骤6、将振荡培养后的外植体转入芽诱导培养基中进行芽诱导；
步骤7、将步骤6所得再生植株中长出5～6片叶子的再生植株转入生根培养基中，培养至生根；
步骤8、将步骤7所得生根良好的植株进行炼苗后移栽至大田中。
进一步，所述步骤2具体为：
将步骤1所得无菌种子接种至萌发培养基内进行60h的暗培养，其中，萌发培养基的组成为：MS+3％蔗糖+1.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂，pH＝5.8，暗培养培养条件为：昼夜温度为24/18℃，湿度为80％。
进一步，所述步骤4具体为：
将所得外植体放入预培养基中进行36h的低温预培养；其中，培养条件为昼夜温度为18/12℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％；预培养基的组成为：MS+3％蔗糖+2mg/L 6-BA+0.4mg/L 2,4-D+0.8％琼脂，pH＝5.8。
进一步，所述步骤6中芽诱导培养基组成为：MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH＝5.8，培养时长为20d，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。
进一步，步骤7培养时长为2周，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％；生根培养基组成为：MS+3％蔗糖+1.0mg/LIBA+0.8％琼脂，pH＝5.8。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明提供的方法，通过利用胚尖外植体可快速高效获得乌菜再生苗，显著缩短了白菜类蔬菜组织培养再生时间。
2、利用胚尖外植体，在芽诱导阶段之前进行短时振荡培养，可显著提高不定芽诱导效率及单个外植体不定芽数。
3、乌菜胚尖外植体组织再生，较子叶柄、下胚轴等外植体组织再生，有较短的再生时间、较高的再生效率，操作简单，可大量节省人力、物力。
4、提供了一种白菜类蔬菜新的组织再生方案，能够短时间内获得大量的再生苗，且具有更高效的再生效率，为乌菜遗传转化体系的研究奠定坚实的基础。
说明书附图
图1为实施例提供的利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法的流程图；
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例以乌菜‘黄心乌’为材料对本发明提出的方法进行验证。
首先参考图1，本发明提供的方法具体包括以下步骤：
挑选种粒饱满、大小一致的‘黄心乌’种子，将种子用无菌水清洗两遍，用70％酒精移液枪吹打消毒30s，然后用2％次氯酸钠摇晃浸泡15min，再用无菌水清洗5～6遍，放在无菌滤纸上吹干；
(1)无菌苗的制备：用无菌镊子将种子接种到萌发培养基(MS+3％蔗糖+1.0mg/L6-BA+0.8％琼脂，pH＝5.8)上进行暗培养，昼夜温度为24/18℃，湿度为80％；
(2)胚尖外植体制备：60h后，取暗培养所得无菌苗，用手术刀将萌发的种子去除种皮、根尖及两片子叶，并去除两片子叶中间的生长点，保留3～5mm左右的胚尖作为外植体；
(3)胚尖外植体预培养：将制备的外植体放入预培养基(MS+3％蔗糖+2mg/L 6-BA+0.4mg/L 2,4-D+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行低温预培养36h，昼夜温度为18/12℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％；
(4)不定芽诱导培养1：将预培养后的外植体转入液体芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2mg/L异戊烯基腺嘌呤，pH＝5.8)中室温振荡培养10min；
(5)不定芽诱导培养2：将液体培养后的外植体转入芽诱导培养基(MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH＝5.8)中进行芽诱导约20d，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。
(6)生根培养：将步骤5中长出5～6片叶子的再生植株转入生根培养基(MS+3％蔗糖+1.0mg/L IBA+0.8％琼脂，pH＝5.8)中，培养至生根，时间约2周，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％；
最后将生根良好的植株进行炼苗与移栽移入大田中。
为了表明通过上述方法培养所得再生苗，组培周期短，效率高，本发明还提供以下具体实施例；其中，在以下具体实施例中，每个实施例处理接种不少于30个外植体并进行3次重复。
实施例一：萌发培养基组分及培养时长对外植体不定芽诱导的影响分析
①萌发培养基成分对胚尖外植体不定芽诱导的影响
挑选种粒饱满、大小一致的‘黄心乌’种子，将种子用无菌水清洗两遍，用70％酒精移液枪吹打消毒30s，然后用2％次氯酸钠摇晃浸泡15min，再用无菌水清洗5～6遍，放在无菌滤纸上吹干，然后用无菌镊子将种子接种至添加不同浓度6-BA的种子萌发培养基(MS+3％蔗糖+0～2.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂，pH＝5.8)上，在昼夜温度为24/18℃的条件下进行暗培养。
暗培养72h后得到无菌苗，用手术刀将无菌苗去除种皮、根尖及两片子叶，并去除两片子叶中间的生长点，切取3～5mm左右的胚尖，置于芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行芽诱导，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。每组处理接种不少于30个外植体并进行3次重复，观察不定芽诱导率以及外植体平均再生不定芽数，分析种子萌发培养基对不定芽诱导的影响。
表一：种子萌发培养基成分对胚尖外植体不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表一可以发现，当种子萌发培养基为添加1mg/L 6-BA时，不定芽诱导率达到36.00％，外植体平均不定芽数到1.73个。后续试验选择该浓度6-BA的种子萌发培养基(MS+3％蔗糖+1.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂，pH＝5.8)上进行。
②种子萌发时间对胚尖外植体不定芽诱导的影响
取暗培养时长不同无菌苗(暗培养所用萌发培养基为①所确定的萌发培养基)，切取胚尖外植体接种于芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行芽诱导，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。每组处理接种不少于30个外植体并进行3次重复。观察不定芽诱导率以及外植体平均再生不定芽数，分析无菌苗的苗龄对胚尖外植体不定芽诱导的影响。
表二：外植体苗龄对胚尖不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表二可知，不同无菌苗的苗龄对不定芽诱导率及外植体平均不定芽数有显著影响，60h苗龄的无菌苗不定芽诱导率最高，为47.33％，且外植体平均再生不定芽数最多，为4.40个。后续试验选择60h苗龄的无菌苗进行。
实施例二：预培养对胚尖外植体不定芽诱导的影响分析
本实施例首先通过挑选种粒饱满、大小一致的‘黄心乌’种子，将种子用无菌水清洗两遍，用70％酒精移液枪吹打消毒30s，然后用2％次氯酸钠摇晃浸泡15min，再用无菌水清洗5～6遍，放在无菌滤纸上吹干，获得无菌种子；然后用无菌镊子将无菌种子接种到萌发培养基(MS+3％蔗糖+1.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂，pH＝5.8)上进行暗培养，昼夜温度为24/18℃，湿度为80％；60h后，取暗培养所得无菌苗，用手术刀将萌发的种子去除种皮、根尖及两片子叶，并去除两片子叶中间的生长点，保留3～5mm左右的胚尖作为外植体，获得外植体。
然后对所得外植体进行以下分析。
①预培养基组分及培养时间对胚尖外植体不定芽诱导的影响分析
将所得外植体分为多组，并分别接种于不同浓度的6-BA及2,4-D组合的预培养基(MS+3％蔗糖+1.5～2.5mg/L 6-BA+0.2～0.6mg/L 2,4-D+0.8％琼脂，pH值为5.8)上预培养24～48h，昼夜温度为18/12℃，昼夜时间为18/6h，光照强度为3000Lx，湿度为80％。
预培养结束后，再转移至芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行芽诱导，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。每组处理接种不少于30个外植体并进行3次重复。观察不定芽诱导率以及外植体平均再生不定芽数，分析预培养成分及预培养时间对胚尖外植体不定芽诱导的影响。
表三：预培养基成分及预培养时间对胚尖外植体不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表三可知，预培养基中不同浓度的6-BA、2,4-D以及不同预培养时间对不定芽诱导率及外植体平均不定芽数有显著影响，预培养基中6-BA浓度为2.0mg/L、2,4-D浓度为0.4mg/L，预培养36h时的不定芽诱导率最高，为66.17％，且在该培养条件下的平均每外植体再生不定芽数为5.93个。后续试验选择MS+3％蔗糖+2.0mg/L 6-BA+0.4mg/L 2,4-D+0.8％琼脂，pH值为5.8的预培养基进行。
②预培养温度对胚尖外植体不定芽诱导的影响
将所得外植体接种于预培养基(MS+3％蔗糖+2.0mg/L 6-BA+0.4mg/L2,4-D+0.8％琼脂，pH值为5.8)上，分成两组，分别于昼夜温度为18/12℃和24/18℃两种温度条件下进行预培养36h；昼夜时间均为18/6h，光照强度均为3000Lx，湿度均为80％。
预培养结束后，再转移至芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行芽诱导，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。每组处理接种不少于30个外植体并进行3次重复。观察不定芽诱导率以及外植体平均再生不定芽数，分析预培养温度对胚尖外植体不定芽诱导的影响。
表四：预培养温度对胚尖外植体不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表四可知，预培养阶段温度较低时的不定芽诱导率显著高于室温时的不定芽诱导率，且平均每外植体不定芽数也显著高于室温。后续试验选择低温进行预培养。
实施例三：不定芽诱导培养对胚尖外植体不定芽诱导的影响分析
本实施例首先通过挑选种粒饱满、大小一致的‘黄心乌’种子，将种子用无菌水清洗两遍，用70％酒精移液枪吹打消毒30s，然后用2％次氯酸钠摇晃浸泡15min，再用无菌水清洗5～6遍，放在无菌滤纸上吹干，获得无菌种子；然后用无菌镊子将无菌种子接种到萌发培养基(MS+3％蔗糖+1.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂，pH＝5.8)上进行暗培养，昼夜温度为24/18℃，湿度为80％；60h后，取暗培养所得无菌苗，用手术刀将萌发的种子去除种皮、根尖及两片子叶，并去除两片子叶中间的生长点，保留3～5mm左右的胚尖作为外植体，获得外植体；将制备的外植体放入预培养基(MS+3％蔗糖+2mg/L 6-BA+0.4mg/L 2,4-D+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行低温预培养36h，昼夜温度为18/12℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％；最终获得预培养后的外植体，并利用预培养后的外植体进行以下分析。
①芽诱导培养基成分对胚尖外植体不定芽诱导的影响
将预培养后的外植体分为多组，将多组预培养后的外植体分别转入含不同浓度6-BA、NAA、异戊烯基腺嘌呤的芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.5～1.0mg/L6-BA+0.1～0.3mg/LNAA+0～3mg/L异戊烯基腺嘌呤+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行芽诱导培养，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。每个处理进行三次重复，每次重复不少于30个外植体。培养20d后不定芽发生，统计外植体不定芽诱导率。
表五：不同激素组合对胚尖不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表五可以看出，不同6-BA、NAA、异戊烯基腺嘌呤组合具有不同不定芽诱导率，当6-BA浓度为0.8mg/L、NAA浓度为0.2mg/L时不定芽诱导率最高，且当异戊烯基腺嘌呤为2.0mg/L或0mg/L时芽诱导率无显著差异，说明诱导培养基2中添加异戊烯基腺嘌呤对乌菜胚尖不定芽诱导率无显著影响。后续试验选择MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂，pH值为5.8的芽诱导培养基进行不定芽诱导。
②液体短时培养对胚尖外植体不定芽诱导的影响
将多组预培养后的外植体转入液体芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+2mg/L异戊烯基腺嘌呤，pH＝5.8)分别室温振荡培养0～20min，转速180rpm；然后转入芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行芽诱导，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。每个处理进行三次重复，每次重复不少于30个外植体。培养20d后不定芽发生，统计外植体不定芽诱导率。
表六：液体培养基培养时间对胚尖不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表六可以看出经液体芽诱导培养基培养10min时，胚尖外植体不定芽诱导率最高(90.47％)，并且在该组合下平均每外植体再生不定芽数为8.77个。显著高于未经过液体培养基诱导(48.53％；表六)，及在含有异戊烯基腺嘌呤的固体芽诱导培养基中的诱导率(73.67％；表五)。
后续试验选择将预培养后的外植体，经过液体芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2mg/L异戊烯基腺嘌呤，pH＝5.8)室温振荡培养10min，再转入芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行不定芽芽诱导。
实施例四：生根培养基组分对再生植株生根的影响分析
本实施例首先通过挑选种粒饱满、大小一致的‘黄心乌’种子，将种子用无菌水清洗两遍，用70％酒精移液枪吹打消毒30s，然后用2％次氯酸钠摇晃浸泡15min，再用无菌水清洗5～6遍，放在无菌滤纸上吹干，获得无菌种子；然后用无菌镊子将无菌种子接种到萌发培养基(MS+3％蔗糖+1.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂，pH＝5.8)上进行暗培养，昼夜温度为24/18℃，湿度为80％；60h后，取暗培养所得无菌苗，用手术刀将萌发的种子去除种皮、根尖及两片子叶，并去除两片子叶中间的生长点，保留3～5mm左右的胚尖作为外植体，获得外植体；将制备的外植体放入预培养基(MS+3％蔗糖+2mg/L 6-BA+0.4mg/L 2,4-D+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行低温预培养36h，昼夜温度为18/12℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％；获得预培养后的外植体，将预培养后的外植体先转入液体芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2mg/L异戊烯基腺嘌呤，pH＝5.8)中室温振荡培养10min；然后将液体培养后的外植体转入芽诱导培养基(MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH＝5.8)中进行芽诱导约20d，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。
将上述所得再生植株中长出5～6片叶子的再生植株分为多组，分别接种到含有一定浓度IBA的生根培养基中进行生根诱导。所选择培养基为MS+3％蔗糖+0.5～1.5mg/L IBA+0.8％琼脂，PH值为5.8，进而确定植株生根培养基的最佳配方。昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。
表七：不同IBA浓度对胚尖不定芽生根的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表七可以看出，IBA浓度为1.0mg/L时的生根率最高，最高为94.73％。后续试验生根培养基均选择含1.0mg/L IBA的MS培养基进行生根。
综上所述，将无菌种子置于萌发培养基(MS+3％蔗糖+1.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂，pH＝5.8)中暗培养，昼夜温度为24/18℃，湿度为80％。取培养60h无菌萌发种子的胚尖，于预培养基(MS+3％蔗糖+2mg/L 6-BA+0.4mg/L2,4-D+0.8％琼脂，pH＝5.8)中低温预培养36h，昼夜温度为18/12℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。预培养结束后，将外植体置于液体芽诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2mg/L异戊烯基腺嘌呤，pH＝5.8)中室温振荡培养10min；立即转入芽诱导培养基(MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH＝5.8)中进行芽诱导。乌菜胚尖再生率高达90.47％，且平均每外植体再生不定芽数为8.77个。然后将再生苗移入生根培养基(MS+3％蔗糖+1.0mg/L IBA+0.8％琼脂，pH＝5.8)中进行生根诱导，生根效率可达94.72％，最后进行炼苗移栽，成活率可在90％以上。
实施例五不同乌菜基因型材料胚尖组织培养效率比较
利用实施例四所得乌菜胚尖再生体系，采用4个乌菜代表性品种进行胚尖再生，比较各品种的再生率和不定芽数。结果如表七所示。
表八：不同品种乌菜胚尖再生效率比较
由表八可以看出不同基因型材料利用胚尖外置体进行再生培养，均获得了较高的不定芽再生效率及外植体平均再生不定芽数，表明该乌菜胚尖再生体系可以用于其它基因型材料。
为了进行胚尖与下胚轴等组培优劣的比较，进行以下实验。
对比例一利用下胚轴组织培养快速获得乌菜再生苗的方法
步骤(1)外植体材料的制备
挑选种粒饱满、大小一致的黄心乌种子，将种子用无菌水清洗两遍，用70％酒精移液枪吹打消毒30s，然后用2％次氯酸钠摇晃浸泡15min，再用无菌水清洗5～6遍，放在无菌滤纸上吹干，用无菌镊子将种子直接接种到含有0～2mg/L6-BA的MS培养基(3％蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)上，在昼夜温度为24/18℃的条件下进行暗培养。取4d苗龄的下胚轴，置于含5mg/L 6-BA的MS培养基中预培养2d，然后转入含3mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L异戊烯基腺嘌呤的MS培养基中进行芽诱导培养，观察不定芽诱导率以及外植体平均再生不定芽数，分析种子发芽培养基对下胚轴不定芽诱导的影响。每组处理接种不少于30个外植体并进行3次重复。其中MS培养基中添加3％蔗糖，0.8％琼脂，pH值为5.8，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度为3000Lx，湿度为80％。
表九：种子发芽培养基对下胚轴不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表九可以发现，当种子发芽培养基为添加1.0mg/L 6-BA的MS培养基时，不定芽诱导率达到22.67％，但不同6-BA浓度的外植体平均不定芽数无显著差异。后续试验选择含有1.0mg/L 6-BA为种子发芽培养基。
步骤(2)下胚轴外植体预培养
取步骤(1)中获得的4d苗龄的无菌苗，用手术刀切取3～5mm左右的下胚轴，将下胚轴接种于MS+2～6mg/L 6-BA+0.2～0.6mg/L 2,4-D培养基上培养24～48h，然后转入含3mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L异戊烯基腺嘌呤的MS培养基中进行培养，观察不定芽诱导率以及外植体平均再生不定芽数，研究预培养对下胚轴不定芽诱导的影响。每组处理接种不少于30个外植体并进行3次重复。其中MS培养基中添加3％蔗糖，0.8％琼脂，PH值为5.8，昼夜温度为18/12℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度为3000Lx，湿度为80％。
表十：预培养对下胚轴不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表十可以发现，预培养对乌菜下胚轴不定芽诱导率的影响，预培养6-BA浓度为4mg/L、2,4-D浓度为0.4mg/L、预培养36h时，不定芽诱导率最高，最高为39.13％，平均每外植体再生不定芽数为3.00个。后续试验选择6-BA浓度为4mg/L、2,4-D浓度为0.4mg/L，预培养36h进行。
步骤(3)下胚轴外植体不定芽诱导
进一步将步骤(2)中预培养后的下胚轴转入含0～1.0mg/L 6-BA+0～1.0mg/L NAA+0～3mg/L异戊烯基腺嘌呤的MS培养基中，每个处理进行三次重复，每次重复不少于30个外植体，进行不定芽诱导的研究。培养35d后不定芽发生，统计外植体诱导率。
表十一：不同激素组合对下胚轴诱导不定芽的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表十一可知，不同激素组合对下胚轴诱导不定芽的影响较大，当异戊烯基腺嘌呤浓度为0mg/L时，不定芽诱导率显著降低，说明异戊烯基腺嘌呤能够显著提高乌菜下胚轴再生效率。当6-BA浓度为1.0mg/L、NAA浓度为0.5mg/L、异戊烯基腺嘌呤为1.0mg/L时芽诱导率最高，最高为45.73％，并且在该组合下平均每外植体再生不定芽数为3.23个。后续试验选择6-BA浓度为1.0mg/L、NAA浓度为0.5mg/L、异戊烯基腺嘌呤浓度为1.0mg/L的芽诱导培养基进行。
(4)不定芽生根培养
生根、炼苗及移栽方法同胚尖。
综合以上优化条件，将无菌种子置于含有1.0mg/L 6-BA的MS培养基中培养，取4d无菌苗切取3～5mm左右的下胚轴，于含有4mg/L 6-BA、0.4mg/L 2,4-D的MS培养基中低温预培养36h，再转入含有1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、1.0mg/L异戊烯基腺嘌呤的MS培养基中培养，乌菜下胚轴再生效率可达到45.73％，且平均每外植体再生不定芽数为3.23个。
为了进行胚尖与子叶-子叶柄组培优劣的比较，进行以下实验。
对比例二利用子叶-子叶柄组织培养快速获得乌菜再生苗的方法
步骤(1)外植体材料的制备
挑选种粒饱满、大小一致的黄心乌种子，将种子用无菌水清洗两遍，用70％酒精移液枪吹打消毒30s，然后用2％次氯酸钠摇晃浸泡15min，再用无菌水清洗5～6遍，放在无菌滤纸上吹干，用无菌镊子将种子直接接种到含有0～2mg/L6-BA的MS培养基(3％蔗糖，0.8％琼脂，pH＝5.8)上在昼夜温度为24/18℃的条件下进行暗培养。取4d苗龄的子叶-子叶柄，置于含3.0mg/L 6-BA的MS培养基中预培养2d，然后转入含2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L异戊烯基腺嘌呤的MS培养基中进行培养，观察不定芽诱导率以及外植体平均再生不定芽数，分析种子发芽培养基对子叶-子叶柄不定芽诱导的影响。每组处理接种不少于30个外植体并进行3次重复。其中MS培养基中添加3％蔗糖，0.8％琼脂，PH值为5.8，昼夜温度为18/12℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度为3000Lx，湿度为80％。
表十二：种子发芽培养基对子叶-子叶柄不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表十二可以发现，当种子发芽培养基为添加1mg/L 6-BA的MS培养基时，不定芽诱导率达到44.90％，外植体平均不定芽数到2.30个。后续试验选择含有1.0mg/L 6-BA为种子发芽培养基。
步骤(2)子叶-子叶柄外植体预培养
将步骤(1)中获得的4d苗龄的无菌苗，用手术刀切取带有1～2mm左右子叶柄的子叶外植体，将子叶-子叶柄接种于MS+2～6mg/L 6-BA+0.2～0.6mg/L2,4-D的培养基上培养24～48h，然后转入含2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+1.0mg/L异戊烯基腺嘌呤的MS培养基中进行培养，观察不定芽诱导率以及外植体平均再生不定芽数，分析预培养对不定芽诱导的影响。每组处理接种不少于30个外植体并进行3次重复。
表十三：预培养对子叶-子叶柄不定芽诱导的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表十三可以发现，预培养对乌菜子叶-子叶柄不定芽诱导率的影响，预培养6-BA浓度为4mg/L、2,4-D浓度为0.4mg/L预培养36h时，不定芽诱导率最高，最高为53.73％，不定芽数可达4.27个。后续试验选择6-BA浓度为4mg/L、2,4-D浓度为0.4mg/L，预培养36h进行。
步骤(3)子叶-子叶柄外植体芽诱导培养
进一步将步骤(2)中预培养后的子叶-子叶柄转入含0～1.0mg/L 6-BA+0～1.0mg/L NAA+0～3mg/L异戊烯基腺嘌呤的MS培养基中，每个处理进行三次重复，每次重复不少于30个外植体，进行不定芽诱导的研究。培养30d后不定芽发生，统计外植体诱导率。
为了提高子叶-子叶柄的再生效率，获得更多的再生苗，将上述分化出不定芽的子叶-子叶柄进行继代培养，继代培养基为MS+0.5mg/L GA3。其中，MS培养基中添加3％蔗糖，0.8％琼脂，PH值为5.8，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％。
表十四：不同激素组合对子叶-子叶柄诱导不定芽的影响
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表十四可知，不同激素组合对子叶-子叶柄不定芽诱导的影响较大，当异戊烯基腺嘌呤浓度为0mg/L时，不定芽诱导率显著降低，说明异戊烯基腺嘌呤能够显著提高乌菜子叶-子叶柄的再生效率。当6-BA浓度为1.0mg/L、NAA浓度为0.5mg/L、异戊烯基腺嘌呤浓度为1.0mg/L时芽诱导率最高，最高为66.47％，并且在该组合下平均每外植体再生不定芽数为5.07个。后续试验选择6-BA浓度为1.0mg/L、NAA浓度为0.5mg/L、异戊烯基腺嘌呤浓度为1.0mg/L的芽诱导培养基进行。
(4)子叶-子叶柄外植体生根
生根与炼苗与移栽方法同胚尖。
综合以上优化条件，将种子置于含有1.0mg/L6-BA的MS培养基中培养，取4天无菌苗切取子叶-子叶柄，于含有4.0mg/L 6-BA、0.4mg/L 2,4-D的MS培养基中低温预培养36h，再转入含有1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、1.0mg/L异戊烯基腺嘌呤的MS诱导培养基中培养，乌菜子叶-子叶柄再生效率为66.47％，且平均每外植体再生不定芽数为5.07个。
根据实施例一至四、对比例一和对比例二，对各方法的再生率、外植体平均再生不定芽数及不定芽诱导时间等进行比较，结果如表十五所示。
表十五：乌菜不同外植体再生效率比较
不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
由表十五可以看出，乌菜三种外植体再生效率中胚尖的再生效率最高，可达到90.47％，且平均每外植体再生不定芽数也是最多的，子叶-子叶柄再生效率次之，为66.47％，下胚轴再生效率最差，再生率为45.73％。另外发现三种外植体中胚尖的再生时间较短，20天即可诱导出再生芽，而下胚轴和子叶-子叶柄则需要较长的时间才可以诱导不定芽分化，说明胚尖为乌菜再生体系最佳外植体类型。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1、获取无菌种子；
步骤2、将步骤1所得无菌种子接种至萌发培养基内进行60h的暗培养，其中，萌发培养基的组成为：MS+3％蔗糖+1.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂，pH＝5.8，暗培养培养条件为：昼夜温度为24/18℃，湿度为80％；
步骤3、取暗培养所得萌发种子，并去除种皮、根尖、两片子叶及其中间生长点，保留3～5mm大小的胚尖作为外植体；
步骤4、将所得外植体放入预培养基中进行36h的低温预培养；其中，培养条件为昼夜温度为18/12℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％；预培养基的组成为：MS+3％蔗糖+2mg/L 6-BA+0.4mg/L 2,4-D+0.8％琼脂，pH＝5.8；
步骤5、将低温预培养后的外植体转入液体芽诱导培养基中短时振荡培养；其中，培养时长为10min，温度为室温，摇床转速为180rpm；液体芽诱导培养基成分为：MS+3％蔗糖+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2mg/L异戊烯基腺嘌呤，pH＝5.8；
步骤6、将振荡培养后的外植体转入芽诱导培养基中进行芽诱导；芽诱导培养基组成为：MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH＝5.8，培养时长为20d，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％；
步骤7、将步骤6所得再生植株中长出5～6片叶子的再生植株转入生根培养基中，培养至生根；培养时长为2周，昼夜温度为24/18℃，昼夜光照时间为16/8h，光照强度3000Lx，湿度为80％；生根培养基组成为：MS+3％蔗糖+1.0mg/L IBA+0.8％琼脂，pH＝5.8；
步骤8、将步骤7所得生根良好的植株进行炼苗后移栽至大田中。
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| CN111727885A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-10-02 | 华南农业大学 | 一种高频菜心离体组织培养方法 |
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2023
- 2023-06-08 CN CN202310675627.6A patent/CN116569842B/zh active Active
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|---|---|---|---|---|
| CN111727885A (zh) * | 2020-07-22 | 2020-10-02 | 华南农业大学 | 一种高频菜心离体组织培养方法 |
Non-Patent Citations (1)
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| 乌菜高效离体子叶再生体系的建立;陈国户等;《分子植物育种》;第15卷(第4期);第1466-1472页 * |
Also Published As
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| CN116569842A (zh) | 2023-08-11 |
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