CN115413578B - 一种利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，包括如下步骤，S1、外植体灭菌：取未成熟杂交种子内未发育成熟的胚或/和子叶作为外植体，接入胚拯救培养基中；S2、胚性愈伤组织诱导；S3、胚性愈伤组织增殖及体细胞胚胎分化：将胚性愈伤组织接种于增殖培养基中，分化出不易剥离子叶形胚的胚性材料；S4、成熟和萌发：将胚性材料接种于萌发培养基中，培养形成炼苗材料；S5、炼苗或生根：将炼苗材料培养得到组培苗；S6、移栽：将组培苗培养得到山茶花新品种幼苗；本申请采用未成熟杂交种子的胚或/和子叶作为外植体，培养得到山茶花新品种幼苗，避免了因种子败育或播种育苗失败造成的新品种种质资源流失。

Description

一种利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法

技术领域

本发明涉及茶花繁殖技术领域，具体涉及一种利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法。

背景技术

山茶花为我国传统十大名花之一，目前山茶花新品种培育多采用传统杂交育种，对特定品种的繁殖多采用扦插、嫁接等方法。在传统杂交育种中，必须选取饱满、无病虫害的成熟杂交种子进行播种育苗；然而，受气候变化、亲本结实能力等因素的影响，部分山茶花品种杂交后种子很难自然发育成熟，无法进行播种育苗，这给山茶花的杂交育种造成很大困难；而且，这种杂交后产生的未成熟种子中可能蕴含了大量的新品种种质资源，现有技术中，该部分未成熟的种子常作为自然选择的结果，被扔掉或在传统育苗过程中腐烂坏死，这在很大程度上造成了山茶花新品种种质资源的流失。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法。

本发明所采用的技术方案是：一种利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，包括如下步骤，

S1、外植体灭菌：选取种皮完整未开裂的黑褐色未成熟杂交种子，灭菌处理后，取出未成熟杂交种子内未发育成熟的胚或/和子叶作为外植体，接入胚拯救培养基中进行培养；

S2、胚性愈伤组织诱导：将步骤S1拯救成活的外植体接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，诱导形成胚性愈伤组织；

S3、胚性愈伤组织增殖及体细胞胚胎分化：将胚性愈伤组织接种于增殖培养基中培养，分化出不易剥离子叶形胚的胚性材料；

S4、成熟和萌发：将步骤S3分化出的不易剥离子叶形胚的胚性材料先接种于成熟培养基中，培养后，再将其接种于萌发培养基中，培养形成具有茎段、顶芽和功能叶的炼苗材料；

S5、炼苗或生根：将步骤S4培养得到的炼苗材料接种于培养基质中，培养得到能够主动吸收营养的组培苗；

S6、移栽：将生长健壮的组培苗种植于草炭土和珍珠岩的混合基质中培养，得到山茶花新品种幼苗。

进一步，所述步骤S4具体为：

将不易剥离子叶形胚的胚性材料接种于成熟培养基中，培养2-3个月后，形成胚根连接生长的体细胞胚丛；将该体细胞胚丛切分为单个胚，接种于萌发培养基中，培养1-2个月后，培养得到具有茎段、顶芽和功能叶的炼苗材料。

进一步，所述炼苗材料为具有1个肉质根的幼苗或/和无根的芽。

进一步，所述培养基质为疏松多孔无菌基质，基质：水的质量体积比为1:2.5～3。

进一步，所述步骤S5中，所述培养基质中还添加有NAA，所述NAA的含量为0～0.5mg·L^-1。

进一步，当所述炼苗材料为具有完整根和芽的幼苗时，所述NAA的添加量为0。

进一步，当所述炼苗材料为芽或茎段生长旺盛而根系长势较差的幼苗时，所述NAA的添加量为0.5mg·L^-1。

进一步，所述步骤S5的培养过程在无菌环境下进行，具体培养环境为：光照时间为16h·d^-1，暗培养为8h·d^-1，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，温度为(25±2)℃。

进一步，所述步骤S6具体为，

将生长健壮组培苗种植于V_草炭土：V_珍珠岩为1:1或1:2的基质中，其中基质的pH值为5.9～7.0，1个月后，顶芽抽梢，根尖伸长生长，同时喷施NPK比例为1:1:1的水溶肥，促进组培苗壮苗生长。移栽期间，温度为17-26℃，相对空气湿度不低于90％。

进一步，所述步骤S1具体为，

在无菌条件下，将未成熟种子置于无菌三角瓶中，用75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗3-5次；然后用15％的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗3-5次；灭菌完成后，剪破种皮，取出未发育成熟的胚或/和子叶作为外植体，将上述外植体接入胚拯救培养基中进行培养。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的步骤或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各步骤或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本申请实施例提供的灭菌后的未成熟杂交种子图；

图2为本申请实施例提供的胚拯救成活的未成熟杂交种子图；

图3为本申请实施例提供的体细胞胚胎的诱导图；

图4为本申请实施例提供的体细胞胚胎增殖图；

图5为本申请实施例提供的体细胞胚胎萌发图；

图6为本申请实施例提供的炼苗成活的幼苗图；

图7为本申请实施例提供的移栽成活的幼苗图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

本申请提供了一种利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法。

其中，未成熟杂交种子是指人工杂交授粉后自然生长形成的未成熟种子，具有嫩白色鲜活的子叶形胚和胚乳，但受自然环境或杂交亲和力影响，子叶形胚或者胚乳无法进一步发育至成熟状态，无法在传统育苗方法下萌发成苗。

新品种是指经过人工杂交授粉获得的，可能与杂交亲本有明显不同表现特征的新材料。

本申请方法适用于采用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗，以解决现有山茶花杂交育种技术中种子败育、无法播种育苗的问题。

下面对该方法的具体步骤进行详细说明，该方法具体包括如下步骤，

S1、外植体灭菌

选取种皮完整未开裂的黑褐色未成熟杂交种子，灭菌处理后，取出未成熟杂交种子内未发育成熟的胚和子叶，接入胚拯救培养基中。

具体的，在无菌条件下，将上述未成熟种子置于无菌三角瓶中，用75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗3-5次；然后用15％的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗3-5次。

灭菌完成后，剪破种皮，取出未发育成熟的胚或/和子叶作为外植体，将上述外植体接入胚拯救培养基中进行培养。灭菌后的未成熟杂交种子如图1所示，胚拯救成活的未成熟杂交种子如图2所示。

本申请外植体为未成熟杂交种子的胚或/和子叶，受自然环境或杂交亲和力影响，未成熟杂交种子无法发育成熟，本申请先将其接入胚拯救培养基中进行培养，救活后再进行胚性愈伤组织诱导成苗，大大提高了培养成功率。

具体的，胚拯救培养基的组成为：MS培养基+BA 0.5～1mg·L^-1+NAA 0.05～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

其中，BA的中文名称为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为萘乙酸，本申请通过在MS培养基中添加BA和NAA，在人工营造的培养环境下，促进未成熟杂交种子的进一步生长，期间胚和子叶的颜色由嫩白色逐渐转变为深绿色。

S2、胚性愈伤组织诱导

将外植体接入胚拯救培养基中培养2周后，将拯救成活的外植体接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，1-3个月后，诱导形成胚性愈伤组织，诱导时间长短视外植体而定，差异较大。体细胞胚胎的诱导如图3所示。

具体的，诱导培养基的组成为：MS培养基+BA 0.5～2mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

S3、胚性愈伤组织增殖及体细胞胚胎分化

将胚性愈伤组织接种于增殖培养基中，逐渐分化出处于不同发育阶段的体细胞胚胎；成簇状或团状生长，在未成熟胚上分化出大量次生胚。体细胞胚胎增殖如图4所示。

具体的，增殖培养基的组成为：MS培养基+BA 0～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

S4、成熟和萌发

将步骤S3分化出的不易剥离子叶形胚的胚性材料接种于成熟培养基中，培养2-3个月后，再将其接种于萌发培养基中，培养形成具有茎段、顶芽和功能叶的炼苗材料，如图5所示。

步骤S3中，胚性愈伤组织在增殖培养基中培养4周后，根据体细胞胚胎的发育状态，可分为易于剥离单个或多个簇生的子叶形胚和不易剥离子叶形胚的胚性材料，受培养材料差异影响较大。易于剥离单个或多个簇生的子叶形胚和不易剥离子叶形胚的胚性材料均可培养形成具有茎段、顶芽和功能叶的炼苗材料。

炼苗材料可以是仅具有茎段、顶芽和功能叶，但没有根的芽，也可以是同时具有茎段、顶芽和功能叶，并具有1个肉质根、无须根的幼苗。

对于易于剥离单个或多个簇生的子叶形胚，直接将其接种于萌发培养基中进行萌发培养，形成幼苗。

具体的，将易于剥离单个或多个簇生的子叶形胚接种于萌发培养基中，培养1个月后，将簇生在一起的体细胞胚丛切分为单个胚；继续培养1-2个月后，体细胞胚胎的胚根伸长生长形成1个肉质根，无须根；胚芽伸长生长形成茎段和顶芽，并具有3-4片功能叶。

对于不易剥离子叶形胚的胚性材料，先将其接种于成熟培养基中，培养2-3个月后，再将其接种于萌发培养基中进行萌发培养，形成幼苗。

具体的，将不易剥离子叶形胚的胚性材料接种于成熟培养基中，培养2-3个月后，形成胚根连接生长的体细胞胚丛；将该体细胞胚丛切分为单个胚，接种于萌发培养基中，培养1-2个月后，体细胞胚胎的胚根伸长生长形成1个肉质根，无须根；胚芽伸长生长形成茎段和顶芽，并具有3-4片功能叶。

其中，成熟培养基的组成为：1/2MS培养基+ABA 0.1～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

萌发培养基的组成为：1/2MS培养基+NAA 0～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

S5、炼苗或生根

将步骤S4培养得到的炼苗材料接种于培养基质中，在无菌条件下培养，逐渐培养炼苗材料对营养的主动吸收功能，逐渐恢复根系对营养的主动吸收功能，培养1个月后，得到组培苗。

其中，培养基质为疏松多孔无菌基质，基质：水的质量体积比为1:2.5～3。

上述培养过程为无菌环境下，具体培养环境为：光照时间为16h·d^-1，暗培养为8h·d^-1，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，温度为(25±2)℃。

在培养时，根据炼苗材料的情况，还可以在生根基质中添加0～0.5mg·L^-1的NAA。

具体的，当炼苗材料为具有完整根和芽的幼苗时，直接将幼苗接种于培养基质中，培养基质为疏松多孔无菌基质，基质：水的质量体积比为1:2.5～3。不需要在培养基质中添加营养物质，由于幼苗在步骤S4中已经形成肉质根，这种肉质根对营养的主动吸收能力极差，导致幼苗直接移栽极难成活。因此将其接种于没有任何养分的疏松多孔培养基质中，进一步诱导其对营养和水分的主动吸收能力。随着培养时间的延长，培养基质中的水分逐渐减少，逐渐促使根不断伸长生长并形成大量根毛，以满足在营养和水分胁迫逐渐加剧环境下的生长需求。从而使肉质根在没有任何营养物质的疏松多孔的培养基质中，进一步发育为具有主动营养吸收功能的完整根系。幼苗最终形成结构完整、功能齐全的组培苗。

当炼苗材料为无根的芽或茎段生长旺盛而根系长势较差的幼苗时，在培养基质中添加0.5mg·L^-1的NAA，促进不定根的分化和伸长生长，并逐渐发育为具有营养主动吸收功能，由多条侧根组成的根系，最终形成结构完整、功能齐全的组培苗。

疏松多孔生根基质为无菌基质，其可以为疏松多孔珍珠岩和/或疏松多孔蛭石，疏松多孔生根基质保持在一定的湿润状态。

S6、移栽

将生长健壮组培苗种植于草炭土和珍珠岩的混合基质中培养，得到山茶花新品种幼苗。

具体的，将生长健壮组培苗种植于V_草炭土：V_珍珠岩为1:1或1:2的基质中，其中基质的pH值为5.9～7.0，1个月后，顶芽抽梢，根尖伸长生长，同时喷施NPK比例为1:1:1的水溶肥，促进组培苗壮苗生长。移栽期间，温度为17-26℃，空气湿度不低于90％。

本申请方法打破了传统山茶花杂交育种靠天吃饭的思路，一是以未发育成熟杂交山茶花种子为对象，在无菌条件下，通过胚拯救和体细胞胚胎发生途径诱导产生无菌幼苗，经炼苗移栽后形成再生植株，从而大大减少自然环境对种子发育造成的不利影响；二是对每颗未成熟种子构建体细胞胚胎再生体系，避免了播种育苗失败造成的种质资源流失，同时实现新品种种苗的快速繁育；三是通过在无菌条件下疏松多孔基质内炼苗，逐步培养无菌幼苗肉质根对营养和水分的主动吸收能力，解决山茶花组培苗炼苗移栽成活难等问题。

在本申请中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实例中，并未详细示出公知的方法、系统和技术，以便不模糊对本说明书的理解。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、系统、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、系统、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (8)

1.一种利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，其特征在于，包括如下步骤，

S1、外植体灭菌：选取种皮完整未开裂的黑褐色未成熟杂交种子，灭菌处理后，取出未成熟杂交种子内未发育成熟的胚或/和子叶作为外植体，接入胚拯救培养基中进行培养；

胚拯救培养基的组成为：MS培养基+BA 0.5～1mg·L^-1+NAA 0.05～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8；

S2、胚性愈伤组织诱导：将步骤S1拯救成活的外植体接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，诱导形成胚性愈伤组织；

诱导培养基的组成为：MS培养基+BA 0.5～2mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8；

S3、胚性愈伤组织增殖及体细胞胚胎分化：将胚性愈伤组织接种于增殖培养基中培养，分化出不易剥离子叶形胚的胚性材料；

增殖培养基的组成为：MS培养基+BA 0～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8；

S4、成熟和萌发：将步骤S3分化出的不易剥离子叶形胚的胚性材料先接种于成熟培养基中，培养后，再将其接种于萌发培养基中，培养形成具有茎段、顶芽和功能叶的炼苗材料；

成熟培养基的组成为：1/2MS培养基+ABA 0.1～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8；

萌发培养基的组成为：1/2MS培养基+NAA 0～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8；

S5、炼苗或生根：将步骤S4培养得到的炼苗材料接种于培养基质中，培养得到能够主动吸收营养的组培苗；

S6、移栽：将生长健壮的组培苗种植于草炭土和珍珠岩的混合基质中培养，得到山茶花新品种幼苗；

所述步骤S4具体为：

将不易剥离子叶形胚的胚性材料接种于成熟培养基中，培养2-3个月后，形成胚根连接生长的体细胞胚丛；将该体细胞胚丛切分为单个胚，接种于萌发培养基中，培养1-2个月后，培养得到具有茎段、顶芽和功能叶的炼苗材料。

2.根据权利要求1所述的利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，其特征在于，所述炼苗材料为具有1个肉质根的幼苗或/和无根的芽。

3.根据权利要求1所述的利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，其特征在于，所述培养基质为疏松多孔无菌基质，基质：水的质量体积比为1:2.5～3。

4.根据权利要求1所述的利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，其特征在于，所述步骤S5中，当所述炼苗材料为具有完整根和芽的幼苗时，所述培养基质中的NAA的添加量为0。

5.根据权利要求1所述的利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，其特征在于，所述步骤S5中，当所述炼苗材料为芽或茎段生长旺盛而根系长势较差的幼苗时，所述培养基质中的NAA的添加量为0.5mg·L^-1。

6.根据权利要求1所述的利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，其特征在于，所述步骤S5的培养过程在无菌环境下进行，具体培养环境为：光照时间为16h·d^-1，暗培养为8h·d^-1，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，温度为(25±2)℃。

7.根据权利要求1所述的利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，其特征在于，所述步骤S6具体为，

将生长健壮组培苗种植于V_草炭土：V_珍珠岩为1:1或1:2的基质中，其中基质的pH值为5.9～7.0，1个月后，顶芽抽梢，根尖伸长生长，同时喷施NPK比例为1:1:1的水溶肥，促进组培苗壮苗生长，移栽期间，温度为17-26℃，相对空气湿度不低于90％。

8.根据权利要求1所述的利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法，其特征在于，所述步骤S1具体为，

在无菌条件下，将未成熟种子置于无菌三角瓶中，用75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗3-5次；然后用15％的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗3-5次；灭菌完成后，剪破种皮，取出未发育成熟的胚或/和子叶作为外植体，将上述外植体接入胚拯救培养基中进行培养。

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