CN115024220B - 薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法 - Google Patents

薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法 Download PDF

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Abstract

一种薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法，属于植物生物技术领域。该方法以大花君子兰无菌组培苗的根为材料，将离体根横向切成薄片，接种于PIC培养基中，完全黑暗条件下培养45~60天内诱导产生球形胚;将球形胚转移到MS培养基中，光下培养2周后球形胚萌发，最终发育成根、芽同步发育的大花君子兰无菌小植株,再以无菌小植株的根为材料，可循环培养并再生小植株。该方法诱导时间短，借助TCL技术，可在45~60天内获得球形胚，90天内通过体细胞胚再生根、芽同步发育的离体植株，4个月内循环再生；繁殖系数高，培养成本低。本发明首次获得大花君子兰的体细胞胚，为大花君子兰种苗商业化快速繁殖提供技术支持，为大花君子兰遗传转化研究提供再生体系。

Description

薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法。
背景技术
目前，大花君子兰生产主要依靠播种和分株繁殖。君子兰扦插繁殖一般在春季进行，繁殖系数低，平均每年只得一株。播种繁殖的繁殖周期长，需要人工授粉。种子成熟周期8~9个月，从播种到开花需要3~5年的时间。由于生产商无法提供大量稳定质量的君子兰幼苗，君子兰产业的发展受到了极大的限制，迫切需要寻找一种新的高效、稳定的繁殖方法。
组织培养是实现花卉高效繁殖的有效方法，也是遗传转化和分子育种的工作基础。迄今，君子兰组织培养技术尚不完善，基因型依赖性极强，再生周期长达7~10个月以上，无法高效稳定生产优质种苗。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法。
发明所采用的技术方案是：一种薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法，其技术要点是，以大花君子兰无菌组培苗的根为材料，在双目显微镜下，将离体根横向切成1.0~2.0 mm大小的薄片，接种于MS + 2.0 mg/L PIC培养基中，完全黑暗条件下培养45天后，诱导产生球形胚;将球形胚转移到MS培养基中，光下培养2周后球形胚萌发，最终发育成根、芽同步发育的大花君子兰无菌小植株,再以无菌小植株的根为材料，可循环培养并再生小植株。
上述方案中，所述大花君子兰无菌组培苗的根是指：再生8周内、直径不超过0.4cm的不定根。
上述方案中，薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法，其特征在于，获取大花君子兰无菌组培苗的方法,包括以下步骤:
愈伤组织诱导步骤：
君子兰种子灭菌后，剥去胚乳，取出种胚，转移到MS + 1.0 mg/L PIC的培养基中，完全黑暗条件下培养, 培养室温度为25±1℃； 50~60天左右，外植体再生愈伤组织；接种90天，初生愈伤组织颜色变淡前，进行继代培养；
器官型愈伤组织培养步骤：
将初生愈伤组织，切去褐化部分和外植体后，转接于MS + 0.5 mg/L NAA + 0.5mg/L TDZ培养基中，完全黑暗条件培养；培养过程中愈伤组织出现褐变时，需及时切去褐化部分和黄白色非胚性愈伤组织，并进行转接,根据愈伤组织生长状态，调整转接周期,经过连续三次以上转接后，褐化程度逐渐减轻,直至愈伤组织状态以颗粒状、淡黄绿色器官型胚性愈伤组织为主时停止；
不定根TCL外植体的培养步骤:
将器官型胚性愈伤组织，切割成1~2 cm3大小，转移至MS + 0.5 mg/L NAA + 2.0mg/L 6-BA培养基中，光照条件下培养60~70d后，愈伤组织分化不定芽。将具有2~4片展开叶片的试管苗，切去基部棕红色愈伤组织后，转移到1/2 MS + 0.5 mg/L NAA培养基上，2~4周后芽苗长出2~3条根；继续培养3~4周，根长至2~4cm时，即可作为TCL培养的外植体材料。
本发明的有益效果是：该薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法，以大花君子兰无菌组培苗的根为材料，将离体根横向切成薄片，接种于PIC培养基中，完全黑暗条件下培养45天后，诱导产生球形胚;将球形胚转移到MS培养基中，光下培养2周后球形胚萌发，最终发育成根、芽同步发育的大花君子兰无菌小植株,再以无菌小植株的根为材料，可循环培养并再生小植株。该方法诱导时间短，借助TCL技术，可在45~60天内获得球形胚，90天内通过体细胞胚再生根、芽同步发育的离体植株，4个月内循环再生；繁殖系数高，培养成本低。以无菌苗的根tTCL为外植体，培养4个月后，再生小植株的根即可提供20个以上、用于扩繁的tTCL外植体。每个tTCL可以发育成大约10-16个胚，每个根总共有96~256个正常发育的胚；本发明首次获得大花君子兰的体细胞胚，为大花君子兰种苗商业化快速繁殖提供技术支持，为大花君子兰遗传转化研究提供再生体系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中脱分化产生愈伤组织示意图；
图2为本发明实施例中愈伤组织增殖和状态调整示意图；
图3为本发明实施例中诱导产生不定芽示意图；
图4为本发明实施例中试管苗叶片展开示意图；
图５为本发明实施例中试管苗生根示意图；
图６为本发明实施例中组培苗的根示意图；
图７为本发明实施例中不定根TCL外植体接种示意图；
图８为本发明实施例球形胚示意图；
图９为本发明实施例心形胚示意图；
图１０为本发明实施例鱼雷胚示意图；
图１１为本发明实施例体胚萌发成苗示意图。
具体实施方式
使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图1～图11和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例１：大花君子兰‘大胜利’下胚轴和胚根为外植体商品化种苗培育。
本实施例采用的薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法，选取大花君子兰‘大胜利’下胚轴和胚根为外植体进行培育, 经器官直接发生获得不定芽、芽苗生根和离体根TCL培养直接诱导体细胞胚，最终成苗，具体步骤如下：
步骤1，大花君子兰下胚轴脱分化诱导愈伤组织的步骤。
5年生大花君子兰实生植株，盛花期人工自交授粉。授粉240天后，将种子从果实中取出，清洗干净，在25℃的无菌水中浸泡24~48小时，直到种子膨胀。将种子在70%酒精中浸泡30秒，用2%次氯酸钠消毒20分钟，并用无菌水冲洗6次以上。剥去种皮后，切取部分胚乳后，将种胚接种到MS培养基中。接种后，下胚轴和胚根开始伸长生长。7天后，当下胚轴和胚根延伸到1~2 cm时，切除种胚中全部胚乳和胚芽，以减轻外植体褐化。将胚根部分接种于MS+ 1.0 mg/L PIC培养基中，在完全黑暗培养，培养室温度为25±1℃。轻微光照即可加重外植体褐化，应严格保障黑暗环境。接种7天后，在植物生长调节剂的作用下，在下胚轴处开始膨大；14天后，膨大部位表面开始出现钝性突起；28天后，形成黄白色初生愈伤组织。接种90天后，初生愈伤组织颜色开始变淡，并且生长速度逐渐降低。 激素条件是影响大花君子兰外植体脱分化和愈伤组织诱导的关键。胚轴和胚根外植体接种后，在PIC浓度为0.5～1.0mg/L范围内愈伤组织诱导率逐渐升高，当浓度超过1.0 mg/L后，愈伤组织诱导率逐渐下降。当PIC浓度为1.0 mg/L时，愈伤组织诱导率显著高于其他处理，达到69.70%。
表1 PIC浓度对君子兰愈伤组织诱导率的影响
PIC浓度（mg/L） 愈伤组织诱导率（%）
MS 0.00±0.00 c
MS + 0.5 mg/L PIC 43.69±7.88 ab
MS + 1.0 mg/L PIC 69.70±8.02 a
MS + 1.5 mg/L PIC 45.36±8.65 ab
MS + 2.0 mg/L PIC 19.57±6.31 abc
光照是植物生长发育的必要因素，不仅影响光合作用，也参与了植物的形态建成。光照条件对外植体启动培养和脱分化和最初的细胞分裂具有重要影响。当外植体DNA复制开始后，对光暗的敏感性往往下降。部分植物外植体脱分化过程中需要进行光照启动培养，而另一些植物的脱分化则要求在完全黑暗条件下进行。大花君子兰外植体启动培养阶段，光暗条件对脱分化有重要影响。完全黑暗条件下，愈伤组织诱导率和褐化率均显著高于光照培养。
表2 光暗条件对君子兰脱分化的影响
培养条件 愈伤组织诱导率（%） 褐化率 (%)
光 28.56±1.57 b 15.80±5.83 b
暗 58.14±2.95 a 30.67±8.14 a
步骤2，器官型愈伤组织的培养的步骤。
将脱分化培养获得的初生愈伤组织从外植体中分离出来，切下棕色部分，切成2cm3大小，转移到愈伤组织增殖培养基MS + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L TDZ，在完全黑暗中进行，培养温度为25±1℃，根据愈伤组织褐化情况，每20天左右更换一次新的培养基。每次转接时，切去全部的褐化和白色致密的愈伤组织，仅保留淡黄绿色疏松的愈伤组织，缩短转接时间可抑制褐化并有利于加速器官型愈伤组织的分化，但由于器官型胚性愈伤组织疏松易碎，不能切割太小，故在继代培养过程中，逐渐缩短转接时间。愈伤组织经过连续三次继代后，褐化现象逐渐减轻，以淡黄绿色胚性器官型愈伤组织为主。
继代培养是建立高效离体再生体系的关键部分。由表3可知，在愈伤组织继代培养阶段，TDZ能够显著提高进愈伤组织的增殖效率。最佳愈伤组织增殖的激素条件为0.5 mg/LNAA+1.0 mg/L TDZ，经过3次继代后愈伤组织增殖率可以达到217.52%。
表3 激素对君子兰胚性愈伤组织继代培养的影响
Figure 105648DEST_PATH_IMAGE002
步骤3，不定根TCL外植体的培养。
取经步骤2培养获得的胚性器官型愈伤组织，将其切割成2cm3的愈伤组织块，转移至MS + 0.5 mg/L NAA + 2.0 mg/L 6-BA培养基中，每天光照16小时，黑暗8小时，光照强度为36 μmol·m-2·s-1。转接30天后，愈伤组织逐渐变成红棕色。培养60~70天后，愈伤组织再生不定芽。当植株生长至3.0~4.0 cm高时，将具有2~4片叶片的试管苗从基部切去愈伤组织块后，转移到添加1/2 MS + 0.5 mg/L NAA的生根培养基上。培养2周后，芽苗长出2~3条根，继续培养3~4周，根长至2~4cm时，组培苗生根，即可作为TCL培养的外植体。
再分化是愈伤组织转变为各种不同功能细胞的过程，再分化可以在细胞水平、组织水平和器官水平递进的进行，最后再生完整植株，是诱导再生植株的重要环节。高浓度的BA有利于诱导大花君子兰不定芽分化，最佳不定芽诱导培养基为MS + 0.5 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，其不定芽达到81.11%，平均诱导不定芽5.00个。
表4 6-BA对君子兰胚性愈伤组织诱导分化不定芽的影响
激素的种类和浓度(mg/L) 愈伤组织分化率(%) 平均分化不定芽数（个）
MS + 0.5 NAA 17.78±2.94 c 1.67±0.33 cd
MS + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L 6-BA 53.33±3.85 b 2.33±0.33 bc
MS + 0.5 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA 57.78±2.94 b 3.33±0.33 b
MS + 0.5 mg/L NAA + 1.5 mg/L 6-BA 77.78±5.88 a 3.33±0.33 b
MS + 0.5 mg/L NAA + 2.0 mg/L 6-BA 81.11±5.88 a 5.00±0.58 a
MS 11.11±1.11 c 0.67±0.33 d
 生根培养是再生完整无菌小植株的最后一步，生根数量和质量直接决定移栽成活率和苗木质量。植株生长至3.0~4.0 cm高，转移至生根培养基中。基本培养基和植物生长调节剂对大花君子兰生根均有显著影响。基本培养基直接影响大花君子兰的生根启动，接种于1/2 MS培养基中的芽苗，培养2~4周即可发生不定根，而接种于MS培养基的芽苗在42 d后才开始生根。最佳生根培养基为1/2 MS + 0.5 mg/L NAA，平均生根数达到3.00根。
表5 大花君子兰生根培养条件筛选
培养基种类和浓度（mg/L） 大胜利生根数
1/2 MS 0.33±0.33 cd
1/2 MS + 0.2 mg/L NAA 1.33±0.33 bc
1/2 MS + 0.5 mg/L NAA 3.00±0.58 a
1/2 MS + 1.0 mg/L NAA 2.00±0.00 ab
MS 0.00±0.00 d
步骤4 ，体细胞胚诱导和循环再生的步骤。
经步骤3培养所得组培苗的根伸长至2.0~4.0 cm时，在超净工作台上取出，在双目显微镜下，使用锋利的单刃刀片将离体根横向切成1.0 mm大小的薄片（tTCL）。将tTCL接种于MS + 2.0 mg/L PIC体细胞胚诱导培养基中，在完全黑暗条件下培养。接种10天后，tTCLs表面开始鼓胀。接种25天后，在维管束处分化产生胚性愈伤组织。接种45~60天后，胚性愈伤组织再分化形成球性胚。将含有球形胚的培养物转移到无激素的MS培养基中，在光照条件下培养（光周期16h/d，光照强度36 μmol·m-2·s-1），2周后球形胚开始萌发，经历心形胚和鱼雷胚阶段后，最终形成根、芽同步发育的小植株。以体细胞胚再生苗的根的薄层为材料，可循环再生体细胞胚。
不定根的苗龄和木质化程度，对体细胞胚诱导有巨大影响。再生4周内的幼嫩根系呈白色，随着生长，逐渐转淡绿色，直至浓绿。生长8周内的不定根（直径不超过0.4 cm），其薄层切片均可高效诱导球形胚发生，并能发育成正常的小植株。在球状胚萌发过程中，约20%的球状胚不能正常发育，转变成不规则畸形胚而停止发育。而生长超过8周的根，木质化程度高，虽然能够诱导球形胚，但畸形胚比率大大增加，转移至光下后，无法正常萌发。
步骤5，商品化种苗生长的步骤。
以步骤4获得的根、芽同步发育的再生小植株为材料继续培养。当植株生长至约5cm高时，从培养瓶中取出，温水冲洗以去除根部琼脂。将植株移栽到由园土、泥炭和蛭石（2:2:1，v/v/v）混合基质中，20~25℃日光温室内栽培，两周保温保湿保障幼苗水分平衡，1个月后即可生长为商品化种苗。
大花君子兰离体植株再生途径差异说明。具体如下：
离体植株可以通过不定芽发生型、器官型和体细胞胚发生型三种途径再生。其中，器官间接发生途径是从外植体脱分化产生的愈伤组织中，经再分化获得完整植株。体细胞胚发生途径是指体细胞通过类似合子胚的发育过程，经过一系列发育阶段继而形成新的完整植株的过程，大量植物都可以经过体细胞胚发生途径再生，体细胞胚发生途径具有繁殖系数高，遗传稳定性好优势，广泛应用于植物离体再生体系的建立。
在大花君子兰的离体再生研究中，大部分报道集中在器官发生途径上，体细胞胚发生途径上的再生未见报道。与器官发生相比，本实施例以TCL技术建立的大花君子兰体细胞胚发生体系，在再生植株分化时间、繁殖系数和植株生长状态上有巨大的优势。在再生周期上，大花君子兰的器官发生再生周期长达7~10个月。而本实施例建立的体细胞胚再生体系，小植株可在4个月内循环再生，大大缩短了培养时间，节约了优质种苗生产成本。在繁殖系数方面，器官发生的再生方式，2cm3大小的愈伤组织块在培养4个月后增殖434%，可诱导约9~11个不定芽。而本实施例建立的体细胞胚再生体系中，4个月苗龄的无菌小植物的再生根可提供20个以上的tTCL，每个tTCL可发育成10~16个胚，每条根可形成96~256个正常发育的胚。在一个生长周期内，体细胞胚发生途径再生的大花君子兰小植株数量是不定器官发生中的10~25倍，大大提高了繁殖系数。在再生植株发育状态方面，两种途径再生也有巨大差异。器官发生途径再生植株的根系多由2~4条长势较弱且扭曲的根组成，而体细胞胚途径再生植株由于其根、芽同时发生的形式，多由一条粗壮的主根和少量须根组成。在种苗移植后，体细胞胚再生的植株经过两周缓苗即可正常生长，而不定器官再生植株多需要3~4周的时间。此外，离体再生技术是植物生物技术研究和分子育种的基础，广泛应用于建立遗传转化体系、嵌合体分离、多倍体诱导等方面。我们依托TCL技术建立的大花君子兰体细胞胚发生技术体系，与不定器官发生途径相比更适合用于遗传转化受体。外植体薄层培养的形式，可以增加转化受体与农杆菌和筛选培养基的接触面积，减少未转化细胞，提高转化效率。同时，由于体细胞胚胎是单细胞来源的，获得嵌合体转化植株的频率低，再生次数多。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法，其特征在于：以大花君子兰无菌组培苗的根为材料，在双目显微镜下，将离体根横向切成1.0~2.0 mm大小的薄片，接种于MS +2.0 mg/L PIC培养基中，完全黑暗条件下培养45~60天后，诱导产生球形胚;将球形胚转移到MS培养基中，光下培养2周后球形胚萌发，最终发育成根、芽同步发育的大花君子兰无菌小植株,再以无菌小植株的根为材料，循环培养并再生小植株；
所述大花君子兰无菌组培苗的根是指：再生8周内、直径不超过0.4 cm的不定根。
2.根据权利要求1所述的薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法,其特征在于，获取大花君子兰无菌组培苗的根的方法,包括以下步骤:
愈伤组织诱导步骤：
君子兰种子灭菌后，剥去胚乳，取出种胚，转移到MS + 1.0 mg/L PIC的培养基中，完全黑暗条件下培养；50~60天，外植体表面形成初生愈伤组织,接种90天，初生愈伤组织颜色变淡前，进行继代培养；
器官型愈伤组织培养步骤：
将初生愈伤组织切去褐化部分和外植体后，转接于MS + 0.5 mg/L NAA + 0.5 mg/LTDZ培养基中，完全黑暗条件培养；培养过程中初生愈伤组织出现褐变时，需及时切去褐化部分和黄白色非胚性愈伤组织，并进行转接,根据转接后愈伤组织生长状态，调整转接周期,经过连续三次以上转接后，褐化程度逐渐减轻,直至愈伤组织状态以颗粒状、淡黄绿色器官型胚性愈伤组织为主时停止；
不定根TCL外植体的培养步骤:
将器官型胚性愈伤组织，切割成1~2 cm3大小，转移至MS + 0.5 mg/L NAA + 2.0 mg/L6-BA培养基中，光照条件下培养60~70d后，愈伤组织分化不定芽；将具有2~4片展开叶片的试管苗，切去基部棕红色愈伤组织后，转移到1/2 MS + 0.5 mg/L NAA培养基上，2~4周后芽苗长出2~3条根；继续培养3~4周，大花君子兰无菌组培苗的根长至2~4cm时，即可作为TCL培养的外植体材料。
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