CN110024694B - 一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养快速繁育技术领域，具体涉及一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法。包括：(1)获取花生无菌幼叶外植体、(2)诱导分化形成愈伤组织、(3)诱导愈伤组织再分化形成不定芽、(4)不定芽伸长培养四个步骤。本发明操作简便，能获得大量优良的不定芽丛，投入少，为通过组织培养技术大量获得花生再生苗提供技术基础，也为深入进行花生遗传转化和性状改良提供研究平台。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养快速繁育技术领域，具体涉及一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法。
背景技术
花生是重要的油料作物和经济作物，是我国重要的食用植物油和蛋白来源。植物组织培养技术至今已经有100余年的历史，且技术日趋成熟和完善，在农作物的遗传改良中发挥了重要的作用。随着分子生物学的发展，花生组织培养技术的应用对种质创新、品种培育、遗传转化和适应性筛选鉴定等起到了重要的促进作用。在花生的组织培养过程中，未成熟胚、成熟胚、胚轴、子叶、叶片、茎尖及花粉等都可以作为外植体进行离体培养诱导获得再生植株。但是在具体的实施过程中发现，花生植株的各组织中多酚类物质含量相当丰富，这不利于组织培养过程中再生苗的诱导。此外，不同基因型品种、不同类型的花生外植体的分化效率差异非常大，获得再生苗技术体系的重复性差。在花生的组织培养过程中，不定芽的诱导是成功获得再生苗的一个关键技术环节，由于基因型、外植体种类以及组织培养体系中各激素比例的差异，当前并没有一个成熟可靠的花生组织培养技术体系来获得大量的不定芽。
发明内容
本发明要解决的技术问题是由于基因型、外植体种类以及组织培养体系中各激素比例的差异，当前并没有一个成熟可靠的花生组织培养技术体系来获得大量的不定芽。
为解决上述问题，本发明提供了一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法，操作简便，能获得大量优良的不定芽丛，投入少，为通过组织培养技术大量获得花生再生苗提供技术基础，也为深入进行花生遗传转化和性状改良提供研究平台。
为达到上述目的，本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法，(1)获取花生无菌幼叶外植体、(2)诱导分化形成愈伤组织、 (3)诱导愈伤组织再分化形成不定芽、(4)不定芽伸长培养四个步骤；
其中，步骤(1)为选择花生无菌幼叶为外植体，在无菌条件下进行步骤(2)的诱导分化；花生是一个繁殖系数较低的植物。一般的花生组培中使用花生子叶柄或者胚小叶为外植体，在此条件下，一颗花生种子提供的外植体数量极为有限。但是一颗花生种子可以提供大量的花生幼叶，且每个花生幼叶可以分为2-3个外植体。所以花生幼叶作为外植体进行组织培养，可以在使用较少种子的情况下获得大量的外植体，进而获得大量的再生不定芽。
步骤(3)为在无菌的条件下，将步骤(2)中所获得的愈伤组织放入不定芽诱导培养基中，诱导形成不定芽；不定芽诱导培养基的配方包括：MS培养基、蔗糖28～32g/L、TDZ 0.6～ 1.0mg/L、NAA 0.3～0.7mg/L、硝酸银4.8～5.2mg/L、琼脂粉7.0～7.4g/L，pH值为5.8～6.0； MS培养基：提供外植体生长的基本营养物质；蔗糖28～32g/L：提供外植体生长的碳源；TDZ 0.6～1.0mg/L、NAA 0.3～0.7mg/L：协同作用诱导不定芽的形成；硝酸银4.8～5.2mg/L：防止外植体褐化，同时促进不定芽的形成；琼脂粉7.0～7.4g/L：培养基的支撑作用；pH值为 5.8～6.0：组织培养过程中需要的适宜的酸碱度。
步骤(4)为在无菌条件下，将步骤(3)中获得的带有不定芽的花生幼叶外植体转移到不定芽伸长培养基中，进行不定芽的伸长培养；不定芽伸长培养基的配方包括：MS培养基、葡萄糖8.0～12g/L、木糖0.23～0.27g/L、MES 0.5～0.7g/L、反式-Zeatin 1.8～2.2mg/L、IAA 0.08～0.12mg/L、琼脂粉5.8～6.2g/L，pH值为5.8～6.0。MS培养基：提供外植体生长的基本营养物质；葡萄糖8.0～12g/L：提供外植体生长的碳源；木糖0.23～0.27g/L、MES0.5～0.7g/L：维持细胞的渗透压；反式-Zeatin 1.8～2.2mg/L、IAA 0.08～0.12mg/L：协同作用促进不定芽的伸长生长；琼脂粉5.8～6.2g/L：培养基的支撑作用；pH值为5.8～6.0：组织培养过程中需要的适宜的酸碱度。
以上所述的方法，培养温度为25℃，光照度2000-2500lx，光照15～18小时/天。
进一步的，步骤(1)为选择花生成实饱满的种子，在超净工作台上灭菌，将灭菌后的种子去皮后，播种到种子萌发培养基，置光照培养箱中，9天后，在超净工作台上取未展开的花生幼叶，用无菌的镊子和刀片将幼叶横切，平均分为三段。
进一步的，步骤(1)中的种子萌发培养基包括MS培养基、蔗糖28～32g/L、琼脂粉6～ 8g/L，p H值为5.8～6.0，播种后光照培养。MS培养基：提供种子萌发的基本营养物质；蔗糖28～32g/L：提供花生幼苗生长的碳源；琼脂粉6～8g/L：培养基的支撑作用。pH值为5.8～6.0：组织培养过程中需要的适宜的酸碱。
进一步的，步骤(1)中种子灭菌是用75％酒精浸泡1min，无菌水冲洗1min，然后放入 50％的84溶液中浸泡10min，使花生种子彻底灭菌后，无菌水冲洗6～7次，彻底去除花生种子表面残留的84溶液，防止84溶液的残留对种子萌发和生长造成影响。
进一步的，步骤(2)为在无菌条件下，将切好的无菌花生幼叶放入愈伤组织诱导培养基中，诱导花生幼叶形成愈伤组织；愈伤组织诱导培养基的配方包括：MS培养基、蔗糖28～ 32g/L、6-BA 2.8～3.2mg/L、NAA 0.8～1.2mg/L、琼脂粉6～8g/L，p H值为5.8～6.0。MS培养基：提供外植体生长的基本营养物质；蔗糖28～32g/L：提供外植体生长的碳源；6-BA2.8～ 3.2mg/L、NAA0.8～1.2mg/L：协同诱导愈伤组织的形成；琼脂粉6～8g/L：培养基的支撑作用；pH值为5.8～6.0：组织培养过程中需要的适宜的酸碱度。
已公开的所有花生品系均能用上述方法进行育苗。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明利用花生幼叶作为外植体，可以在使用较少种子的情况下获得大量的优良植株。
(2)本发明使用不定芽诱导培养基来诱导不定芽的形成，大大提高了愈伤组织的再分化效率，愈伤组织的分化率达到30％以上。
(3)如果诱导形成的不定芽继续放在不定芽诱导培养基中，则不定芽不再伸长生长，最终形成畸形芽。本发明使用不定芽伸长培养基来培养已经形成的不定芽丛生长成为正常的不定芽，大大提高了不定芽丛的生长效率。
(4)本发明操作简便，具有投入少，产出高的特点。可以短期内获得大量的花生再生不定芽，为后期获得大量的再生苗提供了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为9天大的花生无菌苗。
图2为获得的花生无菌幼叶外植体。
图3为花生幼叶脱分化形成愈伤组织。
图4为愈伤组织分化形成不定芽(箭头所示为不定芽生长位置)。
图5为不定芽培养基上培养30d后，不定芽的生长情况(箭头所示为不定芽生长位置)。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述：
实施例1：
小花生品种花育20的快速诱导幼叶再分化形成不定芽的方法：
(1)花生无菌幼叶外植体的获取：选择花生品种花育20成实饱满的种子，在超净工作台上用75％酒精浸泡1min，无菌水冲洗1min，然后放入50％的84溶液中浸泡10min，无菌水冲洗6～7次。将灭菌后的种子剥去种皮后播种到种子萌发培养基上，播种后光培养9d。然后在超净工作台上取花生幼叶(此时幼叶未展开)，用无菌的镊子和刀片将幼叶横切，平均分为三段。
其中的种子萌发培养基包括MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，p H值为5.9。
(2)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：在无菌条件下，将切好的无菌花生幼叶放入愈伤组织诱导培养基中，10d后99％以上的外植体脱分化形成愈伤组织。
所述的愈伤组织诱导培养基包括：MS培养基+30g/L蔗糖+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/LNAA +7.0g/L琼脂粉，p H值为5.9。
(3)诱导愈伤组织再分化形成不定芽：在无菌的条件下，将步骤(2)中获得的愈伤组织放入不定芽诱导培养基中，10d后60％的愈伤组织开始形成不定芽。
所述的不定芽诱导培养基包括：MS培养基+30g/L蔗糖+0.8mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+5.0mg/L硝酸银+7.2g/L琼脂粉，pH值为5.9。
(4)不定芽伸长培养：在无菌条件下，将步骤(3)中获得的带有不定芽的花生幼叶外植体转移到不定芽伸长培养基中，进行不定芽的伸长培养。
不定芽伸长培养基包括：MS培养基+10g/L葡萄糖+0.25g/L木糖+0.6g/L MES+2.0mg/L 反式-Zeatin+0.1mg/L IAA+6g/L琼脂粉，pH值为5.9。
以上所述步骤的培养温度为25℃，光照强度为2500lx，光照16小时/天。
实施例2：
大花生品种丰花1号的快速诱导幼叶再分化形成不定芽的方法：
(1)花生无菌幼叶外植体的获取：选择花生品种丰花1号成实饱满的种子，在超净工作台上用75％酒精浸泡1min，无菌水冲洗1min，然后放入50％的84溶液中浸泡10min，无菌水冲洗6～7次。将灭菌后的种子剥去种皮后播种到种子萌发培养基上，播种后光培养9d。然后在超净工作台上取花生幼叶(此时幼叶未展开)，用无菌的镊子和刀片将幼叶横切，平均分为三段。
所述的种子萌发培养基为：MS培养基+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂粉，p H值为5.9。
(2)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：在无菌条件下，将切好的无菌花生幼叶放入愈伤组织诱导培养基中，10d后，99％以上的外植体脱分化形成愈伤组织。
所述的愈伤组织诱导培养基包括：MS培养基+30g/L蔗糖+3.0mg/L 6-BA+1.0mg/LNAA +7.0g/L琼脂粉，p H值为5.9。
(3)诱导愈伤组织再分化形成不定芽：在无菌的条件下，将步骤(2)中获得的愈伤组织放入不定芽诱导培养基中，10d后37％的愈伤组织开始形成不定芽。
所述的不定芽诱导培养基包括：MS培养基+30g/L蔗糖+0.8mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+5.0mg/L硝酸银+7.2g/L琼脂粉，pH值为5.9。
(4)不定芽伸长培养：在无菌条件下，将步骤(3)中获得的带有不定芽的花生幼叶外植体转移到不定芽伸长培养基中，进行不定芽的伸长培养。
不定芽伸长培养基包括：MS培养基+10g/L葡萄糖+0.25g/L木糖+0.6g/L MES+2.0mg/L反式 -Zeatin+0.1mg/L IAA+6g/L琼脂粉，pH值为5.9。
以上所述步骤的培养温度为25℃，光照强度为2500lx，光照16小时/天。
Claims (3)
1.一种快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法，其特征在于包括：（1）获取花生无菌幼叶外植体、（2）诱导分化形成愈伤组织、（3）诱导愈伤组织再分化形成不定芽、（4）不定芽伸长培养四个步骤；
步骤（1）为选择小花生品种花育20或大花生品种丰花1号饱满的种子，在超净工作台上灭菌，将灭菌的种子去皮后，播种到种子萌发培养基，置光照培养箱中培养，种子萌发培养基为：MS培养基+蔗糖28～32g/L+琼脂粉6～8g/L，pH值为5.8～6.0，9天后，在超净工作台上取未展开的花生幼叶，用无菌的镊子和刀片将幼叶横切，平均分为三段；将切好的花生无菌幼叶作为外植体，在无菌条件下进行步骤（2）的诱导分化；
步骤（2）为在无菌条件下，将切好的无菌花生幼叶放入愈伤组织诱导培养基中，诱导花生幼叶形成愈伤组织；愈伤组织诱导培养基的配方为：MS培养基+蔗糖28～32g/L+6-BA 2.8～3.2mg/L+NAA 0.8～1.2 mg/L+琼脂粉6～8g/L，pH值为5.8～6.0；
步骤（3）为在无菌的条件下，将步骤（2）中所获得的愈伤组织放入不定芽诱导培养基中，诱导形成不定芽；不定芽诱导培养基的配方为：MS培养基+蔗糖28～32g/L+TDZ 0.6～1.0mg/L+NAA 0.3～0.7mg/L+硝酸银4.8～5.2mg/L+琼脂粉7.0～7.4g/L，pH值为5.8～6.0；
步骤（4）为在无菌条件下，将步骤（3）中获得的带有不定芽的花生幼叶外植体转移到不定芽伸长培养基中，进行不定芽的伸长培养；不定芽伸长培养基的配方为：MS培养基+葡萄糖8.0～12g/L+木糖0.23～0.27g/L+MES 0.5～0.7g/L+反式-Zeatin 1.8～2.2mg/L+IAA0.08～0.12mg/L+琼脂粉5.8～6.2g/L，pH值为5.8～6.0。
2.如权利要求1所述的快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法，其特征在于：步骤（1）中种子灭菌是用75%酒精浸泡1min，无菌水冲洗1min，然后放入50%的84溶液中浸泡10min，无菌水冲洗6～7次。
3.如权利要求1所述的快速诱导花生幼叶再分化形成不定芽的方法，其特征在于：步骤（1）、（2）、（3）、（4）中培养温度为25℃，光照度2000-2500lx，光照15～18小时/天。
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|---|---|---|---|---|
| CN113040052A (zh) * | 2021-04-22 | 2021-06-29 | 大连民族大学 | 一种以幼叶为外植体快速构建花生再生体系的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101960988A (zh) * | 2010-09-30 | 2011-02-02 | 河南省农业科学院 | 诱导花生不定芽的方法 |
| CN102257965A (zh) * | 2011-06-29 | 2011-11-30 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法 |
-
2019
- 2019-06-04 CN CN201910479343.3A patent/CN110024694B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101960988A (zh) * | 2010-09-30 | 2011-02-02 | 河南省农业科学院 | 诱导花生不定芽的方法 |
| CN102257965A (zh) * | 2011-06-29 | 2011-11-30 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 花生不同外植体芽诱导制约因素研究;殷冬梅等;《花生学报》;20091231;第38卷(第4期);摘要及第2.1.2节 * |
| 花生不定芽分化及植株再生的研究;黄玲等;《中国农学通报》;20131125(第33期);第1.1节、第1.2.1-1.2.2节、第1.2.4、第2.1节、第2.4节 * |
| 花生幼叶不定芽诱导与快速繁殖;刘璨等;《亚热带植物科学》;20100615(第02期);全文 * |
| 花生组培再生及农杆菌介导遗传转化研究进展;苗利娟等;《中国农学通报》;20171115(第32期);全文 * |
| 花生组织培养及高频率植株再生;雷萍萍等;《中国油料作物学报》;20090615(第02期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110024694A (zh) | 2019-07-19 |
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