CN111280065A - 一种落叶松体细胞胚再生的方法 - Google Patents

一种落叶松体细胞胚再生的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111280065A
CN111280065A CN202010265138.XA CN202010265138A CN111280065A CN 111280065 A CN111280065 A CN 111280065A CN 202010265138 A CN202010265138 A CN 202010265138A CN 111280065 A CN111280065 A CN 111280065A
Authority
CN
China
Prior art keywords
larch
culture
culture medium
medium
days
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010265138.XA
Other languages
English (en)
Inventor
盖颖
刘威锋
吴晓雪
蒋湘宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Forestry University
Original Assignee
Beijing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Forestry University filed Critical Beijing Forestry University
Priority to CN202010265138.XA priority Critical patent/CN111280065A/zh
Publication of CN111280065A publication Critical patent/CN111280065A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Abstract

本发明提供了一种落叶松体细胞胚再生方法，所述方法的步骤包括：采集落叶松未成熟种子合子胚为外植体，诱导出落叶松胚性愈伤组织；在新继代培养基上培养7～10天，选择生长良好的胚性愈伤组织，接于锥形瓶中液体培养基中，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；然后将培养物转入半固体培养基，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；最后将培养物接于固体培养基表面，20～25℃，暗培养23～30天，形成后期子叶胚。所述方法能大量诱导产生优质体细胞胚，减少畸形胚，诱导体胚形成时间短，且能达到更好的同步化效果并且具有高诱导效率。

Description

一种落叶松体细胞胚再生的方法
技术领域
本发明涉及落叶松植物栽培领域，具体涉及一种落叶松体细胞胚再生的方法。
背景技术
落叶松(LarixLeptolepis)是我国北方及亚热带中高山地区的针叶速生造林用材树种，具有分布广泛、适应性强、病虫害少、材质优良等特点，且早期速生性在所有的针叶树中位居前列，是国营林场和农民都非常重视的造林树种，人工造林面积目益扩大。因此，开展落叶松育种研究工作是我国针叶树改良的一个重要领域。落叶松常规繁殖方法是种子繁殖或无性(扦插)繁殖，但由于落叶松种子繁殖周期长、发芽率低，无性扦插繁殖系数较低，并且存在年龄效应、位置效应及取材困难等问题，难以满足大面积种植的要求。相较于传统繁育手段，体细胞胚发生具有繁殖效率高、不受季节限制的优点，可以克服实际生产中落叶松种子产量不稳定、子代变异大、扦插繁殖生根率较低等问题。
对于落叶松的体细胞胚胎发生的研究从20世纪80年代即已开始。日本落叶松、长白落叶松、日本×长白落叶松及日本×欧洲落叶松(L.kaempferi×decidua)等落叶松属种及杂种均已相继建立了相应的体胚胎发生体系(Klimaszewska，1989；Thompson et al.，1992；Yong et al.，1998；齐力旺，2000；吕守芳等，2005；王伟达，2008；Lelu et al.，2011)。但受到组织增殖效率及体胚成熟率低等因素的影响，目前的技术体系仍不能满足落叶松体胚商业化生产的要求。
针对目前落叶松体细胞胚胎发生过程中，体细胞胚诱导一般是在特定成分的单一固体培养基上诱导胚性愈伤形成体细胞胚，存在体细胞胚发生率低，体胚形成时间长，畸形率高，发生不同步，萌发率低等缺点的问题，本申请提出新的体细胞胚再生方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种落叶松体细胞胚再生方法，解决体细胞胚发生率低，体胚形成时间长，畸形率高，发生不同步，萌发率低的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种落叶松体细胞胚再生方法，所述方法包括：
(1)采集落叶松未成熟种子合子胚作为外植体，清洗消毒后剥去种皮，取出幼胚，接种于胚性愈伤诱导培养基上20～25℃，暗培养，诱导落叶松胚性愈伤组织；
(2)选取步骤(1)中所述落叶松胚性愈伤组织转于胚性愈伤继代培养基上20～25℃，暗培养14～18天为一周期继代培养；
(3)新继代培养基上培养7～10天，选择生长良好的胚性愈伤组织约1g，使用镊子撕碎接于锥形瓶中50mL液体培养基中，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；
(4)用细滤网滤出步骤(3)中培养基中培养物，转入锥形瓶中等体积的半固体培养基，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；
(5)采用细滤网滤出步骤(4)培养基中培养物，用滤纸吸干水分，接于固体培养基表面，20～25℃，暗培养23～30天；获得落叶松幼苗；
所述步骤(1)-(5)需要在无菌条件下操作；
所述胚性愈伤诱导培养基的成分和含量(mg/L)为：2,4-D(1.0)，6-BA(0.5)，KT(0.3)，谷氨酰胺(500)，水解酪蛋白(500)，甘氨酸(2)，蔗糖(20000)，肌醇(1000)，维生素B1(0.5)，维生素B6(0.5)，KNO3(2337)，NH4NO3(275)，KH2PO4(85)，CaCl2·2H2O(327)，MgSO4·7H2O(172)，H3BO3(3.1)，ZnSO4·7H2O(4.3)，MnSO4·H2O(8.45)，Na2MoO4·2H2O(0.125)，KI(0.415)，CuSO4·5H2O(0.0125)，CoCl2(0.0125)FeSO4·7H2O(13.9),Na2·EDTA·H2O(18.6),琼脂3g/L；
所述胚性愈伤继代培养基的成分和含量(mg/L)为：2,4-D(0.15)(或NAA(0.3))，6-BA(0.05)，KT(0.05)，谷氨酰胺(500)，水解酪蛋白(500)，甘氨酸(2)，蔗糖(30000)，肌醇(1000)，维生素B1(0.5)，维生素B6(0.5)，KNO3(2337)，NH4NO3(275)，KH2PO4(85)，CaCl2·2H2O(327)，MgSO4·7H2O(172)，H3BO3(3.1)，ZnSO4·7H2O(4.3)，MnSO4·H2O(8.45)，Na2MoO4·2H2O(0.125)，KI(0.415)，CuSO4·5H2O(0.0125)，CoCl2(0.0125)FeSO4·7H2O(13.9),Na2·EDTA·H2O(18.6),琼脂5g/L；
所述液体培养基的成分和含量(mg/L)为：聚乙二醇(PEG)4000(100000)，脱落酸(ABA)(15)，AgNO3(10)，谷氨酰胺(500)，水解酪蛋白(500)，甘氨酸(2)，蔗糖(45000)，肌醇(1000)，维生素B1(0.5)，维生素B6(0.5)，KNO3(2337)，NH4NO3(275)，KH2PO4(85)，CaCl2·2H2O(327)，MgSO4·7H2O(172)，H3BO3(3.1)，ZnSO4·7H2O(4.3)，MnSO4·H2O(8.45)，Na2MoO4·2H2O(0.125)，KI(0.415)，CuSO4·5H2O(0.0125)，CoCl2(0.0125)FeSO4·7H2O(13.9)Na2·EDTA·H2O(18.6)；所述半固体培养基为所述液体培养基添加琼脂2g/L或结冷胶1g/L的半固体培养基；所述固体培养基为所述液体培养基添加琼脂10g/L或结冷胶7g/L的固体培养基。
进一步的，所述落叶松为长白落叶松；所述落叶松未成熟种子合子胚为6月中下旬采集的长白落叶松未成熟合子胚。
所述步骤(3)中，撕碎的胚性愈伤组织接于锥形瓶中50mL液体培养基中，于摇床100rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养4天。
所述步骤(4)中，半固体培养基上培养的条件为摇床75rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养5天。
所述步骤(5)中，接于固体培养基表面，23±1℃，暗培养25天。
优选的，一种落叶松体细胞胚再生方法，所述方法包括：(1)采集长白落叶松未成熟种子合子胚，清洗消毒后剥去种皮，取出幼胚，作为外植体，在胚性愈伤诱导培养基上诱导出的落叶松胚性愈伤组织；(2)选取步骤(1)中所述落叶松胚性愈伤组织在胚性愈伤继代培养基上培养10天，选择生长良好的胚性愈伤组织约1g，使用镊子撕碎接于锥形瓶中50mL液体培养基中，于摇床100rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养4天：(3)用细滤网滤出步骤(2)中培养基中培养物，转入锥形瓶中等体积的半固体培养基，于摇床75rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养5天；(4)采用细滤网滤出步骤(3)培养基中培养物，用滤纸吸干水分，接于固体培养基表面，23±1℃，暗培养25天；获得落叶松幼苗。
本发明具有以下优点：
本发明的落叶松体细胞胚再生方法采用液体至固体培养基培养方法诱导落叶松体细胞胚，比单一成熟培养基能达到更好的同步化效果并且具有高诱导效率，绝大多数体胚均处于同一发育时期。诱导体胚形成时间短，成熟体胚形成时间为34天左右，同步率(发育最快子叶胚成熟5天后的成熟体胚/正常形态体胚*100％)为78％。能大量诱导产生优质体细胞胚，减少畸形胚，正常形态体胚比例(正常形态体胚数/总体胚数*100％)大于80％。正常形态体胚形成效率可达223个/g胚性愈伤，体细胞胚萌发率(萌发体胚数/接种体胚数*100％)可达47.2％。为大规模化育种繁殖，生理生化研究，及转基因改良带来极大的方便，具有较大实际应用价值。
附图说明：
图1为显微镜用数码相机拍摄的培养过程中不同时期的图片。A.转入培养基C后5天(bar＝1.5mm)；B.转入培养基C后10天(bar＝1.5mm)；C.转入培养基C后16天(bar＝3mm)；D.培养基C中7天后期单胚形成(bar＝0.4mm)；E.培养基C中14天早期子叶胚形成(bar＝0.3mm)；F.培养基C中23天后期子叶胚形成(bar＝0.8mm)。
图2为胚性胚柄团形成体胚。A.胚性愈伤中的3期原胚团(bar＝100μm)B.刚转入培养基B中的早期单胚(bar＝200μm)C.培养基C中7天形成的后期单胚(bar＝200μm)。
图3为转入培养基C中14天后形成的早期子叶胚(bar＝300μm)。
图4为培养基C中体胚子叶发育。A\B为早期子叶胚(转入C中14天)(bar＝200μm)；CD为后期子叶胚(转入C中23天)(bar＝200μm)。
图5为后期子叶胚(转入C中23天)(bar＝0.5mm)。
图6为收集的落叶松体胚，A.(bar＝5mm)B.(bar＝2mm)。
图7为转入萌发培养基中，体细胞胚萌发。
具体实施方式
下面以具体实施方式对发明作进一步详细说明。
本发明参照特定的实施例进行了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图应该认为是说明性的而非限制性的。
具体实施方式：
实施例1.采集落叶松未成熟种子合子胚，并进行胚性愈伤诱导
采集6月中下旬的长白落叶松未成熟种子，清水浸泡4～6小时并清洗干净，75％酒精消毒3分钟，5％次氯酸钠消毒15分钟，后用无菌蒸馏水反复清洗干净，剥去种皮，切开胚乳至胚或直接拨出幼胚，接种于胚性愈伤诱导培养基进行胚性愈伤诱导(23±1℃，暗培养)。诱导30天左右，挑出胚性愈伤，分离成小块，于继代培养基长期增殖继代培养(23±1℃，暗培养，15天继代一次)。
实施例2.培养基的配置
胚性愈伤诱导培养基成分如下，为附加成分的1/2SPE培养基(Gupta&Durzan,1987，以下简称S培养基)，加琼脂3g/L,余量为水，PH5.8：
表1.胚性愈伤诱导培养基成分
Figure BDA0002440989190000041
Figure BDA0002440989190000051
胚性愈伤继代培养基成分如下，为附加成分的S培养基，加琼脂5g/L,余量为水，PH5.8：
表2.胚性愈伤继代培养基成分
成分 含量(mg/L) 成分 含量(mg/L)
2,4-D 0.15 KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 85
6-BA 0.05 CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 327
KT 0.05 MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 172
谷氨酰胺 500 H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 3.1
水解酪蛋白 500 ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 4.3
甘氨酸 2 MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 8.45
蔗糖 30000 Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.125
肌醇 1000 KI 0.415
维生素B<sub>1</sub> 0.5 CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.0125
维生素B<sub>6</sub> 0.5 CoCl<sub>2</sub> 0.0125
KNO<sub>3</sub> 2337 FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 13.9
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> 275 Na<sub>2</sub>·EDTA·H<sub>2</sub>O 18.6
液体体细胞胚诱导培养基A成分如下，为附加成分的S培养基，余量为水，PH5.8：
表3.液体体细胞胚诱导培养基A成分
Figure BDA0002440989190000052
Figure BDA0002440989190000061
液体体细胞胚诱导培养基A添加琼脂2g/L或冷结胶1g/L，则为半固体细胞胚诱导培养基B；
液体体细胞胚诱导培养基A添加琼脂10g/L或冷结胶7g/L，则为固体体细胞胚诱导培养基C。
说明：
1.培养基采用高压蒸汽灭菌，其中不能高压蒸汽灭菌的成分脱落酸，AgNO3,谷氨酰胺用0.22μm滤器过滤除菌后加入高压灭菌后冷却到50℃以下的培养基。
2.聚乙二醇4000可用聚乙二醇3000～8000代替，培养基可用附加成分相同的S培养基，DCR培养基或1/2MS培养基。
实施例3.落叶松体细胞胚再生
一、液体至固体培养基培养方法
所述方法包括如下步骤：
1.以6月15-6月25日采集的长白落叶松未成熟种子合子胚为外植体，诱导出的落叶松胚性愈伤，为本实验的初始材料。
2.在超静工作台内无菌操作条件下，选取在新继代培养基上培养约10天，生长良好的胚性愈伤组织，用镊子撕碎接于锥形瓶中液体培养基A，每1g愈伤接于50ml左右培养基中，于摇床100rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养4天。
3.在超静工作台内无菌操作条件下，用细滤网滤出培养基A中培养物转入锥形瓶中等体积的半固体培养基B，于摇床75rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养5天。
4.在超静工作台内无菌操作条件下，细滤网滤出培养基B中培养物，用滤纸吸干水分，接于培养皿(10CM直径，每皿15～20ML培养基)中培养基C表面(每团约0.1g,每皿接种5团)，23±1℃，暗培养直至形成成熟体细胞胚。
5.转入培养基C后体胚逐渐形成(图1)7天左右形后期单胚(图2)，两星期左右形成前期子叶体胚(图3)，子叶生长(图4)，23左右形成后期子叶胚(图5)。
表4.最佳条件下该方法体胚形成情况
Figure BDA0002440989190000071
如上表用此A、B、C培养基诱导，成熟体胚形成时间为34天左右，同步率(发育最快子叶胚成熟5天后的成熟体胚/正常形态体胚*100％)为78％。能大量诱导产生优质体细胞胚，减少畸形胚，正常形态体胚比例(正常形态体胚数/总体胚数*100％)大于80％。正常形态体胚形成效率可达223个/g胚性愈伤，体细胞胚萌发率(萌发体胚数/接种体胚数*100％)可达47.2％。
本方法中设计了A、B、C 3种体胚诱导培养基，3种培养基中其余成分相同，但培养基从不含固化剂到固化剂含量依次增加，本试验对培养基中蔗糖和PEG4000浓度(表5)、ABA浓度(表6)、及固化剂的浓度(表7)对体胚形成的影响进行了测试，并优化培养的配方，以确定最佳的蔗糖、PEG4000、ABA和固化剂浓度。
表5.培养基中，不同浓度蔗糖、PEG4000的影响(培养基其余成分同上实施例2中A、B、C培养基)
Figure BDA0002440989190000072
由上表可见，体细胞胚诱导培养基中最佳蔗糖浓度为45g/L，PEG4000浓度为100g/L。
表6.培养基中，不同ABA浓度的影响(培养基其余成分同上实施例2中A、B、C培养基)
Figure BDA0002440989190000081
由上表可见，体细胞胚诱导培养基中最佳ABA浓度为15mg/L。
表7.C培养基中不同固化剂浓度对体胚的影响(培养基其余成分同上实施例2中A、B、C培养基)
Figure BDA0002440989190000082
由上表可见，C培养基中最佳固化剂浓度为琼脂10g/L或结冷胶7g/L。
由以上对比实验得出培养基成分最佳条件，为实施例3中所列培养基成分，该培养基成分为本实验最佳培养基。
二、单独采用固体培养基诱导方法
将新继代培养基上继代培养10的胚性愈伤，直接转入如下成分固体培养基表面，23±1℃，暗培养，诱导体胚，即只采用单一成分的固体培养基诱导胚性愈伤形成体胚，一次性降低培养基中可利用水含量而不是梯度连续降低，培养基其余成分同实施例2中培养基C。
表8.单一固体培养基诱导体胚形成结果
Figure BDA0002440989190000083
Figure BDA0002440989190000091
如上表结果将胚性愈伤直接转入固体培养基成熟，最优条件下，最早成熟体胚形成时间比此方法晚5～10天，正常形态体胚生成数105.4个/g胚性愈伤，畸形胚率约为35.0％，同步率(发育最快子叶胚成熟5天后的成熟体胚/正常形态体胚*100％)为62.3％。证明此液体至固体方法优化了体胚的形成，比单一固体成熟培养基能缩短成熟时间，促进体胚生成同步，并提高体胚产率和质量。

Claims (7)

1.一种落叶松体细胞胚再生方法，所述方法包括：
(1)采集落叶松未成熟种子合子胚作为外植体，清洗消毒后剥去种皮，取出幼胚，接种于胚性愈伤诱导培养基上20～25℃，暗培养，诱导落叶松胚性愈伤组织；
(2)选取步骤(1)中所述落叶松胚性愈伤组织转于胚性愈伤继代培养基上20～25℃，暗培养14～18天为一周期继代培养；
(3)新继代培养基上培养7～10天，选择生长良好的胚性愈伤组织约1g，使用镊子撕碎接于锥形瓶中50mL液体培养基中，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；
(4)用细滤网滤出步骤(3)中培养基中培养物，转入锥形瓶中等体积的半固体培养基，于摇床50～125rpm，20～25℃，悬浮条件下暗培养4～7天；
(5)采用细滤网滤出步骤(4)培养基中培养物，用滤纸吸干水分，接于固体培养基表面，20～25℃，暗培养23～30天；获得落叶松幼苗；
所述步骤(1)-(5)需要在无菌条件下操作；
所述胚性愈伤诱导培养基的成分和含量(mg/L)为：2,4-D(1.0)，6-BA(0.5)，KT(0.3)，谷氨酰胺(500)，水解酪蛋白(500)，甘氨酸(2)，蔗糖(20000)，肌醇(1000)，维生素B1(0.5)，维生素B6(0.5)，KNO3(2337)，NH4NO3(275)，KH2PO4(85)，CaCl2·2H2O(327)，MgSO4·7H2O(172)，H3BO3(3.1)，ZnSO4·7H2O(4.3)，MnSO4·H2O(8.45)，Na2MoO4·2H2O(0.125)，KI(0.415)，CuSO4·5H2O(0.0125)，CoCl2(0.0125)FeSO4·7H2O(13.9),Na2·EDTA·H2O(18.6),琼脂3g/L；
所述胚性愈伤继代培养基的成分和含量(mg/L)为：2,4-D(0.15)(或NAA(0.3))，6-BA(0.05)，KT(0.05)，谷氨酰胺(500)，水解酪蛋白(500)，甘氨酸(2)，蔗糖(30000)，肌醇(1000)，维生素B1(0.5)，维生素B6(0.5)，KNO3(2337)，NH4NO3(275)，KH2PO4(85)，CaCl2·2H2O(327)，MgSO4·7H2O(172)，H3BO3(3.1)，ZnSO4·7H2O(4.3)，MnSO4·H2O(8.45)，Na2MoO4·2H2O(0.125)，KI(0.415)，CuSO4·5H2O(0.0125)，CoCl2(0.0125)FeSO4·7H2O(13.9),Na2·EDTA·H2O(18.6),琼脂5g/L；
所述液体培养基的成分和含量(mg/L)为：聚乙二醇(PEG)4000(100000)，脱落酸(ABA)(15)，AgNO3(10)，谷氨酰胺(500)，水解酪蛋白(500)，甘氨酸(2)，蔗糖(45000)，肌醇(1000)，维生素B1(0.5)，维生素B6(0.5)，KNO3(2337)，NH4NO3(275)，KH2PO4(85)，CaCl2·2H2O(327)，MgSO4·7H2O(172)，H3BO3(3.1)，ZnSO4·7H2O(4.3)，MnSO4·H2O(8.45)，Na2MoO4·2H2O(0.125)，KI(0.415)，CuSO4·5H2O(0.0125)，CoCl2(0.0125)FeSO4·7H2O(13.9)Na2·EDTA·H2O(18.6)；所述半固体培养基为所述液体培养基添加琼脂2g/L或结冷胶1g/L的半固体培养基；所述固体培养基为所述液体培养基添加琼脂10g/L或结冷胶7g/L的固体培养基。
2.根据权利要求1所述的一种落叶松体细胞胚再生方法，所述落叶松为长白落叶松。
3.根据权利要求1所述的一种落叶松体细胞胚再生方法，所述落叶松未成熟种子合子胚为6月中下旬采集的长白落叶松未成熟合子胚。
4.根据权利要求1所述的一种落叶松体细胞胚再生方法，所述步骤(3)中，撕碎的胚性愈伤组织接于锥形瓶中50mL液体培养基中，于摇床100rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养4天。
5.根据权利要求1所述的一种落叶松体细胞胚再生方法，所述步骤(4)中，半固体培养基上培养的条件为摇床75rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养5天。
6.根据权利要求1所述的一种落叶松体细胞胚再生方法，所述步骤(5)中，接于固体培养基表面，23±1℃，暗培养25天。
7.根据权利要求1所述的一种落叶松体细胞胚再生方法，所述方法包括：(1)采集长白落叶松未成熟种子合子胚，清洗消毒后剥去种皮，取出幼胚，作为外植体，在胚性愈伤诱导培养基上诱导出的落叶松胚性愈伤组织；(2)选取步骤(1)中所述落叶松胚性愈伤组织在胚性愈伤继代培养基上培养10天，选择生长良好的胚性愈伤组织约1g，使用镊子撕碎接于锥形瓶中50mL液体培养基中，于摇床100rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养4天；(3)用细滤网滤出步骤(2)中培养基中培养物，转入锥形瓶中等体积的半固体培养基，于摇床75rpm，23±1℃，悬浮条件下暗培养5天；(4)采用细滤网滤出步骤(3)培养基中培养物，用滤纸吸干水分，接于固体培养基表面，23±1℃，暗培养25天；获得落叶松幼苗。
CN202010265138.XA 2020-04-07 2020-04-07 一种落叶松体细胞胚再生的方法 Pending CN111280065A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010265138.XA CN111280065A (zh) 2020-04-07 2020-04-07 一种落叶松体细胞胚再生的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010265138.XA CN111280065A (zh) 2020-04-07 2020-04-07 一种落叶松体细胞胚再生的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111280065A true CN111280065A (zh) 2020-06-16

Family

ID=71017930

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010265138.XA Pending CN111280065A (zh) 2020-04-07 2020-04-07 一种落叶松体细胞胚再生的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111280065A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004176A (zh) * 2019-04-12 2019-07-12 东北林业大学 杂种落叶松遗传转化体系的构建方法
CN113115706A (zh) * 2020-01-15 2021-07-16 东北林业大学 一种长白落叶松胚性愈伤组织胚性恢复与保持的方法
CN114788496A (zh) * 2022-04-07 2022-07-26 江苏省中国科学院植物研究所 一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法
CN116138166A (zh) * 2022-12-07 2023-05-23 南京林业大学 一种以合子胚为外植体的落叶松快繁方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101633903A (zh) * 2009-07-30 2010-01-27 齐玉琛 一种同步化调控针叶树体细胞胚发生方法及其培养基
CN105409767A (zh) * 2015-10-23 2016-03-23 东北林业大学 一种提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基及培养方法
CN106893737A (zh) * 2015-12-17 2017-06-27 中国林业科学研究院林业研究所 一种落叶松胚性细胞的遗传转化方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101633903A (zh) * 2009-07-30 2010-01-27 齐玉琛 一种同步化调控针叶树体细胞胚发生方法及其培养基
CN105409767A (zh) * 2015-10-23 2016-03-23 东北林业大学 一种提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基及培养方法
CN106893737A (zh) * 2015-12-17 2017-06-27 中国林业科学研究院林业研究所 一种落叶松胚性细胞的遗传转化方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUE SONG ET AL.,: ""Screening and verification of the factors influencing somatic embryo maturation of Larix olgensis"", 《J. FOR. RES》 *
吕守芳等: ""日本落叶松体细胞胚胎发生的研究"", 《林业科学》 *
宋跃: ""长白落叶松体细胞胚胎发生及遗传转化研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 *
宋跃等: ""落叶松胚性愈伤组织悬浮培养体系的优化"", 《林业科学》 *
宋跃等: ""长白落叶松胚性愈伤组织诱导及体细胞胚胎发生"", 《林业科学》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004176A (zh) * 2019-04-12 2019-07-12 东北林业大学 杂种落叶松遗传转化体系的构建方法
CN110004176B (zh) * 2019-04-12 2023-03-10 东北林业大学 杂种落叶松遗传转化体系的构建方法
CN113115706A (zh) * 2020-01-15 2021-07-16 东北林业大学 一种长白落叶松胚性愈伤组织胚性恢复与保持的方法
CN113115706B (zh) * 2020-01-15 2022-03-15 东北林业大学 一种长白落叶松胚性愈伤组织胚性恢复与保持的方法
CN114788496A (zh) * 2022-04-07 2022-07-26 江苏省中国科学院植物研究所 一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法
CN116138166A (zh) * 2022-12-07 2023-05-23 南京林业大学 一种以合子胚为外植体的落叶松快繁方法
CN116138166B (zh) * 2022-12-07 2024-03-08 南京林业大学 一种以合子胚为外植体的落叶松快繁方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5008200A (en) Propagating multiple whole fertile plants from immature leguminous
CN111280065A (zh) 一种落叶松体细胞胚再生的方法
CN109757373A (zh) 一种荆半夏组织培养快速繁殖方法
CN102550405A (zh) 一种杨树单倍体培育方法
CN112335549A (zh) 一种通过组织离体培养获得落叶松再生植株的方法
Lin et al. Improving multiple shoot proliferation in bamboo mosaic virus-free Bambusa oldhamii Munro propagation by liquid culture
UMAMI et al. Efficient nursery production and multiple-shoot clumps formation from shoot tiller-derived shoot apices of dwarf napiergrass (Pennisetum purpureum Schumach.)
CN112931197A (zh) 一种菠萝组织培养苗的制备方法
CN107439211B (zh) 一种缩短茄子出芽成苗时间的方法
JP3198895B2 (ja) ユーカリプタス・グロブラスのクローン増殖方法
Naz et al. Somatic embryogenesis and planlet formation in different varieties of sugarcane (Saccharum officinarum L.) HSF-243 and HSF-245
Muruganantham et al. Somatic embryo productions by liquid shake culture of embryogenic calluses in Vigna mungo (L.) Hepper
US7598073B2 (en) Methods for producing high yields of zygotic-like cotyledonary pine embryos utilizing media that include a disaccharide and glucose
CN112544444B (zh) 一种用于红花木莲的组培培养基、红花木莲胚性愈伤组织培养的方法及红花木莲快繁的方法
JPH0822195B2 (ja) パナツクス属雑種植物体の組織培養方法
CN114467753B (zh) 一种银鹿枫香的组织培养方法
Efe Callus formation and plant regeneration from two cotton species (Gossypium hirsutum L., and G. barbadense L.)
JPH08224051A (ja) 薬用ニンジン苗の大量増殖方法
Jha et al. Tissue culture of cashewnut
Quintero-Jiménez et al. Revista Mexicana Ciencias Agrícolas volume 11 number 7 September 28-November 11, 2020
Bora et al. Direct organogenesis in Dianthus caryophyllus Linn
JP2967968B2 (ja) シネラリア植物の種苗生産方法
CN115836647A (zh) 一种楸树幼胚无菌诱导植株再生的方法
CN116420620A (zh) 一种通过胚挽救获得水曲柳与白蜡种间杂交f1代的方法
CN113854153A (zh) 一种甘薯快速繁殖的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200616